一种血清胆固醇氧化物的测试方法

摘要

本发明提供一种血清中胆固醇氧化物的测试方法，所述方法包括：样品处理、皂化、固相萃取、HPLC分析。所述方法能够同时对血清中胆固醇体内自氧化的代表性产物分别或同时进行定量检测，具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种检测血清中5α，6α-环氧胆固醇、5β,6β-环氧胆固醇、7-酮基胆固醇、7β-OH胆固醇、7α-OH胆固醇的测试方法，其特征在于包括以下步骤：(1)样品处理：用氯仿-甲醇萃取血清脂类，吸取氯仿层；

(2)皂化：用KOH溶液、无水乙醇、BHT常温震荡皂化，包括：加入重量体积比为60％的KOH溶液、无水乙醇、BHT常温震荡皂化24h，其中KOH溶液和无水乙醇的加入量均为血清体积的

10倍，BHT的终浓度为5-50ng/mL；

(3)固相萃取：皂化后的溶液过SPE固相萃取柱，包括：将皂化后的溶液用乙醚提取3次，再用蒸馏水洗涤2次，无水硫酸钠干燥后30℃旋蒸除去残留的溶剂；加入血清体积5倍的正己烷溶解后，过SPE固相萃取柱，经过体积比为95:5的正己烷：二乙醚、正己烷：体积比为90:

10的二乙醚、体积比为82:20的二乙醚洗涤后，用体积比为60:20的丙酮：甲醇洗脱；

(4)HPLC测试：液相色谱分离柱为腈基结合柱，使用体积比为95：5的正己烷：异丙醇以

1ml/min的流速洗脱，测试器为示差折光测试器。

2.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述步骤(1)样品处理包括：萃取前先向血清中加入定量内标的步骤，所述的定量内标为非体内自氧化产生的胆固醇氧化物种类。

3.如权利要求2所述的测试方法，其特征在于所述定量内标为6-酮基胆固醇。

4.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述步骤(1)包括按1:2的体积比配置氯仿-甲醇混合物，将血清用所述氯仿-甲醇混合液稀释10倍，涡旋震荡1min，静置萃取3min，

4000g离心10min，吸取氯仿层。

5.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于将步骤(3)固相萃取产物氮气吹干后，溶解于体积比为95：5的正己烷：异丙醇中，上样腈基色谱柱，使用体积比为95：5的正己烷：异丙醇以1ml/min的流速洗脱，用示差折光测试器进行分析。

说明书

一种血清胆固醇氧化物的测试方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物标记物分析测试技术领域，具体涉及一种血清中胆固醇氧化物的测试方法。

背景技术

[0002] 胆固醇对维持人体正常的生理功能有重要的意义，但过多胆固醇在体内堆积又会影响人体自身的健康。大量研究已表明：心血管疾病(CVD)的危险因素与氧化应激增加有关。其中，胆固醇氧化产物COPs是机体氧化应激状态的非常特殊的标志物之一。

[0003] 在1966年，Brooks等首次在人动脉粥样硬化组织中测试到有被氧化的胆固醇，26-羟胆固醇与7-酮基胆固醇。不过，人们一直认为动脉粥样硬化的重要风险因子是高胆固醇血症，所以多年来一直把注意力集中在高胆固醇血症上，对氧化型胆固醇并未引起重视少有报道。近年来，随着对低密度脂蛋白(LDL)的深入研究，研究首次发现，心血管最严重的风险因子之一可能是被氧化的胆固醇，即胆固醇氧化物(cholesterol oxidation products)，这类化合物比未经氧化的胆固醇更易导致动脉粥样硬化,增加心脏病和中风发作的风险。胆固醇氧化物在很多方面显示其毒害作用，例如可以增大致癌的可能性，毒害细胞，促使细胞发生突变，使固醇类化合物代谢紊乱，可明显对动脉粥样硬化起作用，危害人体健康。目前，已经有多种食品中的胆固醇氧化物被研究，包括蛋制品、动物脂肪等。科研结果显示出，胆固醇及其氧化产物在某种程度上是心血管疾病的风险因子，不过胆固醇氧化物与心血管疾病发生潜在机制的研究并不明确。

[0004] 胆固醇在体外的光照、加热等环境条件下引起A环、B环或支链的一系列自氧化反应，因而产生多种氧化产物。胆固醇在体内也可以通过自氧化方式产生。理论上，胆固醇氧化物可有70余种，其中一些不是胆固醇体内自氧化的代表性产物，而其他一些胆固醇氧化物是胆固醇体内自氧化的代表性产物，可内源性产生或从饮食中获得。

发明内容

[0005] 针对现有技术中不重视血清中胆固醇氧化物的测试、胆固醇氧化物在提取纯化和分析过程中易降解、无法对体内自氧化产生的胆固醇氧化物进行分类测试、部分胆固醇氧化物处于酯化形式、血清成分复杂干扰多且胆固醇氧化物含量较低难以通过单纯的色谱分离等缺陷，本发明提供一种血清胆固醇氧化物的测试方法。

[0006] 具体而言，本申请提供一种血清胆固醇氧化物的测试方法，其特征在于包括以下步骤：

[0007] (1)样品处理：用氯仿-甲醇萃取血清

[0008] (2)皂化：用KOH溶液、无水乙醇、BHT常温震荡皂化；

[0009] (3)固相萃取：皂化后的溶液过SPE固相萃取柱；

[0010] (4)HPLC测试：液相色谱分离柱为腈基结合柱，测试器为示差折光测试器。

[0011] 本发明所述血清胆固醇氧化物的测试方法，其特征在于所述步骤(1)样品处理包括：萃取前先向血清中加入定量内标的步骤，所述的定量内标为非体内自氧化产生的胆固醇氧化物种类，例如6-酮基胆固醇等。

[0012] 本发明所述血清胆固醇氧化物的测试方法，其特征在于所述步骤(1)包括按1:2的体积比配置氯仿-甲醇混合物，将血清用所述氯仿-甲醇混合液稀释10倍，涡旋震荡1min，静置萃取3min，4000g离心10min，吸取氯仿层。

[0013] 本发明所述血清胆固醇氧化物的测试方法，其特征在于所述步骤(2)皂化包括：加入60％(w/v)的KOH溶液、无水乙醇、BHT常温震荡皂化24h，其中KOH溶液和无水乙醇的加入量均为血清体积的10倍，BHT的终浓度为5-50ng/mL。

[0014] 本发明所述血清胆固醇氧化物的测试方法，其特征在于所述步骤(3)固相萃取包括：将皂化后的溶液用乙醚提取3次，再用蒸馏水洗涤2次，无水硫酸钠干燥后30℃旋蒸除去残留的乙醚；加入血清体积5倍的正己烷溶解后，过SPE固相萃取柱，经过正己烷：二乙醚(95:5，v/v)、正己烷：二乙醚(90:10，v/v)、正己烷：二乙醚(80:20，v/v)洗涤后，用丙酮：甲醇(60:20v/v)洗脱，洗脱产物氮气吹干后，溶解于正己烷：丙酮(95：5，v/v)中。

[0015] 本发明所述血清胆固醇氧化物的测试方法，其特征在于所述步骤(5)包括：使用正己烷：丙酮(95：5，v/v)的溶液以1.0ml/min的流速洗脱。

[0016] 本发明所述血清胆固醇氧化物的测试方法，其特征在于所述血清胆固醇氧化物选自由7α-OH胆固醇、7β-OH胆固醇、5β,6β-环氧胆固醇、5α，6α-环氧胆固醇、7酮基胆固醇、25-OH胆固醇组成的一组组分群。

[0017] 本发明所述测试方法达到的有益效果如下：

[0018] (1)通过样品处理、皂化、固相萃取、衍生化，分离出血清中胆固醇类组分，使其适应后续腈基色谱柱进行HPLC测试，避免了血清中复杂成分的干扰、提高了测试精度。

[0019] (2)通过加入血清中不存在的胆固醇氧化物作为定量内标，其与体内胆固醇氧化物理化性状、化学结构相似，在各处理步骤中的损失相似，以其作为内标能够获得所述体外处理步骤中损失的胆固醇氧化物比例，从而对测得的胆固醇氧化物含量进行校对，提高血清胆固醇氧化物定量的准确度。

[0020] (3)本发明通过对液相色谱柱、测试器、液相参数的选择优化，通过HPLC即能够同时对血清中胆固醇体内自氧化的代表性产物，7α-OH胆固醇、7β-OH胆固醇、5β,6β-环氧胆固醇、5α，6α-环氧胆固醇、7-酮基胆固醇分别进行分离并定量测试；给出了各种胆固醇氧化物的驻留时间。

附图说明

[0021] 图1实施例测试的胆固醇及其氧化物HPLC图谱。图1中标号：1：胆固醇、2：5α，6α-环氧胆固醇、3：5β,6β-环氧胆固醇、4：7-酮基胆固醇、5：7β-OH胆固醇、6：7α-OH胆固醇、7：6-酮基胆固醇。横坐标min，纵坐标mV。

[0022] 图2对比例测试的胆固醇及其氧化物HPLC图谱。图2中标号：1：7α-OH/7β-OH胆固醇，2:7-酮基胆固醇，3：6-酮基胆固醇，4：胆固醇。横坐标min，纵坐标AUFS。

具体实施方式

[0023] 实施例1：胆固醇氧化物的提取

[0024] 1.取血库中正常个体，待检血清1mL，向其中加入6-酮基胆固醇至终浓度10μg/mL，加入10mL氯仿-甲醇混合物(氯仿：甲醇＝1:2，v/v)。涡旋震荡1min，室温静置萃取3min，4000g离心10min，吸取氯仿层。

[0025] 2.加入10mL 60％(w/v)的KOH溶液、10mL无水乙醇、0.5μg BHT，室温震荡24h，使血清中的油脂组分皂化，同时防止胆固醇氧化。

[0026] 3.将未皂化有机相用乙醚提取3次，再用蒸馏水洗涤2次，无水硫酸钠干燥后30℃旋蒸除去残留的溶剂。用5mL正己烷溶解，过SPE固相萃取柱，经过正己烷：二乙醚(95:5，v/v)、正己烷：二乙醚(90:10，v/v)、二乙醚(80:20，v/v)洗涤后，用丙酮：甲醇(60:20v/v)洗脱。

[0027] 实施例2：HPLC分析

[0028] 将实施例1中的洗脱产物氮气吹干后，溶解于正己烷：异丙醇(95：5，v/v)中。液相分离柱采用腈基色谱柱(CN柱，25cm×4.6cm)，测试器使用示差折光测试器，以正己烷：异丙醇(95：5，v/v)为洗脱液，流速为1ml/min。根据7α-OH胆固醇、7β-OH胆固醇、7-酮基胆固醇、5β,6β-环氧胆固醇、α，6α-环氧胆固醇、6-酮基OH胆固醇标准品在上述条件下的HPLC图，确定各种胆固醇氧化物标准品的出峰时间表1：

[0029] 表1：胆固醇氧化物标准品特征峰时间

[0030]

[0031] 血清提取物HPLC图谱如图1所示，测定其峰面积。根据6-酮基胆固醇的添加量进行校对后获得血清中各种胆固醇氧化物含量如表2。

[0032] 表2：血清中各种胆固醇氧化物含量如下：

[0033]编号 胆固醇氧化物 ng/mL血清
2 5α，6α-环氧胆固醇 7.1
3 5β,6β-环氧胆固醇 18.3
4 7-酮基胆固醇 9.7
5 7β-OH胆固醇 20.6
6 7α-OH胆固醇 4.5
7 6-酮基胆固醇 10.0

[0034] 对比例：

[0035] 将实施例1中的洗脱产物氮气吹干后，溶解于丙醇中。液相分离柱使用C18柱(25cm×4.6cm)，测试器使用212nm UV测试器。洗脱液使用乙腈：甲醇(55：45，v/v)；0-25min流速为0.5ml/min，25-35min流速为3.0ml/min。

[0036] 如图2所示，对比例分离效果不佳，经与标准品特征峰相对比，对比例仅能测试到7α/7β-OH胆固醇峰(二者无法区分)、7-酮基胆固醇峰，以及标记物6-酮基胆固醇峰；未能测试到5β,6β-环氧胆、5α，6α-环氧胆固醇的特征峰。

[0037] 应当理解，上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。