一种无酶病原体比色分析检测传感器

摘要

本发明公开了一种病原体比色分析传感器。该二氧化锰纳米粒子表面利用氨基化的聚乙二醇进行修饰来改善水溶性并且表面利用EV71二抗进行标记。本发明中使用的纳米银是4‑邻巯基苯甲酸和三聚氰胺共同修饰，并且该纳米银在锰离子存在下有着明显的螯合反应。在96‑微孔板上进行EV71一抗的修饰，通过层层免疫反应将纳米二氧化锰进行捕获。捕获的纳米二氧化锰可以被维生素C还原同时锰离子释放，从而引起纳米银的团聚，达到EV71病原体高灵敏测试。本发明中使用的纳米二氧化锰可以明显的降低测定检测线，另外该传感器还有制备简单价格便宜以及检测迅速的优点。

权利要求

1.一种病原体比色分析检测传感器，其特征在于，包括以下部分：功能化修饰的二氧化锰纳米材料，该二氧化锰纳米材料上连接有检测抗体，和可以还原二氧化锰的还原剂，及银纳米颗粒溶液。

2.如权利要求1所述的一种病原体比色分析检测传感器，其特征在于，功能化修饰的二氧化锰纳米材料，在溶液中的浓度范围为0.01-20mg/mL；

该二氧化锰纳米材料连接的检测抗体，其浓度范围为1-1000μg/mL；

还原剂的浓度范围为0.1-100mM；

银纳米颗粒溶液的浓度范围为0.001-1mM。

3.如权利要求1所述的一种病原体比色分析检测传感器，其特征在于，所述的功能化修饰，为聚乙二醇修饰。

4.如权利要求1所述的一种病原体比色分析检测传感器，其特征在于，所述的银纳米粒子包括银纳米粒子或者银壳修饰的金纳米粒子中的至少一种。

5.如权利要求1所述的一种病原体比色分析检测传感器，其特征在于，所述的银纳米粒子表面利用酪氨酸、4-邻巯基苯甲酸、三聚氰胺或者4-邻巯基苯甲酸和三聚氰胺中的至少一种进行修饰。

6.如权利要求1所述的一种病原体比色分析检测传感器，其特征在于，功能化修饰的二氧化锰纳米材料，在溶液中的浓度范围为0.1-2mg/mL。

7.如权利要求1所述的一种病原体比色分析检测传感器，其特征在于，该二氧化锰纳米材料连接的检测抗体，其浓度范围为20-100μg/mL。

8.如权利要求1所述的一种病原体比色分析检测传感器，其特征在于，还原剂的浓度范围为1-10mM。

9.如权利要求1所述的一种病原体比色分析检测传感器，其特征在于，银纳米颗粒溶液的浓度范围为0.01-0.1mM。

10.如权利要求1所述的一种病原体比色分析检测传感器的制备方法，包括以下步骤：

1)制取二氧化锰纳米花纳米材料；

2)将所得二氧化锰纳米花纳米材料与内消旋-2,3-二巯基丁二酸(DMSA)反应，从而在 二氧化锰纳米花表面修饰上羧基基团；

3)制取PEG修饰的二氧化锰纳米花；

4)病原体抗体连接到PEG修饰的二氧化锰纳米花中；

5)AgNPs组装上4-邻巯基苯甲酸4-MBA和三聚氰胺MA。

说明书

一种无酶病原体比色分析检测传感器

技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用纳米二氧化锰和纳米银颗粒构建的病原体检测传感器，属于生物检测领域。

背景技术

[0002] 如何实现病原体的快速的灵敏的检测仍然是科研人员不断追求的目标。近几十年来，科研人员发展了大量用于病原体检测的方法，包括聚合酶链反应(PCR)、DNA传感器、比色分析法和质谱分析法。在这些方法中，当目标检测物出现时，基于肉眼直接观测颜色变化的简便直接的可视化分析方法得到了广泛和持续性的关注。目前在临床的检测中最广泛应用的是基于酶联免疫吸附测定法(ELISA)所设计的比色分析检测。但是基于ELISA的测定却存在着很多的问题，中等程度的敏感性使得测定物必须达到临界阈值浓度才能够进行检测，这就限制了其在病原体的早期检测上的应用。另外，ELISA测定方法局限于天然酶的应用范围存在着严重的缺陷，例如，天然酶较难大批量生产，在某些环境如强酸、基础培养基中和高温下不稳定，易分解。

[0003] 近年来，各种以多功能重金属为材料设计合成的高选择性和灵敏性的比色分析试剂盒逐渐发展起来，尤其的金、银纳米粒子。银纳米粒子(AgNPs)的表面等离子共振(SPR)特性、良好的稳定性和分散性、化学惰性和在不同聚合程度呈现颜色变化等的性质使得其适合用于比色分析检测。另外，AgNPs具有较高的消光系数和较低的成本、所需的样品也更少。因此，检测细菌毒素及其他生物分子所运用的AgNPs基比色分析试剂盒得到发展。然而，这种聚合形式的比色免疫试剂的灵敏性还是较低，缺乏信号放大的过程。因此提高基于金属材料的比色分析试剂盒的灵敏性迫在眉睫。

发明内容

[0004] 本发明的首要目的在于提供一种功能化的纳米二氧化锰联合纳米银探针；

[0005] 本发明的另一目的在于提供一种功能化的纳米二氧化锰联合纳米银探针的制备方法；

[0006] 本发明的再一目的是提供一种利用所述的纳米二氧化锰联合纳米银探针作为疾病标识物检测系统的应用。

[0007] 本发明的目的可以通过如下技术方案实现：

[0008] 一种功能化的纳米二氧化锰联合纳米银探针，其特征为，包括以下三部分：含有检测抗体及具有功能化修饰的二氧化锰纳米材料，和可以还原二氧化锰的还原剂，及银纳米颗粒溶液。

[0009] 其中，所述的二氧化锰纳米材料可以包括二氧化锰纳米粒子、二氧化锰纳米片、二氧化锰纳米花。本文中优选二氧化锰纳米花。

[0010] 其中，所述的银纳米颗粒可以包括银纳米粒子、银纳米线、银纳米片或者介孔银纳米颗粒中的至少一种。

[0011] 其中所述的银纳米颗粒的修饰包括酪氨酸、4-邻巯基苯甲酸、三聚氰胺或者4-邻巯基苯甲酸(4-MBA)和三聚氰胺(MA)共同修饰，本文中优选4-邻巯基苯甲酸和三聚氰胺共同修饰。

[0012] 其中，所述的抗体为一种或多种检测抗体，其根据检测靶标物质而定。本发明选择了EV71单克隆抗体。

[0013] 其中，所述的还原剂，包括谷胱甘肽、柠檬酸钠、草酸或者维生素C，本文中优选维生素C。

[0014] 其中，所述二氧化锰纳米材料的功能化修饰，优选为聚乙二醇修饰。

[0015] 其中，作为优选，功能化修饰的二氧化锰纳米材料，在溶液中的浓度范围为0.01-20mg/mL；

[0016] 该二氧化锰纳米材料连接的检测抗体，其浓度范围为1-1000μg/mL；

[0017] 还原剂的浓度范围为0.1-100mM；

[0018] 银纳米颗粒溶液的浓度范围为0.001-1mM。

[0019] 其中，进一步优选，功能化修饰的二氧化锰纳米材料，在溶液中的浓度范围为0.1-2mg/mL。

[0020] 其中，进一步优选，该二氧化锰纳米材料连接的检测抗体，其浓度范围为20-100μg/mL。

[0021] 进一步优选，还原剂的浓度范围为1-10mM。

[0022] 进一步优选，银纳米颗粒溶液的浓度范围为0.01-0.1mM。

[0023] 功能化的二氧化锰联合银纳米颗粒探针的制备方法，包括以下步骤：

[0024] 1)将250mg高锰酸钾(KMnO4)加入到125mL水中搅拌30min，得到均一的分散溶液。加大搅拌力度下，加入2.5mL油酸得到稳定的乳液。将乳液在室温下进一步搅拌24h后变为棕黑色。接着，使用乙醇将所得棕黑色溶液离心清洗以便去除残余反应物。最终将其冻干得干燥的二氧化锰纳米花棕黑色固体。

[0025] 2)将所得二氧化锰纳米花纳米材料与内消旋-2,3-二巯基丁二酸(DMSA)反应，从而在二氧化锰纳米花表面修饰上羧基基团。具体而言，取100mg二氧化锰纳米花分散于10mL甲苯，后将分散有200mg DMSA和200mg碳酸氢钠(NaHCO3)的100mL丙酮加入其中。将上述所得混合溶液置于80℃油浴中回流反应6h。最后将所得羧基化二氧化锰纳米花用丙酮离心清洗三次，然后冻干。

[0026] 3)取1mL羧基化二氧化锰纳米花溶液(1mg/mL)，在其中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC,20mg/mL)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,10mg/mL)混合溶液，并且反应30min。通过离心将多余的试剂去除。二氧化锰纳米花重悬后，将0.5mL氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2,1mg/mL)加入其中，再次反应30min以后离心清洗；

[0027] 4)在2mg PEG修饰的二氧化锰纳米花中加入1mL新鲜配制的EDC/NHS溶液(EDC 20mg/mL,NHS 10mg/mL)和2mL EV71二抗溶液(20μg/mL,pH 7.4)。将所得混合液振荡10min后，将其转移至4℃冰箱，静置2h。接着借助离心的办法，使用PBS(pH 7.4)清除其多余的EDC/NHS和二抗。并且取2mL牛血清白蛋白(BSA，1％)与上述所得混合溶液中，置于4℃冰箱孵育2h。去除剩余BSA后，将最终所得的二抗标记的二氧化锰纳米花分散于2mL PBS(pH 
7.4)中，最终保存在4℃中备用。

[0028] 5)在大力搅拌下，将10mg硼氢化钠(NaBH4)快速加入到100mL硝酸银(AgNO3，10-4M)溶液中，溶液即刻变为淡黄色，反应10min后既得亮黄色溶液。接着，在所得亮黄色溶液中加入2mL 4-MBA(10-4M)和4mL MA(10-4M)，继续搅拌30min，AgNPs则组装上4-MBA和MA。

[0029] 本发明研制出一种功能化的纳米二氧化锰联合纳米银探针及其制备方法。该探针主要有两部分构成：其一就是功能化的二氧化锰纳米颗粒，其特征是具有很好的水溶液稳定性以及快速的被还原剂还原为Mn2+；其二为银纳米颗粒溶液，特点是能够在Mn2+存在的情况下引起团聚反应。病原体二抗修饰的二氧化锰纳米颗粒再层层免疫反应后被捕获在96-2+
微孔板上，加入还原剂以后Mn 并且引起银纳米颗粒的团聚反应，从而导致金纳米颗粒溶液的吸光值的变化。吸光值的变化与加入的病原体的浓度呈现一定的比例关系，从而达成病原体的测定。

[0030] 本发明的有益效果：

[0031] 本发明中利用纳米二氧化锰粒子进行二抗的标记，通过还原剂的作用可以释放出大量的Mn2+，相对应与单独信号测定，该种方法具有快速的实验信号方法的作用。这也使得改传感器能够具有较高的灵敏度、较低检测线。

[0032] 另外，本发明中也可以利用肉眼对纳米银颗粒溶液的颜色变化进行观察，也能为病原体的含量进行初步的研究。

附图说明

[0033] 图1为二氧化锰纳米花对二抗的修饰(A)，基于二氧化锰纳米花和4-MBA/MA共同修饰银纳米粒子的病原体传感器的检测原理图(B)。

[0034] 图2(A)4-MBA/MA共同修饰银纳米粒子在Mn2+存在下的电镜图，插图：4-MBA/MA共同修饰银纳米粒子的电镜图；(B)4-MBA/MA共同修饰银纳米粒子在Mn2+存在(b)和不存在(a)情况下的粒度分析；(C)4-MBA/MA共同修饰银纳米粒子在不同Mn2+(0,5,10,50,100nM)存在下的吸收变化；(D)4-MBA/MA共同修饰银纳米粒子不同波长吸光度比率(A408nm/A550n)和Mn2+的线性关系。

[0035] 图3(A)二氧化锰纳米花的电镜图；(B)氨基化聚乙二醇修饰的二氧化锰纳米花电镜图；(C)放大了的氨基化聚乙二醇修饰的二氧化锰纳米花电镜图；(D)氨基化聚乙二醇修饰的二氧化锰纳米的粒度分析。

[0036] 图4为利用构建的传感器中吸收随着病原体EV71不同浓度(1,2,5,20,50,100x 103particles/mL)的变化(A)，不同波长吸光度比率(A408nm/A550nm)和EV71不同浓度的变化(B)。

具体实施方式

[0037] 以下通过具体的制备例和实施例可使本发明得到更清楚地说明：

[0038] 实施例1

[0039] 1)将250mg KMnO4加入到125mL水中搅拌30min，得到均一的分散溶液。加大搅拌力度下，加入2.5mL油酸得到稳定的乳液。将乳液在室温下进一步搅拌24h后变为棕黑色。接着，使用乙醇将所得棕黑色溶液离心清洗以便去除残余反应物。最终将其冻干得干燥的二氧化锰纳米花棕黑色固体。

[0040] 2)将所得二氧化锰纳米花纳米材料与DMSA反应，从而在二氧化锰纳米花表面修饰上羧基基团。具体的来说，取100mg二氧化锰纳米花分散于10mL甲苯，后将分散有200mg DMSA和200mg NaHCO3的100mL丙酮加入其中。将上述所得混合溶液置于80℃油浴中回流反应6h。最后将所得羧基化二氧化锰纳米花用丙酮离心清洗三次，然后冻干。

[0041] 3)取1mL羧基化二氧化锰纳米花溶液(1mg/mL)，在其中加入1mL新鲜配制的EDC/NHS溶液(EDC 20mg/mL,NHS 10mg/mL)，并且反应30min。通过离心将多余的试剂去除。二氧化锰纳米花重悬后，将0.5mL NH2-PEG-NH2(1mg/mL)加入其中，再次反应30min以后离心清洗；

[0042] 4)如图1A所示，在2mg PEG修饰的二氧化锰纳米花中加入1mL新鲜配制的EDC/NHS溶液(EDC 20mg/mL,NHS 10mg/mL)和2mL EV71二抗溶液(20μg/mL,pH 7.4)。将所得混合液振荡10min后，将其转移至4℃冰箱，静置2h。接着借助离心的办法，使用PBS(pH 7.4)清除其多余的EDC/NHS和二抗。并且取2mL牛血清白蛋白(BSA，1％)与上述所得混合溶液中，置于4℃冰箱孵育2h。去除剩余BSA后，将最终所得的二抗标记的二氧化锰纳米花分散于2mL PBS(pH 7.4)中，最终保存在4℃中备用。

[0043] 5)在大力搅拌下，将10mg NaBH4快速加入到100mL AgNO3(10-4M)溶液中，溶液即刻-变为淡黄色，反应10min后既得亮黄色溶液。接着，在所得亮黄色溶液中加入2mL 4-MBA(10
4M)和4mL MA(10-4M)，继续搅拌30min，AgNPs则组装上4-MBA和MA。

[0044] 实施例2

[0045] 6)如图1B所示在96-微孔板中加入散于碳酸盐缓冲液(100mM,pH 9.6)的EV71病原体一抗(4μg/mL)，并且在4℃环境中孵育过夜。然后利用PBS清洗三次去除多余的抗体。在各微孔中加入1％BSA PBS溶液进行封闭。最后用PBS清洗后，4℃保存待用。

[0046] 7)接着在每个孔中加入不同浓度的EV71病原体，并且置于37℃中孵育1h,后用PBS清洗3遍。

[0047] 8)然后加入100μL的二抗标记的二氧化锰纳米花，进一步37℃中孵育1h，利用PBS清洗3遍去除多余的二氧化锰纳米花。

[0048] 9)然后加入100μL Vc溶液到微孔中。在反应5min后，加入100μL 4-MBA/MA共同修饰银纳米粒子再次反应5min。最后，测量溶液在408nm和550nm的吸收值。

[0049] 1、制备的4-MBA/MA共同修饰银纳米粒子为分布均匀的纳米球(图2A插图)，并且在Mn2+存在下能够引起团聚反应(图2A)。通过粒度分析可以看出来在Mn2+存在下4-MBA/MA共同修饰银纳米粒子的粒度发生了明显的变化(图2B)。随着Mn2+加入量的不同，混合溶液亮黄色逐渐变为淡粉色，最终消失。并且吸收值发生了明显的变化(图2C)，两处峰吸收值的比(A408nm/A550nm)也随着Mn2+加入量的增加呈现线性递减的趋势(图2D)。

[0050] 2、制备的二氧化锰纳米花的结构通过电镜图确认(图3A)。在修饰了聚乙二醇后，二氧化锰纳米花仍然是纳米花结构(图3B和图3C)。这种结构也为了快速的被还原剂还原提供了条件。聚乙二醇修饰的二氧化锰纳米花的平均粒径约为138nm(图3D)。

[0051] 3、随着加入EV71病原体量的不同，测定溶液的吸收发生着变化(图4A)。另外，吸收曲线两吸收峰的比值A550nm/A408nm随着EV71病原体浓度的减少而降低，且其浓度在～103–2x 104particles/mL范围内呈线性相关。检测线比传统的ELISA试剂盒明显降低，充分说明了本实验中于所设计的比色免疫分析传感器优越的灵敏性。

[0052] 本发明，我们引入了一种无酶比色分析传感器，其基于4-MBA/MA共同修饰银纳米粒子的设计展示了对病原体检测上优越的灵敏性。此外，我们合成的标记材料聚乙二醇修饰的纳米二氧化锰颗粒在PBS展现出良好的稳定性，Mn2+可通过简单的Vc还原反应从中释放出。检测过程产生的离子螯合产物的量可简单的利用肉眼或者UV-vis检测器定性或定量的判定出。与传统的酶联免疫比色分析法相比，本方法具有更快速、更灵敏和更加简便的优势。