TATk-CDKL5融合蛋白、其组合物、配制品以及用途

摘要

在此披露含有TATk-CDKL5融合蛋白的组合物和配制品。还披露由含有TATk-CDKL5 cDNA的载体产生TATk-CDKL5融合蛋白的方法以及使用含有TATk-CDKL5 cDNA的这些载体和该TATk-CDKL5融合蛋白转导细胞的方法。

权利要求

1.一种融合蛋白，包含：

CDKL5多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约50％至

100％的序列一致性；以及

TATk多肽序列，其中该TATk多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATk多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，进一步包含Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，进一步包含报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，进一步包含蛋白标签多肽，其中该蛋白标签多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中该融合蛋白具有根据SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:

10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。

6.如权利要求1所述的融合蛋白，其中与对照相比，该融合蛋白增加受试者脑中的神经突生长、神经突延长、神经突分支数目或神经突分支密度。

7.如权利要求1所述的融合蛋白，其中与对照相比，该融合蛋白减少该受试者脑中的神经元凋亡。

8.一种药物配制品，包含：

治疗有效量的融合蛋白，该融合蛋白包含：

CDKL5多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约50％至

100％的序列一致性；以及

TATk多肽序列，其中该TATk多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATk多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上；以及药学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述的药物配制品，其中该融合蛋白进一步包含Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。

10.如权利要求8所述的药物配制品，其中该融合蛋白进一步包含报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。

11.如权利要求8所述的药物配制品，其中该融合蛋白进一步包含蛋白标签多肽，其中该蛋白标签多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。

12.如权利要求8所述的药物配制品，其中该融合蛋白具有根据SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。

13.如权利要求8所述的药物配制品，其中与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白治疗受试者的CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体中的一种或多种症状。

14.如权利要求8所述的药物配制品，其中与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白增加受试者脑中的神经突生长、神经突延长、神经突分支数目或神经突分支密度。

15.如权利要求8所述的药物配制品，其中与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白减少该受试者脑中的神经元凋亡。

16.如权利要求8所述的药物配制品，其中与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白改善受试者的运动功能。

17.如权利要求8所述的药物配制品，其中与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白改善受试者的认知功能。

18.一种方法，包括：

向有需要的受试者给予治疗有效量的药物配制品，该药物配制品包含：一定量的融合蛋白，该融合蛋白包含：

CDKL5多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约50％至

100％的序列一致性；以及

TATk多肽序列，其中该TATk多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATk多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上；以及药学上可接受的载体。

19.如权利要求18所述的方法，其中该有需要的受试者患有或疑似患有CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体。

20.如权利要求18所述的方法，其中与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白治疗受试者的CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体中的一种或多种症状。

说明书

TATk-CDKL5融合蛋白、其组合物、配制品以及用途

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求于2014年2月28日提交的具有标题“TATk-CDKL5融合蛋白、组合物、配制品以及它们的制备方法和使用方法(TATk-CDKL5FUSION PROTEINS,COMPOSITIONS,FORMULATIONS,AND THEIR METHODS OF MAKING AND METHODS OF USING)”的美国临时专利申请序列号61/946,280的权益，该临时专利申请的披露内容以其整体结合在此。

[0003] 一个或多个序列表

[0004] 本申请含有作为ASCII.txt文件以电子形式提交的序列表，该ASCII.txt文件题为02158765.txt，创建于2015年2月27日，并且具有84,059字节的大小。该序列表的内容以其整体结合在此。

[0005] 背景

[0006] 细胞周期蛋白依赖激酶样5(CDKL5)突变/缺陷(也已知为非典型Rett综合征)是一种衰竭性出生后神经系统病症，该病症在世界范围内每出生17000至38000名女性出现1例。男性也以较低发病率受到影响。此病症不限于人种或种族起源。CDKL5突变/缺陷的症状在从轻微到严重的范围内，并且以早期癫痫发作、认知失能、张力减退以及自调、睡眠和胃肠紊乱存在。疾病的症状由功能性CDKL5蛋白的缺陷引起。

[0007] 个体中伴X染色体的CDKL5基因中的突变或CDKL5蛋白中的缺陷与非典型或先天性Rett综合征的发展有牵连。参见，贝尔塔尼(Bertani)等人，生物化学杂志(J.biol.Chem.)2006,281:32048-320 56，斯卡拉(Scala)等人，医学基因学杂志(J.Med.Gen.)，2005.42:
103-107，以及考朔伊尔(Kalscheuer)等人，美国人类遗传学杂志(Am.J.Hum.Genet.)
2003.72:1401-1411。CDKL5基因位于X染色体上并且编码为正常的脑发育和功能所必需的蛋白质。CDKL5蛋白是在神经元细胞中具有多效性的多功能蛋白质。例如，CDKL5可以充当激酶并且使MeCP2磷酸化。被CDKL5突变或缺陷影响的女生典型地具有以下特征：正常的出生前史；在围产期易激惹和困倦；早发癫痫，其在5月龄之前发病；Rett样特征，包括头生长减速、刻板症、较差至丧失的自主手使用、和睡眠紊乱，及伴有眼神交流差的严重性精神发育迟缓，以及语言几乎丧失。参见巴希-比伊松(Bahi-Buisson)和比安弗尼(Bienvenu)，2012.分子合成学(Mol.Syndromol.)2:137-152。

[0008] 对于CDKL5突变/缺陷的当前治疗主要集中于处理症状上。然而，目前不存在改善具有CDKL5突变或缺陷的受试者的神经结果的治疗。因此，存在开发用于治疗CDKL5突变和缺陷的疗法的需要。

[0009] 概述

[0010] 在此描述了具有CDKL5多肽序列和TATk多肽序列的融合蛋白，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约50％至100％的序列一致性，其中该TATk多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATk多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在一些方面中，该融合蛋白可以含有Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在另外方面中，该融合蛋白可以含有报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在其他方面中，该融合蛋白可以含有蛋白标签多肽，其中该蛋白标签多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在一些方面中，与对照相比，这些融合蛋白可以增加受试者脑中的神经突生长、神经突延长、神经突分支数目或神经突分支密度。在其他方面中，与对照相比，这些融合蛋白可以减少受试者脑中的神经元凋亡。在一些方面中，该融合蛋白可以具有根据SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。

[0011] 在此还提供了含有治疗有效量的融合蛋白和药学上可接受的载体的药物配制品，该融合蛋白具有CDKL5多肽序列和TATk多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约50％至100％的序列一致性，其中该TATk多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATk多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在一些方面中，包含在这些药物配制品中的该融合蛋白可以含有Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在一些方面中，包含在这些药物配制品中的该融合蛋白可以含有报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在另外方面中，包含在这些药物配制品中的该融合蛋白可以具有根据SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。在另外方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以治疗受试者的CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体中的一种或多种症状。在另外的方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以增加受试者脑中的神经突生长、神经突延长、神经突分支数目或神经突分支密度。在其他方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以减少受试者脑中的神经元凋亡。在另外的方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以改善受试者的运动功能。在另外的方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以改善受试者的认知功能。

[0012] 在此提供了向有需要的受试者给予治疗有效量的药物配制品的方法，该药物配制品含有一定量的融合蛋白和药学上可接受的载体，其中该融合蛋白含有CDKL5多肽序列和TATk多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约50％至100％的序列一致性，其中该TATk多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATk多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在一些方面中，该有需要的受试者患有或疑似患有CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体。在给予治疗有效量的药物配制品的该方法的其他方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以治疗受试者的CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体中的一种或多种症状。

[0013] 附图简述

[0014] 图1示出了产生CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例，其中该CDKL5融合蛋白由培养的细胞产生并且被分泌到周围培养基中。

[0015] 图2示出了产生CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例，其中该CDKL5融合蛋白未被分泌到周围的细胞培养基中。

[0016] 图3示出了经由自体细胞递送CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例。

[0017] 图4A和图4B展示了来自转染的HEK293T细胞中的TATk-CDKL5蛋白表达的蛋白质印迹分析结果。用GFP蛋白标记TATk-CDKL5融合蛋白以允许使用抗-GFP抗体进行蛋白质印迹分析。图4A展示了来自转染的HEK293T细胞的细胞提取物中的TATk-GFP-CDKL5融合蛋白表达。图4B展示了来自TATk-GFP-CDKL5转染的HEK293T细胞的由20X浓缩细胞培养基进行的TATk-GFP-CDKL5融合蛋白纯化。

[0018] 图5A和图5B展示了来自激酶活性测定的结果(图5A)，证明了TAT-GFP-CDKL5融合蛋白保留了CDKL5自身磷酸化活性。

[0019] 图6示出了孵育时间对HEK 293T细胞中的TATk-GFP-CDKL5融合蛋白的一个实施例的转导效率的影响。

[0020] 图7A和图7B示出了TATk-GFP-CDKL5处理的HEK 293T细胞中的CDKL5的定位(图7B)。图7A和图7B展示了与对照(图7A)(左图)相比用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白对HEK 293T细胞转导的效率。使用抗-GFP抗体进行免疫检测并且用DAPI复染细胞。白色箭头指示转导的HEK 293T细胞。

[0021] 图8是展示了来自共聚焦显微镜的一系列的12张图像(1-12)的图像，展示出用纯化的TATk-GFP-CDKL5蛋白处理30分钟的进入SH-SY5Y细胞中的TATk-GFP-CDKL5转导。Z堆栈大小是0.4μm。图8展示了用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白对SH-SY5Y细胞转导的效率。

[0022] 图9A和图9B展示了成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中的转导的CDKL5对细胞增殖的影响。与TATk-GFP(对照)处理的细胞(图9A)相比，观察到TATk-GFP-CDKL5处理的细胞(图9B)具有减少的增殖。白色箭头指示有丝分裂的细胞核。

[0023] 图10示出了展示用TATk-GFP或TATk-GFP-CDKL5融合蛋白处理的SH-SY5Y细胞的有丝分裂指数的图。y-轴示出了有丝分裂细胞/总细胞并且以百分比表达。数据示出为平均值±S.E。***P<0.001(t检验)。

[0024] 图11A-11B是展示了TATk-GFP处理的(对照)SH-SY5Y细胞(图11A)和TATk-GFP-CDKL5处理的SH-SY5Y细胞(图11B)的代表性相衬图像的图像。与对照细胞相比，观察到TATk-GFP-CDKL5处理的SH-SY5Y细胞中的神经突生长更大。

[0025] 图12示出了展示出用TATk-GFP融合蛋白(对照)或TATk-GFP-CDKL5处理的SH-SY5Y细胞的神经突增生的定量的图。数据示出为平均值±S.E。*P<0.05(t检验)。y-轴以微米示出了神经突(neuritic)长度/细胞。

[0026] 图13A-13B示出了展示出如通过野生型(图13A)和CDKL5敲除(KO)小鼠(图13B)中的双皮质素(doubleocortin)(DCX)的免疫组织化学所示的新生海马颗粒细胞的树突形态和数目的图像。比例尺＝50μm。缩写：GR，颗粒层；H，门。

[0027] 图14A-14B示出了分化的神经元前体细胞(NPC)的双荧光图像，展示出与野生型(+/+)(图14B)神经元培养物相比，来源于CDKL5敲除小鼠(-/-)(图14A)的神经元培养物中的新神经元(红色细胞)的产生和成熟减少。具有神经元表型的细胞对β-微管蛋白III(红色)具有免疫阳性，并且具有星形细胞表型的细胞对GFAP(绿色)具有免疫阳性。使用Hoechst染料(蓝色)对细胞核进行染色。比例尺＝25μm。

[0028] 图15A-15C示出了来自用TATk-GFP(图15B)或TATk-GFP-CDKL5(图15C)转导的CDKL5敲除小鼠的神经元前体培养物(图15B和15C)，以及来自野生型小鼠的神经元前体培养物(图15A)的代表性图像。比例尺＝20μm。

[0029] 图16示出了展示出来自野生型和用TATk-GFP或TATk-GFP-CDKL5处理的CDKL5KO小鼠的神经元前体培养物中的如通过分化的神经元(对β-微管蛋白III呈阳性的神经元)的总神经突长度所测量的对神经成熟的定量的图。值表示平均值±SE。与野生型情况相比，**p<0.01；与未处理的KO样品相比，#p<0.01(ANOVA之后进行邦弗伦尼(Bonferroni)检验)。

[0030] 图17A-17F示出了展示出用浓缩培养基(媒介物)(图17A和图17D)、TATk-GFP(图17B和图17E)以及TATk-GFP-CDKL5(图17C和图17F)全身性处理(单一注射)的小鼠(出生后第7天)脑中的CDKL5的免疫检测的图像。图17D-17F分别示出了图17A-17C中的虚线框的放大图。通过使用抗-GFP抗体(红色)的免疫组织化学来评价脑中的TATk-GFP-CDKL5和TATk-GFP的定位。图像在感觉运动皮层的水平处获取。比例尺＝60μm(较低的放大倍数)和20μm(较高的放大倍数)。

[0031] 图18A-18D示出了展示出用培养基(媒介物)(图18A和图18B)和TATk-GFP-CDKL5(图18C和图18D)如图17A-17F那样全身性处理的小鼠(出生后第7天)脑中的CDKL5的免疫检测的小脑切片的图像。通过使用抗-GFP抗体的免疫组织化学来评价脑中的TATk-GFP-CDKL5的定位(图18A-18B)。用DAPI固定载玻片以染色细胞核(图18B、图18C)。缩写：EGL，外颗粒层；IGL，内颗粒层；ML，分子层；PL，浦肯野(Purkinje)层。比例尺＝60μm。

[0032] 图19展示了对于TATk-GFP-CDKL5融合蛋白对小鼠的脑室内给予的插管的放置。

[0033] 图20示出了描绘出用于图21-33中说明的研究的植入物和融合蛋白注射时间表的草图。

[0034] 图21A-21C示出了DCX免疫染色的海马齿状回切片的图像，证明了与野生型小鼠(分别为图21B和图21A)相比，CDKL5敲除小鼠中新生颗粒细胞的神经突长度和数目减少。观察到连续五天脑室内给予TATk-GFP-CDKL5融合蛋白将CDKL5敲除小鼠(图21C)中的新生颗粒细胞的神经突长度和数目增加到类似于野生型(图21A)的水平。比例尺＝70μm。

[0035] 图22A-22C示出了图21中的齿状回的颗粒层的水平下的图像的放大图。比例尺＝25μm。

[0036] 图23A-23B示出了以下各项的新生颗粒细胞的重构树突树的实例：野生型(+/Y)(图23A)、CDKL5敲除小鼠(-/Y)(图23B)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)(图23C)。

[0037] 图24A-24B示出了展示出以下各项的齿状回新生颗粒细胞(DCX阳性细胞)的平均总树突长度(图24A)和树突段的平均数目(图24B)的定量的图：野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5敲除小鼠(-/Y)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)。值表示平均值±SE。**p<0.01；与+/Y相比，***p<0.001；与-/Y样品相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗伦尼检验)。

[0038] 图25A-25B示出了展示出以下各项的齿状回新生颗粒细胞的不同级的分支的平均长度(图25A)和平均数目(图25B)的定量的图：野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5敲除小鼠(-/Y)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)。值表示平均值±SE。*p<0.05；与+/Y相比，**p<0.01；与-/Y样品相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗伦尼检验)。

[0039] 图26示出了展示出以下各项中的凋亡细胞(半胱天冬酶-3阳性细胞)的定量的图：野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)。值表示平均值±SE。与+/Y相比，*p<0.05；与-/Y样品相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗伦尼检验)。

[0040] 图27示出了展示出以下各项的DG中DCX阳性细胞数目的定量的图：野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)。数据表示为细胞数目/mm2，与+/Y相比*p<0.05；与-/Y样品相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗伦尼检验)。

[0041] 图28A-28C示出了展示出来自以下各项的齿状回(DG)分子层的处理用于突触泡蛋白(SYN)免疫荧光的脑切片的代表性图像：野生型雄性小鼠(+/Y)(图28A)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)(图28B)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)(图28C)。比例尺＝80μm。缩写：GR，颗粒层；Mol，分子层。

[0042] 图29A-29C示出了展示出来自以下各项的齿状回(DG)分子层的处理用于磷酸-AKT(P-AKT)免疫荧光的脑切片的代表性图像：野生型雄性小鼠(+/Y)(图29A)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)(图29B)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)(图29C)。比例尺＝80μm。缩写：GR，颗粒层；Mol，分子层。

[0043] 图30A-30B示出了展示出以下各项中的海马体的分子层(图30A)和皮层的III层(图30B)中的突触泡蛋白(SYN)光密度的定量的图：野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TAT-GFP-CDKL5)。数据给出为相对于野生型小鼠的分子层或皮层的相应区的倍数差异。值表示平均值±SD。**p<0.01；与+/Y相比，***p<0.001；与-/Y样品相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗伦尼检验)。

[0044] 图31A-31B示出了展示出以下各项中的海马体的分子层(图31A)和皮层的V层(图31B)中的Ser437磷酸化-AKT(PAKT)的光密度的定量的图：野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)。数据给出为相对于野生型小鼠的分子层或皮层的相应区的倍数差异。值表示平均值±SD。与+/Y相比，**p<0.01；与-/Y样品相比，#p<0.01(ANOVA之后进行邦弗伦尼检验)。

[0045] 图32示出了描绘出用于图33-34中说明的行为研究的植入物和融合蛋白注射时间表的草图。

[0046] 图33示出了展示出以下各项的如经由莫里斯水迷宫测试(Morris Water Maze test)确定的学习期的定量的图：野生型雄性小鼠(+/Y；n＝8)，CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y；n＝8)，以及用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5；n＝6)。值表示平均值±SE。*P<0.05，与未处理的野生型情况相比**P<0.01，并且与未处理的CDKL5敲除情况相比#P<0.01，如在ANOVA之后用Fisher LSD检验的。

[0047] 图34A-34B示出了展示出以下各项的如通过被动回避测试确定的记忆能力的图：野生型雄性小鼠(+/Y；n＝8)，CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y；n＝8)，以及用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5；n＝6)。图示出了在行为程序的第一天(图34A)时和第二天(图34B)时进入黑暗隔区的潜伏时间。值表示平均值±SE。与未处理的野生型情况相比***P<0.001，并且与未处理的CDKL5敲除情况相比#P<0.01，如在ANOVA之后用Fisher LSD检验的。

[0048] 图35A-35B示出了展示出如通过抱拢(clasping)测试确定的运动能力的定量的图，其中测量了在2分钟间隔过程中以下各项的肢抱拢所用的时间总量：野生型雄性小鼠(+/Y；n＝8)，CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y；n＝8)，以及根据图32中的注射时间表用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-CDKL5；n＝8)。值表示平均值±SD。与+/Y相比，***p<0.001；与-/Y样品相比，#p<0.001(ANOVA之后进行邦弗伦尼检验)。

[0049] 图36展示了野生型(+/Y)和根据图20(+/Y；n＝8)或图32(-/Y；n＝6)的处理时间表用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白处理的敲除(-/Y)小鼠的体重(克)。在插管植入之后，使小鼠恢复7天。

[0050] 详细说明

[0051] 在此提供了ATk-CDKL5融合蛋白组合物和配制品以及它们用于治疗CDKL5介导的疾病和病症，尤其是由于CDKL5突变和/或缺陷所导致的病症和疾病的方法。在此还提供了用于产生TATk-CDKL5融合蛋白组合物和配制品的方法。这些方法为CDKL5介导的神经系统病症的研究提供了改进的实验工具以及为罹患与CDKL5功能异常相关的病症的患者提供改进的治疗选择。

[0052] 定义

[0053] 如在此所用，术语“生物相容的”是指通常对受者是无毒性的并且对受者不产生任何明显的不良作用的材料以及其任何代谢物或降解产物。一般而言，生物相容材料是当给予至患者时不引发明显的炎性应答或免疫应答的材料。

[0054] 如在此所用，术语“分子量”通常是指材料的质量或平均质量。在聚合物或低聚物的情况下，分子量可以是指本体聚合物的相对平均链长或相对链质量。在实践中，聚合物和低聚物的分子量可以不同方式来估计或表征，包括凝胶渗透色谱法(GPC)或毛细管测粘法。GPC分子量是作为重均分子量(Mw)报告的，该重均分子量(Mw)是与数均分子量(Mn)相对的。
毛细管测粘法将分子量的估计值提供为使用一组特定的浓度、温度和溶剂条件由稀释的聚合物溶液确定的特性黏度。

[0055] 如在此所用的“生物可降解的”通常是指将在生理条件下降解或腐蚀为能够被受试者代谢、消除或排泄出的较小单元或化学物质的材料。降解时间是组成和形态的函数。降解时间可以是从数小时至数周。

[0056] 如在此所用，术语“亲水性的”是指具有易于与水相互作用的强极性基团的物质。

[0057] 如在此所用，术语“疏水性的”是指缺乏对水的亲和力；倾向于排斥而不吸收水以及不溶解于水中或不与水混合的物质。

[0058] 如在此所用，术语“亲脂性的”是指对脂质具有亲和力的化合物。

[0059] 如在此所用，术语“两亲性的”是指将亲水特性和亲脂(疏水)特性相结合的分子。

[0060] 如在此所用，当与数值变量结合使用时，“约”、“大约”等通常是指该变量的值并且是指该变量的在实验误差之内(例如在平均值的95％置信区间之内)或在指示值的+/-10％之内的所有值(无论哪个更大)。

[0061] 如在此所用，“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”包括子代。还应当理解的是所有的子代的DNA含量可能不是精确相同的，这归因于故意的或非故意的突变。包括了具有相同功能或生物学特性的变体子代，如在原始转化细胞中所筛选的。

[0062] 如在此所用，“组合物”是指活性剂与至少一种其他化合物或分子，惰性(例如可检测试剂或标记)或活性的，诸如佐剂的组合。

[0063] 如在此所用，“对照”是在实验中用于比较目的并且被包含以最小化或辨别出除独立变量之外的变量的影响的替代性受试者或样品。

[0064] 如在此所用，“阳性对照”是指被设计成产生所希望的结果的“对照”，前提条件是所有的试剂功能正常并且实验是正确进行的。

[0065] 如在此所用，“阴性对照”是指被设计成不产生影响或结果的“对照”，前提条件是所有的试剂功能正常并且实验是正确进行的。与“阴性对照”可互换的其他术语包括“假处理(sham)”、“安慰剂(placebo)”和“模拟物(mock)”。

[0066] 如在此所用，“培养”是指在其中细胞可以繁殖并且避免衰老成一群细胞的条件下维持细胞。“培养”还可以包括其中细胞还或可替代地分化的条件。

[0067] 如在此所用，“差异性表达”是指与由正常或对照细胞中的相同基因或调节区产生的RNA水平相比，差异性产生RNA，包括但不限于由基因组的基因或调节区转录的mRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snRNA以及piRNA，或由基因编码的蛋白质产物。在另一背景下，“差异性表达”还是指与正常或对照细胞相比，细胞或组织中的具有不同的时间和/或空间表达谱的核苷酸序列或蛋白质。

[0068] 如在此所用，“过表达的”或“过表达”是指与正常或对照细胞中的RNA或蛋白质产物的表达水平相比，由基因编码的RNA或蛋白质产物的表达水平增加。

[0069] 如在此所用，“低表达的”或“低表达”是指与正常或对照细胞中的RNA或蛋白质产物的表达水平相比，由基因编码的RNA或蛋白质产物的表达水平降低。

[0070] 如在此所用，“有效量”是足以使细胞、组织、系统、动物或人类产生有益的或所希望的生物学、情绪、医学或临床应答的量。有效量可以一次或多次给予、施用或剂量来给予。该术语在其范围之内还包括有效增强正常生理功能的量。

[0071] 如在此可交换使用的术语“足够的”和“有效的”是指实现一种或多种希望的结果所需要的量(例如，质量、体积、剂量、浓度和/或时间周期)。例如，治疗有效量是指实现一种或多种治疗性效果所需要的量。

[0072] 如在此所用，在细胞背景下的“扩增(expansion)”或“扩增的”是指由原始细胞群体增加特征性的一种或多种细胞类型的数目，这些原始细胞群体可以是或可以不是相同的。用于扩增的原始细胞不一定与由扩增产生的细胞相同。例如，扩增的细胞可以通过原始细胞群体的离体或体外生长和分化产生。

[0073] 如在此所用，“表达”是指多核苷酸被转录为RNA转录物所通过的过程。在mRNA和其他翻译的RNA种类的背景下，“表达”还是指转录的RNA随后被翻译为肽、多肽或蛋白质所通过的一种或多种过程。

[0074] 如在此所用，“分离的”意指与组分、细胞和其他物质分开的，其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段正常是天然结合在一起的。非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”来使其与其天然存在的对应物相区分。

[0075] 如在此所用，“浓缩的”是指一种分子，包括但不限于多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，该分子可与其天然存在的对应物的区别在于分子的浓度或数目/体积大于其天然存在的对应物的分子的浓度或数目/体积。

[0076] 如在此所用，“稀释的”是指一种分子，包括但不限于多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，该分子可与其天然存在的对应物的区别在于分子的浓度或数目/体积小于其天然存在的对应物的分子的浓度或数目/体积。

[0077] 如在此所用，“分开的”是指与原始来源或群体在物理上分割开的状态，使得分开的化合物、试剂、粒子或分子可以不再被认为是原始来源或群体的一部分。

[0078] 如在此所用，用于治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家养动物和农场动物、非人类灵长类动物，以及动物园动物、体育动物、或宠物动物，诸如但不限于狗、马、猫和牛。

[0079] 如在此可互换所用，“受试者”、“个体”或“患者”是指脊椎动物生物体。

[0080] 如在此所用，“基本上纯的细胞群体”是指具有指定的细胞标记特征和分化潜能的细胞群体，该细胞群体是组成总细胞群体的细胞的约50％、优选约75％-80％、更优选约85％-90％，并且最优选约95％。因此，“基本上纯的细胞群体”是指这样的细胞群体：在所指定的测定条件下，该细胞群体含有少于约50％、优选少于约20％-25％、更优选少于约10％-
15％，并且最优选少于约5％的不展示出指定的标记特征和分化潜能的细胞。

[0081] 如在此所用，“治疗性的”是指治疗、治愈和/或改善疾病、病症、病状或副作用，或者是指降低疾病、病症、病状或副作用的发展速率。该术语在其范围之内还包括增强正常的生理功能、姑息治疗以及疾病、病症、病状、副作用或其症状的部分补救。该疾病或病症可以是CDKL5缺陷和/或Rett综合征。

[0082] 如在此所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”通常是指获得所希望的药理学和/或生理学效应。在预防或部分预防疾病、其症状或病状，诸如由CDKL5突变和/或缺陷、Rett综合征的CDKL5变体产生的疾病或病症，或其他CDKL5介导的神经系统病症方面，该效果可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病、病状、症状或归因于该疾病、病症或病状的不良作用方面，该效果可以是预防性的。如在此所用，术语“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人类的CDKL5介导的神经系统病症的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病在可能易受疾病但是还未被诊断为罹患疾病的受试者身上发生；(b)抑制疾病，即，遏制它发展；或(c)减轻疾病，即，缓和或改善疾病和/或其症状或病状。如在此所用，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些以及其中有待预防病症的那些。

[0083] 如在此所用，“药物配制品”是指活性剂、化合物或成分与药学上可接受的载体或赋形剂的组合，从而使该组合物适合于体外、体内或离体的诊断性、治疗性或预防性用途。

[0084] 如在此所用，“药学上可接受的载体或赋形剂”是指可用于制备药物配制品的载体或赋形剂，该载体或赋形剂通常是安全、无毒性的并且既不是生物学上也不是其他不合需要的，并且包括兽医用途以及人类药物用途可接受的载体或赋形剂。如说明书和权利要求书中所用的“药学上可接受的载体或赋形剂”包括一种和多于一种的此载体或赋形剂两者。

[0085] 如在此所用，“药学上可接受的盐”是指任何酸或碱加成盐，其反离子对它们以盐的药物剂量所给予至的受试者没有毒性。

[0086] 如在此所用，“预防(preventative)”和“预防(prevent)”是指在疾病或病状发生之前阻止或终止该疾病或病状，即使未诊断出，或者在该疾病或病状仍处于亚临床阶段时。

[0087] 如在此所用，“活性剂”或“活性成分”是指一种物质、化合物或分子，其具有生物活性或以其他方式对其所给予至的受试者诱导生物学或生理学效应。换句话说，“活性剂”或“活性成分”是指组合物中的一种或多种组分，该组合物的全部或部分作用归因于该一种或多种组分。

[0088] 如在此所用，“有形的表达介质”是指物理上有形的介质并且不仅仅是抽象思维或无记录的口头语言。有形的表达介质包括但不限于纤维素或塑料材料上的字或适合的设备诸如快闪存储器或CD-ROM上存储的数据。

[0089] 如在此所用，“化学治疗剂(chemotherapeutic agent)”或“化学治疗剂(chemotherapeutic)”是指用于预防或治疗癌症的治疗剂。

[0090] 如在此所用，“基质”是指一种材料，其中嵌入了一种或多种专门结构、分子或组合物。

[0091] 如在此所用，“适配子”是指可以结合至具有高亲和力和特异性的预选择的靶标(包括蛋白质)上的单链DNA或RNA分子。其特异性和特征不能通过其一级序列直接确定，而是通过其三级结构来确定。

[0092] 如在此所用，“免疫调节剂”是指一种试剂，诸如治疗剂，其能够调控或调节一种或多种免疫功能或应答。

[0093] 如在此所用，“抗体”是指包含由二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白、或其抗原结合部分。每条重链由一个重链可变区(在此缩写为VH)和一个重链恒定区构成。每条轻链由一个轻链可变区和一个轻链恒定区构成。VH区和VL区保留了对抗原的结合特异性并且可以进一步细分为超变区，命名为互补决定区(CDR)。CDR散布有更保守的区，命名为框架区(FR)。每个VH和VL由按以下顺序从氨基末端排到羧基末端的三个CDR和四个框架区组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

[0094] 如在此所用，“生物体”、“宿主”和“受试者”是指由至少一个细胞构成的任何活的实体。活的生物体可以简单至例如单个分离的真核细胞或培养细胞或细胞系，或者复杂至哺乳动物，包括人类和动物(例如，脊椎动物、两栖动物、鱼、哺乳动物，例如猫、狗、马、猪、牛、绵羊、啮齿动物、兔、松鼠、熊、灵长类动物(例如，黑猩猩、大猩猩和人类))。“受试者”还可以是细胞、细胞群体、组织、器官或生物体，优选人类及其组分。

[0095] 如在此所用，“患者”是指需要治疗的生物体、宿主或受试者。

[0096] 如在此所用，如在此所用的“蛋白质”是指由一条或多条氨基酸链以特定顺序组成的大分子。术语蛋白质与“多肽”可互换地使用。该顺序是通过编码该蛋白质的基因中的核苷酸的碱基序列确定的。蛋白质是为身体的细胞、组织和器官的结构、功能和调节所需要的。每种蛋白质具有独特的功能。

[0097] 如在此所用，“基本上纯的”意指目标物种是存在的占优势物种(即，在摩尔基础上它比该组合物中的任何其他单独物种更丰富)，并且优选地基本上纯化的级分是其中目标物种占存在的所有物种的约50％的组合物。一般地说，基本上纯的组合物将包含组合物中存在的所有物种的大于约80％，更优选大于约85％、90％、95％和99％。更优选地，目标物种被纯化至必要的均质性(通过常规的检测方法不能在该组合物中检测到污染物物种)，其中该组合物主要由单一物种组成。

[0098] 如在此所用，“核酸”和“多核苷酸”通常是指一条至少两个碱基-糖-磷酸盐的组合串并且除此之外是指单链和双链的DNA、是单链区与双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA、以及是单链区与双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更典型地是双链或单链区与双链区的混合物的DNA和RNA的杂交分子。此外，在此所用的多核苷酸是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。在此类区中的链可以来自相同的分子或来自不同的分子。这些区可以包含一个或多个分子中的全部，但是更典型地仅包含一些分子的区。三螺旋区的分子中的一种常常是寡核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”还涵盖多核苷酸的此类化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(尤其包括简单细胞和复杂细胞)所特有的DNA和RNA的化学形式。例如，术语多核苷酸包括如以上所述的含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。因此，仅举两个实例，包含稀有碱基(诸如肌苷)或修饰碱基(诸如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA是如该术语在此所用的多核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”还包括PNA(肽核酸)、硫代磷酸以及天然核酸的磷酸主链的其他变体。天然核酸具有磷酸主链，人工核酸可以含有其他类型主链，但是含有相同的碱基。因此，出于稳定性或其他原因而对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在此所意指的“核酸”或“多核苷酸”。

[0099] 如在此所用，“脱氧核糖核酸(DNA)”和“核糖核酸(RNA)”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。RNA可以是呈以下形式：tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA,RNAi(RNA干扰构建体)、siRNA(短干扰RNA)或核酶。

[0100] 如在此所用，“核酸序列”和“寡核苷酸”还涵盖如以上所定义的核酸和多核苷酸。

[0101] 如在此所用，“DNA分子”包括由DNA组成的核酸/多核苷酸。

[0102] 如在此所用，“基因”是指对应于DNA序列的遗传单位，该遗传单位占据染色体上的特定位置并且含有生物体中的一个或多个特征或一个或多个性状的遗传指令。

[0103] 如在此所用，术语“重组体”通常是指非天然存在的核酸、核酸构建体或多肽。此类非天然存在的核酸可以包括已被修饰，例如具有缺失、取代、翻转、插入等的天然核酸，和/或使用分子生物技术所接合的不同来源的核酸序列的组合(例如，编码融合蛋白(例如，由两种不同的蛋白质或蛋白质片段的组合形成的蛋白质或多肽)的核酸序列，编码多肽的核酸与启动子序列的组合，其中编码序列和启动子序列来自不同的来源或以其他方式典型地非天然地一起出现(例如核酸和组成型启动子)等)。重组体还是指由重组核酸编码的多肽。非天然存在的核酸或多肽包括通过人而经修饰的核酸和多肽。

[0104] 如在此所用，“融合蛋白”是指由至少两种不同的蛋白质或蛋白质片段的组合形成的蛋白质。融合蛋白是由重组DNA分子编码的。因此，“CDKL5融合蛋白”是指具有可操作地连接至其他多肽序列上的人类CDKL5多肽或其变体的重组蛋白。

[0105] 如在此所用，“CDKL5缺陷”是指蛋白质的生物学功能的任何缺陷。该缺陷可以产生自编码蛋白质的DNA或DNA相关调节区中的任何DNA突变，或由于表观遗传DNA修饰的任何变化导致的蛋白质功能的任何变化，包括但不限于DNA甲基化或组蛋白修饰、CDKL5蛋白的二级、三级或四级结构的任何变化，或CDKL5蛋白相比于野生型或正常受试者执行其生物学功能的能力的任何变化。

[0106] 如在此所用，“Rett综合征变体”、“Rett综合征的变体”等是指Rett综合征的非典型形式，其与Rett综合征具有类似的临床征象但病因学未知。

[0107] 如在此所用，“CDKL5突变”是指CDKL5蛋白质的编码区的核苷酸序列中的任何变化。

[0108] 如在此所用，术语“转染”是指将外源性和/或重组核酸序列引入到活细胞的细胞膜封闭空间的内部中，包括将核酸序列引入到细胞的胞液以及线粒体、细胞核或叶绿体的内部空间中。核酸可以呈裸DNA或RNA的形式，其可以与不同蛋白质或调节元件(例如，启动子和/或信号元件)缔合，或者核酸可以掺入到载体或染色体中。

[0109] 如在此所用，“转化”或“转化的”是指将核酸(例如，DNA或RNA)引入到细胞中，以此方式使得允许引入的核酸的编码部分表达。

[0110] 如在此所用，“转导的”是指将蛋白质直接引入到细胞中。

[0111] 如在此所用，“肽”是指相对于蛋白质或多肽是短的至少2个氨基酸的链。

[0112] 如在此所用，“变体”是指不同于参考多肽但是保留了必要的特性的多肽。多肽的典型变体与另一个参考多肽在氨基酸序列上不同。一般来讲，差异是受限的，使得参考多肽和变体的序列总体上是紧密类似的并且在许多区中是相同的。变体和参考多肽可以通过一个或多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)而在氨基酸序列上不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是被遗传密码编码的氨基酸残基。多肽的变体可以是天然存在的诸如等位基因变体，或者可以是未知是天然存在的变体。“变体”包括功能和结构的变体。

[0113] 如在此所用，“一致性”是两种或更多种多肽序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。在本领域中，“一致性”还是指多肽之间的序列相关性程度，如通过此类序列串之间的匹配所确定的。“一致性”可以容易地通过已知方法计算，这些已知方法包括但不限于以下各项中所述的那些：计算分子生物学(Computational Molecular Biology)，莱斯克，AM.(Lesk,A.M.)编著，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约(New York)，1988；生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)，史密斯，D.W.(Smith,D.W.)编著，学术出版社(Academic Press)，纽约，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第I部分，格里芬，A.M.(Griffin,A.M.)和格里芬，H.G.编著，胡马纳出版社(Humana Press)，新泽西州(New Jersey)，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，冯·海因切，G.(von Heinje,G.)编著，学术出版社，1987；以及序列分析初级读本(Sequence Analysis Primer)，吉布考夫，M.(Gribskov,M.)和德夫莱克J.(Devereux,J.)编著，米斯托克顿出版社(M Stockton Press)，纽约，1991；以及卡里罗，H.(Carillo,H.)和里皮曼，D.(Lipman,D.)，工业与应用数学学会应用数学杂志(SIAM J Applied Math.)1988，48:1073。设计了用于确定一致性的优选方法，以得出测试序列之间的最大匹配。确定一致性的方法编纂在公众可获得的计算机程序中。可以通过使用结合尼德曼和翁施(Needelman and Wunsch)(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，1970，48:443-453)算法(例如，NBLAST和XBLAST)的分析软件(例如，遗传计算组的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group)，威斯康星州麦迪逊(Madison Wis.))来确定两种序列之间的百分比一致性。使用缺省参数来确定本披露的多肽的一致性。

[0114] 如在此所用，如在此所用的“质粒”是指包含完整“复制子”的非染色体的双链DNA序列，由此使得该质粒在宿主细胞中被复制。

[0115] 如在此所用，术语“载体”用于指用于将外源性核酸序列引入到细胞中的媒介物。载体可以包括线性或环状的DNA分子(例如质粒)，该DNA分子包含编码感兴趣的多肽的区段，该区段被可操作地连接至在引入到宿主细胞或宿主细胞细胞器中后提供其转录和翻译的另外区段上。此类另外的区段可以包括启动子序列和终止子序列，并且还可以包括一个或多个复制起点、一种或多种选择性标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常来源于酵母或细菌基因组或质粒DNA、或病毒DNA，或可以含有两者的元件。

[0116] 如在此所用，“可操作地连接”指明可用于表达核酸的编码序列的调节序列以相对于编码序列的适当位置位于核酸分子中以便实现编码序列的表达。此相同定义有时适用于表达载体中的编码序列和转录控制元件(例如，启动子、增强子和终止元件)和/或选择性标记的安排。

[0117] 如在此所用，“野生型”是在自然界中出现的典型形式的生物体、变种、菌株、基因、蛋白质或特征，与可能产生自选择育种或使用转基因的转化的变体形式相区分。

[0118] 如在此所用，“cDNA”是指与细胞中的RNA转录物互补的DNA序列。其是人造的分子。典型地，cDNA使用RNA转录物为模板通过所谓的逆转录酶的酶在体外形成。

[0119] 如在此所用，“纯化的”或“纯化”用于指相对于自然环境具有增加的纯度的核酸序列、肽或多肽。

[0120] 如在此所用，“分化(differentiate)”或“分化(differentiation)”是指前体细胞或祖细胞(例如神经元祖细胞)分化为特定的细胞类型(例如神经元)所通过的过程。

[0121] 如在此所用，“剂量(dose)”、“单位剂量”或“剂量(dosage)”是指适合用于受试者的物理离散单位，各单位含有预定量的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和/或其药物配制品，该预定量经计算以产生所希望的应答或与其给予相关联的应答。

[0122] 如在此所用，“特异性结合配偶体”或“结合配偶体”是相比于所有其他分子或化合物，与第二化合物或分子的结合的亲和力更高的化合物或分子。

[0123] 如在此所用，“特异性地结合”或“特异性结合”是指此类成对物种诸如酶/底物、受体/激动剂或拮抗剂、抗体/抗原、凝集素/碳水化物、寡DNA引物/DNA、酶或蛋白质/DNA，和/或RNA分子与其他核酸(DNA或RNA)或氨基酸之间存在的结合，该结合可以是由共价相互作用或非共价相互作用或共价相互作用和非共价相互作用的组合介导的。当两种物种的相互作用产生非共价结合的复合物时，发生的结合典型地是静电的、氢键的或亲脂性相互作用的结果。因此，“特异性结合”发生在成对物种之间，其中两者之间存在产生具有以下的特征的结合复合物的相互作用：抗体/抗原、酶/底物、DNA/DNA、DNA/RNA、DNA/蛋白质、RNA/蛋白质、RNA/氨基酸、受体/底物相互作用。具体地，特异性结合的特征在于对中的一个成员与结合成员的相应成员所属于的化合物家族内的特定物种结合并且不与其他物种结合。因此，例如，抗体优选结合蛋白质家族内的单一表位并且不结合其他表位。

[0124] 如在此所用，“抗感染药”是指可以杀伤传染剂或抑制其传播的化合物或分子。抗感染药包括但不限于抗生素、抗细菌药、抗真菌药、抗病毒药和抗原生动物药。

[0125] 如在此所用，“野生型”是在自然界中出现的典型形式的生物体、变种、菌株、基因、蛋白质或特征，与可能产生自选择育种或使用转基因的转化的变体形式相区分。

[0126] 如在此所用，“诱导(induces)”、“诱导(inducing)”或“诱导的(induced)”是指激活或刺激细胞内的过程或途径，诸如胞吞作用、分泌和胞吐作用。

[0127] 如在此所用，“衍生物”是指与化合物具有相同或类似的核心结构但具有至少一种结构差异的任何化合物，该至少一种结构差异包括取代、缺失和/或添加一个或多个原子或官能团。术语“衍生物”不意指衍生物由母体化合物作为起始物料或中间体合成，但是可以是这样的情形。术语“衍生物”可以包括前药、或母体化合物的代谢物。衍生物包括这样的化合物，其中母体化合物中的游离氨基基团已被衍生化以形成盐酸胺盐、对甲苯磺酰胺、苯酰氧基羧酰胺(benzoxycarboamides)、叔丁氧羧酰胺(t-butyloxycarboamides)、硫代氨基甲酸酯型衍生物、三氟乙酰胺(trifluoroacetylamides)、氯乙酰胺或甲酰胺。衍生物包括这样的化合物，其中母体化合物中的羧基基团已被衍生化以形成甲基酯和乙基酯，或其他类型的酯或酰肼。衍生物包括这样的化合物，其中母体化合物中的羟基基团已被衍生化以形成O-酰基或O-烷基衍生物。衍生物包括这样的化合物，其中母体化合物中的供氢键基团被替换为另一种供氢键基因诸如OH、NH或SH。衍生物包括将母体化合物中的氢键受体基团替换为另一种氢键受体基团诸如酯、醚、酮、碳酸盐、叔胺、亚胺、硫酮、砜、叔酰胺以及硫化物。“衍生物”还包括用饱和的或不饱和的环己烷或其他更复杂的例如含氮的环以及具有不同侧基团的这些环的延伸物替换环戊烷环的延伸物。

[0128] 如在此所用，“治疗有效量”是指在此所述的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品、助剂或第二试剂将引发组织、系统、动物或人类的生物或医学应答的量，该量是由研究者、兽医、医师或其他临床医师所寻求的。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以防止CDKL5缺陷和/或Rett综合征的一种或多种症状的发展、将该一种或多种症状减少或减轻至一定程度的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，与对照相比，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以增加受试者的脑的区中的神经元存活率、神经元数目、神经突生长、延长和/或分支密度的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，与对照相比，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以增加受试者的学习能力的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，与对照相比，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以增加受试者的记忆能力的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，与对照相比，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以改善受试者的运动功能的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以将学习能力、记忆能力和/或运动功能恢复至基本上类似于野生型或正常水平的水平的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以将脑的区中的神经元数目、神经元存活率、神经突生长、神经突延长、神经突分支数目和/或神经突分支密度恢复至基本上类似于野生型或正常水平的水平的量。该治疗有效量将根据以下各项变化：CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的确切化学结构、被治疗的CDKL5缺陷、Rett综合征或其症状、给予路径、给予时间、排泄速率、药物组合、治疗医师的判断、剂型以及有待治疗的受试者的年龄、重量、一般健康状况、性别和/或饮食。

[0129] 如在此所用，“协同效应”、“协同作用”或“协同性”是指在两种或更多种分子、化合物、物质、因素或组合物之间出现的大于或不同于它们的单独效应的总和的效应。

[0130] 如在此所用，“累加效应”是指在两种或更多种分子、化合物、物质、因素或组合物之间出现的与它们的单独效应的总和相等或相同的效应。

[0131] 除非在此另外定义，否则在此使用的所有技术性和科学性的术语具有与本领域技术人员所普遍理解的相同含义。

[0132] 讨论

[0133] TATk-CDKL5融合基因和蛋白质

[0134] 融合基因和蛋白质

[0135] 在此披露了重组cDNA序列，其编码不同的含有修饰TAT(TATk)序列的CDKL5融合蛋白。在一个实施例中，该融合蛋白含有可操作地连接至TATk多肽上的人类CDKL5多肽。编码CDKL5融合蛋白的cDNA序列可以具有根据在此所述的SEQ ID NO:2、7、9、11、13，或其变体中的任一个的序列。CDKL5融合蛋白可以具有根据在此所述的SEQ ID NO:8、10、12、14，或其变体中的任一个的多肽序列。

[0136] 在一些实施例中，人类CDKL5cDNA序列可以根据SEQ ID NO:1或15。在另外的实施例中，人类CDKL5cDNA可以与SEQ ID NO:1或15具有约90％至约100％、80％至约90％、或约50％至约80％一致。在一些实施例中，人类CDKL5cDNA序列可以编码根据SEQ ID NO:2或16的氨基酸序列。在另外的实施例中，人类CDKL5cDNA序列可以编码与SEQ ID NO:2或16具有约90％至约100％、80％至约90％、或约50％至约80％一致的氨基酸序列。

[0137] 在一些实施例中，人类CDKL5cDNA序列可以是与SEQ ID NO:1中的12个连续核苷酸具有约90％至100％一致的至少12个连续核苷酸的片段。在一些实施例中，人类CDKL5cDNA序列可以是与SEQ ID NO:1中的12个连续核苷酸具有约80％至90％一致的至少12个连续核苷酸的片段。在一些实施例中，cDNA序列可以是与SEQ ID NO:1中的12个连续核苷酸具有约50％至80％一致的至少12个连续核苷酸的片段。

[0138] CDKL5融合蛋白含有可操作地连接至人类CDKL5多肽上的修饰的反式作用激活的转录(TAT)蛋白质转导结构域(PTD)(下文中的TATk)。TATk可以具有根据SEQ ID NO:3的cDNA序列和根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列。TATk是修饰的TAT-PTD。未修饰的TAT-PTD介导肽和蛋白质到细胞中的转导。然而，未修饰的TAT-PTD不允许TAT-PTD融合蛋白被细胞分泌。未修饰的TAT-PTD通过弗林内切蛋白酶在位于未修饰TAT-PTD之内的弗林蛋白酶识别序列处从融合蛋白裂解出来。相反，TATk被修饰使得其不含有弗林蛋白酶识别序列。因此，在此所述的含有TATk的CDKL5融合蛋白可以其全长形式被真核细胞分泌。

[0139] 在一些实施例中，TATk cDNA序列可以与SEQ ID NO:3具有约90％至100％或约80％至约90％一致。在一些实施例中，TATk cDNA可以编码与SEQ ID NO:4具有约90％至
100％或约80％至约90％一致的多肽序列。

[0140] CDKL5融合蛋白可以任选地含有Igκ-链前导序列以在由细胞产生过程中将多肽引向分泌途径。在一些实施例中，该Igκ-链前导序列可以被可操作地连接在人类CDKL5多肽的N-末端处。该Igκ-链前导序列可以具有根据在此所述的SEQ ID NO:5或其变体的cDNA序列并且可以具有根据在此所述的SEQ ID NO:6或其变体的氨基酸序列。

[0141] 在其他实施例中，该Igκ-链前导序列cDNA可以与SEQ ID NO:5具有约90％至100％、约80％至约90％、或约80％至90％一致。在一些实施例中，该Igκ-链前导序列可以具有与SEQ ID NO:6具有约90％至约100％、约80％至约90％、或约50％至约80％一致的氨基酸序列。

[0142] CDKL5融合蛋白可以任选地含有可操作地连接至CDKL5融合蛋白上的一个或多个蛋白质标签。这些标签类型是允许融合蛋白的亲和纯化、溶解、色谱分离和/或免疫检测的氨基酸序列。适合的蛋白质标签包括但不限于几丁质结合蛋白质(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、聚(His)、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、FLAG标签(包括任何FLAG标签变体，例如3x FLAG)、V5标签、Myc标签、HA标签、S标签、SBP标签、Sf标签1、Sof标签3、Tc标签、Xpress标签、Strep标签、Isopep标签、Spy标签、Ty标签、生物素羧基载体蛋白(BCCP)以及Nus标签。根据SEQ ID NO:7、9或11、分别具有根据SEQ ID NO:8、10或12的氨基酸序列的CDKL5融合蛋白cDNA展示了含有TATk和Myc标签和聚(HIS)标签的CDKL5融合蛋白的非限制性实施例。根据SEQ ID NO:13、具有根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDKL5融合蛋白cDNA展示了具有FLAG标签的CDKL5融合蛋白的非限制性实施例。

[0143] CDKL5融合蛋白可以任选地含有可操作地连接至CDKL5多肽上的一种或多种报告蛋白。适合的报告基因包括但不限于荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)以及青色荧光蛋白(CFP))、β-半乳糖苷酶、荧光素酶(细菌、萤火虫和海肾荧光素酶)、抗生素耐性基因(例如氯霉素乙酰转移酶、新霉素磷酸转移酶和NPT-II)、β-葡萄糖醛酸酶(p-glucuronidase)以及碱性磷酸酶。报告蛋白的包含尤其允许融合蛋白和融合蛋白功能的直接和/或间接表征，以及该蛋白质的亲和纯化。该报告蛋白可以被可操作地连接至人类CDKL5多肽的N-末端和/或C-末端上。在其他实施例中，该报告蛋白可以被可操作地连接至CDKL5融合蛋白的N-末端和/或C-末端上。根据SEQ ID NO:9或11并且分别具有根据SEQ ID NO:8或10的氨基酸序列的CDKL5融合蛋白cDNA展示了含有荧光报告蛋白的CDKL5融合蛋白的非限制性实施例。

[0144] 重组载体

[0145] CDKL5融合cDNA序列可以被掺入到适合的表达载体中。该表达载体可以含有用于促进CDKL5融合cDNA的表达的一种或多种调节序列或一种或多种其他序列。该表达载体可以含有用于促进CDKL5融合表达载体的复制的一种或多种调节序列或一种或多种其他序列。该表达载体可以适用于在细菌细胞中表达CDKL5融合蛋白。在其他实施例中，该表达载体可以适用于在酵母细胞中表达CDKL5融合蛋白。在另外实施例中，该表达载体可以适用于在植物细胞中表达CDKL5融合蛋白。在其他实施例中，该表达载体可以适用于在哺乳动物细胞中表达CDKL5融合蛋白。在另一个实施例中，该载体可以适用于在真菌细胞中表达CDKL5融合蛋白。适合的表达载体通常在本领域中是已知的。

[0146] TATk-CDKL5蛋白质产生

[0147] 在一些实施例中，CDKL5融合蛋白在细胞培养体系中体外产生。该细胞培养体系可以含有一种或多种细菌、酵母、真菌、植物或哺乳动物细胞。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白被一种或多种培养细胞分泌到细胞培养基中。在其他实施例中，CDKL5融合蛋白被包含在一种或多种培养细胞的细胞质或细胞膜之内。

[0148] 由此，转向图1，其示出了产生CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例，其中CDKL5融合蛋白由培养的细胞产生并且被分泌到周围培养基中。该方法开始于使含有CDKL5融合蛋白cDNA序列的适合载体转染或以其他方式递送至培养物中的一种或多种细胞(6000)。然后使用通常已知的方法培养细胞(6010)以使得转染的细胞由载体产生CDKL5融合蛋白并且将CDKL5融合蛋白分泌到周围细胞培养基中。在适量时间之后，收集含有分泌的CDKL5融合蛋白的培养基(6020)。在一些实施例中，将细胞培养从约12h至约96h。这时候，确定是否需要进一步从培养基中纯化CDKL5融合蛋白(6030)。在一些实施例中，含有CDKL5融合蛋白的培养基不进一步进行纯化并且直接用于转导一种或多种细胞(6050)。在其他实施例中，进一步从培养基中纯化CDKL5融合蛋白和/或将CDKL5融合蛋白浓缩在培养基中。在一些实施例中，使用适合的方法纯化和/或浓缩CDKL5融合蛋白。适合的方法包括但不限于亲和纯化、大小排阻分离以及色谱分离方法。

[0149] 考虑到分泌性产生方法的理解，转向图2，其示出了产生CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例，其中CDKL5融合蛋白未被分泌到周围的细胞培养基中。该方法开始于使含有CDKL5融合蛋白cDNA序列的适合载体转染或以其他方式递送至培养物中的一种或多种细胞(6000)。然后使用通常已知的方法培养细胞(6010)以使得转染的细胞由载体产生CDKL5融合蛋白。在适量时间之后，使用标准方法裂解细胞(7000)。在一些实施例中，在进行裂解之前，将细胞培养从12h至96h。

[0150] 接着，确定CDKL5融合蛋白是否被整合在细胞膜或细胞质之内(7010)。如果CDKL5融合蛋白在细胞膜级分中，那么收集细胞膜级分(7020)。在收集细胞膜级分之后(7020)，使用适合的方法将CDKL5融合蛋白与膜级分分开(6040)以用于纯化和/或浓缩CDKL5融合蛋白。

[0151] 在其中CDKL5融合蛋白存在于细胞质中的实施例中，收集含有CDKL5融合蛋白的上清液(7030)。在收集上清液之后(7030)，确定是否应当进一步纯化和/或浓缩CDKL5融合蛋白。如果确定应当进一步纯化和/或浓缩CDKL5融合蛋白，那么使用适合的方法纯化和/或浓缩CDKL5融合蛋白(6040)。适合的方法包括但不限于亲和纯化、大小排阻分离以及色谱分离方法。在其中确定不应当进一步从上清液中纯化和/或浓缩CDKL5的其他实施例中，含有CDKL5融合蛋白的上清液直接用于转导细胞(6050)。

[0152] 含有TATk-CDKL5融合蛋白的组合物和配制品

[0153] 含有如在此所述的CDKL5融合蛋白的组合物和配制品也在本披露的范围之内。该组合物可以是含有可以根据在此所述的方法产生的CDKL5融合蛋白的培养基或上清液。

[0154] 在此所述的CDKL5融合蛋白可以单独地或作为诸如药物配制品中的活性成分被提供给有需要的受试者。因此，还在此描述了含有一定量的CDKL5融合蛋白的药物配制品。在一些实施例中，这些药物配制品含有治疗有效量的CDKL5融合蛋白。在此所述的这些药物配制品可以被给予至有需要的受试者。该有需要的受试者可以患有CDKL5缺陷、Rett综合征和/或其症状。在其他实施例中，该CDKL5融合蛋白可以被使用在用于治疗或预防CDKL5缺陷、Rett综合征和/或其症状的药剂的制造中。

[0155] 药学上可接受的载体和辅助成分以及试剂

[0156] 含有治疗有效量的在此所述的CDKL5融合蛋白的药物配制品可以进一步包含药学上可接受的载体。适合的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、以及聚乙烯吡咯烷酮，它们不与活性组合物发生有害反应。

[0157] 可以对这些药物配制品进行灭菌并且必要时与助剂诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与活性组合物发生有害反应。

[0158] 除治疗有效量的在此所述的CDKL5融合蛋白之外，该药物配制品还可以包含有效量的辅助活性剂，包括但不限于抑制必要的肿瘤蛋白质和基因的翻译或转录的DNA、RNA、氨基酸、肽、多肽、抗体、适配子、核糖核酸酶、核糖核酸酶的指导序列、激素、免疫调节剂、解热药、抗焦虑剂、抗精神病药、镇痛药、镇痉药、抗炎药、抗组胺药、抗感染药、以及化疗药物。

[0159] 适合的激素包括但不限于氨基酸衍生的激素(例如，褪黑激素和甲状腺素)、小肽激素和蛋白质激素(例如促甲状腺激素释放激素、抗利尿激素、胰岛素、生长激素、促黄体激素、促卵泡激素以及促甲状腺激素)、类花生酸类(eiconsanoids)(例如花生油酸、脂氧素和前列腺素)以及类固醇激素(例如雌二醇、睾酮、四氢睾酮皮质醇(tetrahydro testosteron cortisol))。

[0160] 适合的免疫调节剂包括但不限于泼尼松、硫唑嘌呤、6-MP、环孢霉素、他克莫司、甲氨蝶呤、白介素(例如IL-2、IL-7和IL-12)、细胞因子(例如干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω和IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子以及咪喹莫特)、趋化因子(例如CCL3、CCL26和CXCL7)、胞嘧啶磷酸盐-鸟苷、寡脱氧核苷酸、葡聚糖、抗体以及适配子)。

[0161] 适合的解热药包括但不限于非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、阿司匹林和相关的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁(magnesium salicylae)和水杨酸钠(sodium salicaylate))、对乙酰氨基酚(paracetamol)/醋氨酚(acetaminophen)、美他米佐、萘丁美酮、安替比林以及奎宁。

[0162] 适合的抗焦虑剂包括但不限于苯并二氮卓(例如阿普唑仑、溴西潘、利眠宁、氯硝西泮、氯氮卓、地西泮、氟西泮、劳拉西泮、奥沙西泮、替马西泮、三唑仑和托非索泮)、5-羟色胺能抗抑郁药(例如选择性5-羟色胺再吸收抑制剂、三环抗抑郁药和单胺氧化酶抑制剂)、梅比卡(mebicar)、afobazole、selank、布罗曼坦(bromantane)、3-羟基-6-甲基-2-乙基盐酸吡啶(emoxypine)、阿扎哌隆(azapirones)、巴比妥酸盐、羟嗪、普瑞巴林、伐力多(validol)以及β阻断剂。

[0163] 适合的抗精神病药包括但不限于苯哌利多(benperidol)、溴哌利多(bromoperidol)、氟哌利多、氟哌啶醇(haloperidol)、莫哌隆(moperone)、匹泮哌隆(pipaperone)、替米哌隆(timiperone)、氟司必林、五氟利多、匹莫齐特(pimozide)、乙酰丙嗪、氯丙嗪、氰美马嗪、dizyrazine、氟奋乃静、左美丙嗪、甲砜哒嗪、培拉嗪(perazine)、哌氰嗪、奋乃静、哌泊噻嗪、丙氯拉嗪、普马嗪(promazine)、异丙嗪、丙硫喷地(prothipendyl)、硫丙拉嗪、甲硫达嗪(thioridazine)、三氟拉嗪、三氟丙嗪、氯普噻吨、氯哌噻吨、氟哌噻吨、替沃噻吨(tiotixene)、珠氯噻醇、氯噻平(clotiapine)、克塞平(loxapine)、丙硫喷地、卡匹帕明、氯卡帕明、吗啉吲酮(molindone)、莫沙帕明(mosapramine)、舒必利(sulpiride)、维拉必利(veralipride)、氨磺必利(amisulpride)、阿莫沙平(amoxapine)、阿立哌唑、阿塞那平(asenapine)、氯氮平(clozapine)、布南色林(blonanserin)、伊潘立酮(iloperidone)、鲁拉西酮(lurasidone)、美哌隆(melperone)、奈莫必利(nemonapride)、奥氮平(olanzaprine)、帕潘立酮(paliperidone)、哌罗匹隆(perospirone)、奎硫平(quetiapine)、瑞莫必利(remoxipride)、利培酮(risperidone)、舍吲哚(sertindole)、曲米帕明、齐拉西酮、佐替平(zotepine)、alstonie、百分普那(befeprunox)、比托派汀(bitopertin)、依匹唑派(brexpiprazole)、大麻二酚、卡利拉嗪(cariprazine)、匹莫范色林、pomaglumetad methionil、戊卡色林(vabicaserin)、呫诺美林(xanomeline)以及奇洛那平(zicronapine)。

[0164] 适合的镇痛药包括但不限于对乙酰氨基酚/醋氨酚、非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔、塞来考昔和艾托考昔)、阿片样物质(例如吗啡、可待因、羟考酮、氢可酮、双氢吗啡、哌替啶、丁丙诺啡)、曲马朵(tramadol)、去甲肾上腺素、flupiretine、奈福泮、奥芬那君、普瑞巴林、加巴喷丁、环苯扎林、东莨菪碱、美沙酮、凯托米酮、哌腈米特和阿司匹林以及相关的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)。

[0165] 适合的镇痉药包括但不限于美贝维林、罂粟碱(papverine)、环苯扎林、卡立普多、奥芬那君、替扎尼定、美他沙酮、美索巴莫(methodcarbamol)、氯唑沙宗、巴氯芬、丹曲林(dantrolene)、巴氯芬、替扎尼定以及丹曲林。

[0166] 适合的抗炎药包括但不限于泼尼松、非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔、塞来考昔和艾托考昔)以及免疫选择性抗炎衍生物(例如下颌下腺肽-T及其衍生物)。

[0167] 适合的抗组胺药包括但不限于H1-受体拮抗剂(例如阿伐斯汀、氮卓斯汀(azelastine)、比拉斯汀(bilastine)、溴苯那敏、布克力嗪、溴苯醇胺、卡比沙明、西替利嗪、氯丙嗪、赛克利嗪(cyclizine)、氯苯那敏、克立马丁(clemastine)、赛庚啶、地洛他定、右溴苯那敏(dexbromapheniramine)、右氯苯那敏、茶苯海明、二甲茚定、苯海拉明、抗敏安(doxylamine)、依巴斯汀(ebasine)、恩布拉敏(embramine)、非索非那定、羟嗪、左旋西替利嗪(levocetirzine)、氯雷他定(loratadine)、美克洛嗪、米氮平、奥洛他定、奥芬那君、苯茚胺、非尼拉敏、苯托沙敏、异丙嗪、吡拉明(pyrilamine)、喹硫平、卢帕他定、曲吡那敏(tripelennamine)和曲普利啶(triprolidine))、H2-受体拮抗剂(例如西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁、拉呋替丁、尼扎替丁(nizatidine)、雷尼替丁(rafitidine)和罗沙替丁(roxatidine))、曲托喹啉、儿茶素(catechin)、色甘酸盐、奈多罗米以及β2-肾上腺素能激动剂。

[0168] 适合的抗感染药包括但不限于抗阿米巴药(硝唑尼特、巴龙霉素、甲硝唑、替硝唑、氯喹、米替福新(miltefosine)、两性霉素b和双碘喹啉)、氨基糖苷类(例如巴龙霉素、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星(amikacin)、卡那霉素和新霉素)、打虫药(例如噻嘧啶、甲苯达唑、伊佛霉素(ivermectin)、吡喹酮、阿苯哒唑(abendazole)、噻苯达唑、奥沙尼喹)、抗真菌药(例如唑类抗真菌药(例如依曲康唑(itraconazole)、氟康唑、泊沙康唑、酮康唑、克霉唑、咪康唑和伏立康唑)、棘白霉素(echinocandins)(例如卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净(micafungin))、灰黄霉素、特比萘芬(terbinafine)、氟胞嘧啶，以及多烯类(例如制真菌素(nystatin)和两性霉素b))、抗疟剂(例如乙胺嘧啶(pyrimethamine)/磺胺多辛(sulfadoxine)、蒿甲醚(artemether)/苯芴醇(lumefantrine)、阿托伐醌/氯胍(proquanil)、奎宁、羟氯喹、甲氟喹、氯喹、多西环素(doxycycline)、乙胺嘧啶和卤泛曲林(halofantrine))、抗痨剂(例如氨基水杨酸盐(例如氨基水杨酸)、异烟肼/利福平(rifampin)、异烟肼/吡嗪酰胺/利福平、贝达喹啉(bedaquiline)、异烟肼、乙胺丁醇、利福平、利福布汀、利福喷汀、卷曲霉素和环丝氨酸)、抗病毒药(例如金刚烷胺、金刚烷乙胺、阿巴卡韦(abacavir)/拉米夫定(lamivudine)、恩曲他滨(emtricitabine)/替诺福韦(tenofovir)、考比泰特(cobicistat)/埃替格韦(elvitegravir)/恩曲他滨/替诺福韦、依法韦仑/恩曲他滨/替诺福韦、阿巴卡韦(avacavir)/拉米夫定/齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定/齐多夫定、恩曲他滨/替诺福韦、恩曲他滨/罗匹那韦(opinavir)/利托那韦(ritonavir)/替诺福韦、干扰素α2v/利巴韦林(ribavirin)、聚乙二醇干扰素α-2b、马拉韦罗(maraviroc)、雷特格韦(raltegravir)、德罗格韦(dolutegravir)、恩夫韦地(enfuvirtide)、膦甲酸、福米韦生(fomivirsen)、奥司他韦(oseltamivir)、扎那米韦(zanamivir)、奈韦拉平(nevirapine)、依法韦仑、依曲韦林、利匹韦林、地拉韦啶(delaviridine)、奈韦拉平、恩替卡韦、拉米夫定、阿德福韦、索非布韦、地达诺新、替诺福韦、avacivr、齐多夫定、司他夫定、恩曲他滨、扎西他滨(xalcitabine)、替比夫定、西米普韦、波西普韦(boceprevir)、特拉匹韦、洛匹那韦/利托那韦、弗沙那韦(fosamprenvir)、瑞纳韦(dranuavir)、利托那韦、替拉那韦(tipranavir)、阿扎那韦(atazanavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安瑞那韦、茚地那韦、沙喹那韦(sawuinavir)、利巴韦林、伐昔洛韦(valcyclovir)、阿昔洛韦、泛昔洛韦、更昔洛韦和缬更昔洛韦(valganciclovir))、碳青霉烯类(例如多利培南、美罗培南、厄他培南和西司他丁/亚胺培南)、头孢菌素类(例如头孢羟氨苄、头孢拉啶、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢吡肟、头孢洛林(ceflaroline)、氯碳头孢、头孢替坦、头孢呋辛、头孢罗齐、氯碳头孢、头孢西丁、头孢克洛、头孢布烯、头孢曲松、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克肟、头孢托仑、头孢唑肟(cefizoxime)和头孢他啶)、糖肽抗生素(例如万古霉素、达巴万星、奥利万星和替拉万星(telvancin))、甘氨环素类(例如替加环素)、抗麻风药(例如氯法齐明和萨力多胺)、洁霉素(lincomycin)及其衍生物(例如克林霉素和洁霉素)、大环内酯类及其衍生物(例如泰利霉素、非达霉素(fidaxomicin)、红霉素(erthromycin)、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素和醋竹桃霉素)、利奈唑胺(linezolid)、磺胺甲噁唑/甲氧苄氨嘧啶、利福昔明、氯霉素、磷霉素、甲硝唑、氨曲南(aztreonam)、杆菌肽、青霉素类(penicillins)(阿莫西林、氨比西林、巴氨西林、羧苄西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林/克拉维酸、氨比西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、克拉维酸/替卡西林、青霉素、普鲁卡因青霉素(procaine penicillin)、苯唑西林(oxaxillin)、双氯西林和萘夫西林)、喹诺酮类(例如洛美沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、qatifloxacin、莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、吉米沙星、莫西沙星、西诺沙星、萘啶酸、依诺沙星(enoxacin)、格雷沙星、加替沙星(gatifloxacin)、曲伐沙星和司帕沙星)、磺酰胺类(例如磺胺甲噁唑/甲氧苄氨嘧啶、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)和磺胺异噁唑
(sulfasoxazole))、四环素类(例如多西环素、地美环素、米诺环素(minocycline)、多西环素/水杨酸、多西环素/ω-3多不饱和脂肪酸和四环素)以及尿道抗感染药(例如呋喃咀啶(nitrofurantoin)、乌洛托品、磷霉素、西诺沙星、萘啶酸、甲氧苄氨嘧啶和亚甲基蓝)。

[0169] 适合的化学药物包括但不限于紫杉醇、贝伦妥单抗维多汀(brentuximab vedotin)、多柔比星、5-FU(氟尿嘧啶)、依维莫司、培美曲塞、美法仑、帕米膦酸钠、阿那曲唑、依西美坦、奈拉滨、奥法木单抗、贝伐单抗、贝林司他(belinostat)、托西莫单抗、卡莫司汀、博来霉素、博舒替尼、白消安、阿仑单抗、伊立替康、凡德他尼(vandetanib)、比卡鲁胺、洛莫司汀、柔红霉素、氯法拉滨、卡博替尼、更生霉素、雷莫芦单抗(ramucirumab)、阿糖孢苷、癌得星(cytoxan)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、地西他滨、地塞米松、多西他赛、羟基脲、氨烯咪胺、亮丙瑞林、表柔比星、奥沙利铂、天冬酰胺酶、雌莫司汀、西妥昔单抗、维莫德吉(vismodegib)、天冬酰胺酶菊欧氏杆菌(asparginase Erwinia chrysanthemi)、氨磷汀、依托泊苷、氟他胺、托瑞米芬、氟维司群、来曲唑、地加瑞克(degarelix)、普拉曲沙、甲氨蝶呤、氟尿苷、奥比妥珠单抗、吉西他滨、阿法替尼、伊马替尼甲磺酸(imatinib mesylatem)、卡莫司汀、艾瑞布林(eribulin)、曲妥珠单抗、六甲蜜胺、拓扑替康、帕纳替尼、伊达比星、异环磷酰胺、依鲁替尼、阿西替尼、干扰素α-2a、吉非替尼、罗米地辛(romidepsin)、伊沙匹隆、鲁索利替尼、卡巴他塞、阿多-曲妥珠单抗恩他新、卡非佐米、苯丁酸氮芥、沙格司亭、克拉屈滨、米托坦、长春新碱、丙卡巴肼、甲地孕酮、曲美替尼(trametinib)、美司钠(mesna)、锶-89氯化物、氮芥(mechlorethamine)、丝裂霉素、白消安、吉妥珠单抗奥佐米星、长春瑞滨、非格司亭(filgrastim)、乙二醇化非格司亭、索拉非尼、尼鲁米特、喷司他丁、它莫西芬、米托蒽醌、培门冬酶、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)、阿利维A酸、卡铂、帕妥珠单抗、顺铂、泊马度胺(pomalidomide)、强的松、阿地白介素、巯嘌呤、唑来磷酸、来那度胺、利妥昔单抗、奥曲肽(octretide)、达沙替尼、瑞格非尼、组氨瑞林、舒尼替尼、司妥昔单抗(siltuximab)、奥马他辛(Omacetaxine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)(硫鸟嘌呤(tioguanine))、达拉菲尼、埃罗替尼、蓓萨罗丁(bexarotene)、替莫唑胺、噻替派、萨力多胺(thalidomide)、BCG、西罗莫司(temsirolimus)、盐酸苯达莫司汀、曲普瑞林、三氧化二砷、拉帕替尼、戊柔比星(valrubicin)、帕尼单抗、长春花碱、硼替佐米、维A酸、阿扎胞苷、帕唑帕尼、替尼泊苷、亚叶酸、克里唑蒂尼(crizotinib)、卡培他滨、恩杂鲁胺(enzalutamide)、伊匹单抗、戈舍瑞林、伏立诺他(vorinostat)、艾代拉利司(idelalisib)、色瑞替尼(ceritinib)、阿比特龙、埃博霉素、他氟泊苷(tafluposide)、硫唑嘌呤、去氧氟尿苷、长春地辛以及全反式维甲酸。

[0170] CDKL5融合蛋白和助剂的有效量

[0171] 药物配制品可以含有治疗有效量的CDKL5融合蛋白，和任选地治疗有效量的助剂。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白的治疗有效量可以在从约1μg/kg至约10mg/kg的范围内。
在另外的实施例中，CDKL5融合蛋白的治疗有效量可以在从约1ng/g体重至约0.1mg/g体重的范围内。CDKL5融合蛋白的治疗有效量可以在从约1pg至约10g的范围内。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白或含有此CDKL5融合蛋白的药物组合物的治疗有效量可以在约10nL至约
10mL的范围内。

[0172] 对于一些实施例，治疗有效量可以是从约20至约50ng/注射，诸如针对脑室内注射而言。在其他实施例中，治疗有效量可以是约10微升/注射，诸如针对脑室内注射而言。在另外的实施例中，治疗有效量可以是约5ng/μL，诸如针对脑室内注射而言。在又一另外的实施例中，针对脑室内注射而言，治疗有效量可以是约1.9μg/kg体重。

[0173] 在其他实施例中，治疗有效量可以是从约1至约2微克/注射，诸如针对全身性给予的注射而言。在另外的实施例中，治疗有效量可以是约200至约300μL/注射，诸如针对全身性给予的注射而言。在一些实施例中，治疗有效量可以是约5ng/μL，诸如针对全身性注射而言。对于一些实施例，治疗有效量可以是从约1至约1.5μg/5g体重。在一些实施例中，治疗有效量可以是从约200μg至约300μg/kg体重。

[0174] 在其中除CDKL5融合蛋白之外药物配制品中还含有辅助活性剂的实施例中，辅助活性剂的治疗有效量将根据辅助活性剂而变化。在一些实施例中，辅助活性剂的有效量在从0.001微克至约1毫克的范围内。在其他实施例中，辅助活性剂的有效量在从约0.01IU至约10000IU的范围内。在另外的实施例中，辅助活性剂的有效量在从0.001mL至约1mL的范围内。在又其他实施例中，辅助活性剂的有效量在总药物配制品的从约1％w/w至约50％w/w的范围内。在另外的实施例中，辅助活性剂的有效量在总药物配制品的从约1％v/v至约50％v/v的范围内。在再其他实施例中，辅助活性剂的有效量在总药物配制品的从约1％w/v至约50％w/v的范围内。

[0175] 剂型

[0176] 在一些实施例中，在此所述的药物配制品可以呈剂型形式。剂型可以适于通过任何适当路径的给予。适当路径包括但不限于口服(包括颊内和舌下)、直肠、硬膜外、颅内、眼内、吸入、鼻内、局部(包括颊内、舌下或经皮)、阴道、尿道内、肠胃外、颅内、皮下、肌内、静脉内、腹膜内、皮内、骨内、心内、关节内、海绵窦内(intracavernous)、鞘内、玻璃体内(intravireal)、脑内和脑室内以及皮内。此类配制品可以通过本领域已知的任何方法来制备。

[0177] 适于口服给予的剂型可以是离散的剂量单位诸如胶囊、药丸或片剂、粉剂或颗粒、呈水性或非水性液体的溶液或悬浮液；可食的泡沫剂或气泡体(whips)，或呈水包油液体乳液或油包水液体乳液形式。在一些实施例中，适于口服给予的药物配制品还包含调味、防腐、着色或有助于分散药物配制品的一种或多种试剂。被制备用于口服给予的剂型还可以呈可以作为泡沫、喷雾或液体溶液来递送的液体溶液形式。在一些实施例中，口服剂型可以含有约1ng至1000g的药物配制品，该药物配制品含有治疗有效量或其适当部分的CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物。口服剂型可以被给予至有需要的受试者。

[0178] 在适当的情况下，在此所述的剂型可以进行微胶囊化。还可以制备剂型来延长或持续任何成分的释放。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白是释放得以延缓的成分。在其他实施例中，任选包含的辅助成分的释放被延缓。用于延缓成分的释放的适合方法包括但不限于用聚合物、蜡、凝胶等将成分包衣或包埋在材料中。缓释剂量配制品可以如标准参考文献诸如以下各项中所述来制备：“药物剂型片剂(Pharmaceutical dosage form tablets)”，利伯曼(Liberman)等人编著(纽约(New York)，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)，1989)，“雷明顿-药物科学与实践(Remington–The science and practice of pharmacy)”，第20版，利平科特威廉姆斯和威尔金斯出版社(Lippincott Williams&Wilkins)，巴尔的摩(Baltimore)，MD，2000，以及“药物剂型和药物递送系统(Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems)”，第6版，安西尔(Ansel)等人(宾夕法尼亚州传媒(Media,PA)：威廉姆斯和威尔金斯出版社，1995)。这些参考文献提供了关于用于制备片剂和胶囊以及片剂和药丸、胶囊和颗粒的缓释剂型的赋形剂、材料、设备和方法的信息。缓释可以是在从约一小时至约3小时或更长的任一时候。

[0179] 适合的包衣材料的实例包括但不限于纤维素聚合物，诸如邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素以及乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素；聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及以商品名(罗姆药厂(Rohm Pharma)，魏特尔斯塔特(Westerstadt)，德国(Germany))商购获得的甲基丙酸烯树脂、玉米素、紫胶以及多糖类。

[0180] 在存在或不存在水不溶性/水溶性非聚合物赋形剂的情况下，可以用不同比率的水溶性聚合物、水不溶性聚合物和/或pH依赖性聚合物形成包衣以产生所希望的释放曲线。包衣在剂型(基质或简单的)上进行，该剂型包括但不限于片剂(用或不用包衣珠压缩)、胶囊(具有或不具有包衣珠)、珠剂、粒子组合物，被配制为但不限于悬浮液形式或配制为喷撒剂型的“原样成分”。

[0181] 适于局部给予的剂型可以配制为软膏、乳膏、悬浮液、洗剂、粉剂、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油剂。在一些实施例中，对于眼睛或其他外部组织，例如口或皮肤的治疗，药物配制品作为局部软膏或乳膏来施用。当配制在软膏中时，CDKL5融合蛋白、辅助活性成分和/或其药学上可接受的盐可以与石蜡或水可混溶性软膏基质一起配制。在其他实施例中，活性成分可以与水包油乳膏基质或油包水基质一起配制在乳膏中。适于口中的局部给予的剂型包括锭剂、软锭剂以及漱口剂。

[0182] 适于鼻给予或吸入给予的剂型包括气雾剂、溶液、混悬滴剂、凝胶或干燥粉末。在一些实施例中，适于吸入的剂型中的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、辅助活性成分和/或其药学上可接受的盐呈减小了粒径的形式，该形式是通过微粉化获得或可获得的。在一些实施例中，大小减小(例如微粉化)的化合物或其盐或溶剂化物的粒径是由如通过本领域已知的适当方法所测量的约0.5至约10微米的D50值限定的。适于吸入给予的剂型还包括细粒粉尘或薄雾。其中载体或赋形剂是用于作为鼻喷雾剂或滴剂给予的液体的适合剂型包括活性成分的水性或油性溶液/悬浮液，其可以通过不同类型的计量加压喷雾器、雾化器或吹入器产生。

[0183] 在一些实施例中，剂型是适于吸入给予的气雾剂配制品。在这些实施例中的一些中，气雾剂配制品含有CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和/或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的水性或非水性溶剂的溶液或细悬浮液。气雾剂配制品可以灭菌形式的单剂量或多剂量提供于密封容器中。对于这些实施例中的一些，密封容器是单剂量或多剂量的鼻或配备有计量阀门(例如计量吸入器)的气雾剂分配器，一旦容器中的内容物被耗尽即可将它丢弃。

[0184] 在气雾剂剂型包含在气雾剂分配器中的情况下，分配器含有处于压力下的适合推进剂，诸如压缩空气、二氧化碳或有机推进剂(包括但不限于氢氟烃)。其他实施例中的气雾剂配制品剂型包含在泵雾化器中。加压的气雾剂配制品也可以含有CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物或其药物配制品的溶液或悬浮液。在另外的实施例中，气雾剂配制品还含有被掺入以改善配制品的例如稳定性和/或味觉和/或微粒子质量特征(量和/或分布图)的共溶剂和/或改性剂。气雾剂配制品的给予可以是每日一次或每日数次，例如每日2、3、4或8次，其中每次递送1、2或3个剂量。

[0185] 对于适合和/或适于吸入给予的一些剂型，药物配制品是可吸入的干燥粉末配制品。除CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、辅助活性成分和/或其药学上可接受的盐之外，此类剂型可以含有粉末基质诸如乳糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和/或淀粉。在这些实施例的一些中，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、辅助活性成分和/或其药学上可接受的盐是呈减小了粒径的形式。在另外的实施例中，性能改性剂是诸如L-亮氨酸或另一种氨基酸、八醋酸纤维二糖酯和/或硬脂酸的金属盐诸如硬脂酸镁或硬脂酸钙。

[0186] 在一些实施例中，气雾剂配制品被安排使得每次计量的气雾剂剂量含有预定量的活性成分，诸如在此所述的CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物中的一种或多种。

[0187] 适于阴道给予的剂型可以作为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾配制品提供。适于直肠给予的剂型包括栓剂或灌肠剂。

[0188] 适于肠胃外给予和/或适于任何注射类型(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、皮内、骨内、硬膜外、心内、关节内、海绵窦内、鞘内、玻璃体内、脑内和脑室内)的剂型可以包括水性和/或非水性无菌注射溶液，这些溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使该组合物与受试者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，这些悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。适于肠胃外给予的剂型可以提供于单一单位剂量或多单位剂量容器中，包括但不限于密封的安瓿或小瓶。可以将这些剂量冻干并且重悬于无菌载体中以在给予之前重构剂量。在一些实施例中，可以由无菌粉剂、颗粒和片剂制备临时的注射溶液和悬浮液。

[0189] 适于眼部给予的剂型可以包括水性和/或非水性无菌溶液，这些溶液可以任选地适于注射，并且这些溶液可以任选地含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使该组合物与受试者的眼部或眼部中含有的或眼部周围的流体等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，这些悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。

[0190] 对于一些实施例，剂型含有预定量的CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物/单位剂量。在一个实施例中，CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物的预定量是CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物的用于治疗或预防CDKL5缺陷、Rett综合征和/或其症状的治疗有效量。在其它实施例中，CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物的预定量可以是活性成分的治疗有效量的适当部分。因此，此类单位剂量可以每日给予一次或多于一次。此类药物配制品可以通过本领域熟知的任何方法来制备。

[0191] 使用TATk-CDKL5组合物和配制品对神经系统病症的治疗

[0192] 在此所述的CDKL5融合蛋白和其药物配制品可以用于治疗和/或预防受试者的疾病、病症、综合征或其症状。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白和其药物配制品可以用于治疗和/或预防CDKL5缺陷、Rett综合征、Rett综合征的变体和/或其症状。在一些实施例中，受试者患有CDKL5缺陷、Rett综合征、Rett综合征的变体和/或其症状。

[0193] 一定量的在此所述的CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以每天、每周、每月或每年向有需要的受试者给予一次或多次。在一些实施例中，给予的量可以是CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品的治疗有效量。例如，CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以日剂量来给予。此量可以单剂量/天给出。在其他实施例中，日剂量可以是经多剂量/天来给予，其中各剂量含有待给予的总日剂量的一部分(亚剂量)。在一些实施例中，每天递送的剂量的量是2、3、4、5或6个。在另外的实施例中，化合物、配制品或其盐每周给予一次或多次，诸如每周1、2、3、4、5或6次。在其他实施例中，CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以每月给予一次或多次，诸如每月1至5次。在再另外的实施例中，CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以每年给予一次或多次，诸如每年1至11次。

[0194] CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以通过任何方便的路径与第二试剂共同给予。第二试剂是单独于CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品的化合物和/或配制品。第二试剂可以与CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品同时给予。第二试剂可以与CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品依序给予。第二试剂可以与CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品具有累加或协同效应。适合的第二试剂包括但不限于抑制必要的肿瘤蛋白质和基因的翻译和转录的DNA、RNA、氨基酸、肽、多肽、抗体、适配子、核糖核酸酶、核糖核酸酶的指导序列、激素、免疫调节剂、解热药、抗焦虑剂、抗精神病药、镇痛药、镇痉药、抗炎药、抗组胺药、抗感染药、以及化疗药物。在一些实施例中，第二试剂是DCA。

[0195] 适合的激素包括但不限于氨基酸衍生的激素(例如，褪黑激素和甲状腺素)、小肽激素和蛋白质激素(例如促甲状腺激素释放激素、抗利尿激素、类胰岛素、生长激素、促黄体激素、促卵泡激素以及促甲状腺激素)、类花生酸类(例如花生油酸、脂氧素和前列腺素)以及类固醇激素(例如雌二醇、睾酮、四氢睾酮皮质醇)。

[0196] 适合的免疫调节剂包括但不限于泼尼松、硫唑嘌呤、6-MP、环孢霉素、他克莫司、甲氨蝶呤、白介素(例如IL-2、IL-7和IL-12)、细胞因子(例如干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω和IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子以及咪喹莫特)、趋化因子(例如CCL3、CCL26和CXCL7)、胞嘧啶磷酸盐-鸟苷、寡脱氧核苷酸、葡聚糖、抗体以及适配子)。

[0197] 适合的解热药包括但不限于非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、阿司匹林和相关的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)、对乙酰氨基酚/醋氨酚、美他米佐、萘丁美酮、安替比林以及奎宁。

[0198] 适合的抗焦虑剂包括但不限于苯并二氮卓(例如阿普唑仑、溴西潘、利眠宁、氯硝西泮、氯氮卓、地西泮、氟西泮、劳拉西泮、奥沙西泮、替马西泮、三唑仑和托非索泮)、5-羟色胺能抗抑郁药(例如选择性5-羟色胺再吸收抑制剂、三环抗抑郁药和单胺氧化酶抑制剂)、梅比卡、afobazole、selank、布罗曼坦、3-羟基-6-甲基-2-乙基盐酸吡啶、阿扎哌隆、巴比妥酸盐、羟嗪、普瑞巴林、伐力多以及β阻断剂。

[0199] 适合的抗精神病药包括但不限于苯哌利多、溴哌利多、氟哌利多、氟哌啶醇、莫哌隆、匹泮哌隆、替米哌隆、氟司必林、五氟利多、匹莫齐特、乙酰丙嗪、氯丙嗪、氰美马嗪、dizyrazine、氟奋乃静、左美丙嗪、甲砜哒嗪、培拉嗪、哌氰嗪、奋乃静、哌泊噻嗪、丙氯拉嗪、普马嗪、异丙嗪、丙硫喷地、硫丙拉嗪、甲硫达嗪、三氟拉嗪、三氟丙嗪、氯普噻吨、氯哌噻吨、氟哌噻吨、替沃噻吨、珠氯噻醇、氯噻平、克塞平、丙硫喷地、卡匹帕明、氯卡帕明、吗啉吲酮、莫沙帕明、舒必利、维拉必利、氨磺必利、阿莫沙平、阿立哌唑、阿塞那平、氯氮平、布南色林、伊潘立酮、鲁拉西酮、美哌隆、奈莫必利、奥氮平、帕潘立酮、哌罗匹隆、奎硫平、瑞莫必利、利培酮、舍吲哚、曲米帕明、齐拉西酮、佐替平、alstonie、百分普那、比托派汀、依匹唑派、大麻二酚、卡利拉嗪、匹莫范色林、pomaglumetad methionil、戊卡色林、呫诺美林以及奇洛那平。

[0200] 适合的镇痛药包括但不限于对乙酰氨基酚/醋氨酚、非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔、塞来考昔和艾托考昔)、阿片样物质(例如吗啡、可待因、羟考酮、氢可酮、双氢吗啡、哌替啶、丁丙诺啡)、曲马朵、去甲肾上腺素、flupiretine、奈福泮、奥芬那君、普瑞巴林、加巴喷丁、环苯扎林、东莨菪碱、美沙酮、凯托米酮、哌腈米特和阿司匹林以及相关的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)。

[0201] 适合的镇痉药包括但不限于美贝维林、罂粟碱、环苯扎林、卡立普多、奥芬那君、替扎尼定、美他沙酮、美索巴莫、氯唑沙宗、巴氯芬、丹曲林、巴氯芬、替扎尼定以及丹曲林。

[0202] 适合的抗炎药包括但不限于泼尼松、非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔、塞来考昔和艾托考昔)以及免疫选择性抗炎衍生物(例如下颌下腺肽-T及其衍生物)。

[0203] 适合的抗组胺药包括但不限于H1-受体拮抗剂(例如阿伐斯汀、氮卓斯汀(azelastine)、比拉斯汀(bilastine)、溴苯那敏、布克力嗪、溴苯醇胺、卡比沙明、西替利嗪、氯丙嗪、赛克利嗪(cyclizine)、氯苯那敏、克立马丁(clemastine)、赛庚啶、地洛他定、右溴苯那敏(dexbromapheniramine)、右氯苯那敏、茶苯海明、二甲茚定、苯海拉明、抗敏安(doxylamine)、依巴斯汀(ebasine)、恩布拉敏(embramine)、非索非那定、羟嗪、左旋西替利嗪(levocetirzine)、氯雷他定(loratadine)、美克洛嗪、米氮平、奥洛他定、奥芬那君、苯茚胺、非尼拉敏、苯托沙敏、异丙嗪、吡拉明(pyrilamine)、喹硫平、卢帕他定、曲吡那敏(tripelennamine)和曲普利啶(triprolidine))、H2-受体拮抗剂(例如西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁、拉呋替丁、尼扎替丁(nizatidine)、雷尼替丁(rafitidine)和罗沙替丁(roxatidine))、曲托喹啉、儿茶素(catechin)、色甘酸盐、奈多罗米以及β2-肾上腺素能激动剂。

[0204] 适合的抗感染药包括但不限于抗阿米巴药(硝唑尼特、巴龙霉素、甲硝唑、替硝唑、氯喹、米替福新、两性霉素b和双碘喹啉)、氨基糖苷类(例如巴龙霉素、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素和新霉素)、打虫药(例如噻嘧啶、甲苯达唑、伊佛霉素、吡喹酮、阿苯哒唑、噻苯达唑、奥沙尼喹)、抗真菌药(例如唑类抗真菌药(例如依曲康唑、氟康唑、泊沙康唑、酮康唑、克霉唑、咪康唑和伏立康唑)、棘白霉素(例如卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净)、灰黄霉素、特比萘芬、氟胞嘧啶，以及多烯类(例如制真菌素和两性霉素b))、抗疟剂(例如乙胺嘧啶/磺胺多辛、蒿甲醚/苯芴醇、阿托伐醌/氯胍、奎宁、羟氯喹、甲氟喹、氯喹、多西环素、乙胺嘧啶和卤泛曲林)、抗痨剂(例如氨基水杨酸盐(例如氨基水杨酸)、异烟肼/利福平、异烟肼/吡嗪酰胺/利福平、贝达喹啉、异烟肼、乙胺丁醇、利福平、利福布汀、利福喷汀、卷曲霉素和环丝氨酸)、抗病毒药(例如金刚烷胺、金刚烷乙胺、阿巴卡韦/拉米夫定、恩曲他滨/替诺福韦、考比泰特/埃替格韦/恩曲他滨/替诺福韦、依法韦仑/恩曲他滨/替诺福韦、阿巴卡韦/拉米夫定/齐多夫定、拉米夫定/齐多夫定、恩曲他滨/替诺福韦、恩曲他滨/罗匹那韦/利托那韦/替诺福韦、干扰素α2v/利巴韦林、聚乙二醇干扰素α-2b、马拉韦罗、雷特格韦、德罗格韦、恩夫韦地、膦甲酸、福米韦生、奥司他韦、扎那米韦、奈韦拉平、依法韦仑、依曲韦林、利匹韦林、地拉韦啶、奈韦拉平、恩替卡韦、拉米夫定、阿德福韦、索非布韦、地达诺新、替诺福韦、avacivr、齐多夫定、司他夫定、恩曲他滨、扎西他滨、替比夫定、西米普韦、波西普韦、特拉匹韦、洛匹那韦/利托那韦、弗沙那韦、瑞纳韦、利托那韦、替拉那韦、阿扎那韦、奈非那韦、安瑞那韦、茚地那韦、沙喹那韦、利巴韦林、伐昔洛韦、阿昔洛韦、泛昔洛韦、更昔洛韦和缬更昔洛韦)、碳青霉烯类(例如多利培南、美罗培南、厄他培南和西司他丁/亚胺培南)、头孢菌素类(例如头孢羟氨苄、头孢拉啶、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢吡肟、头孢洛林、氯碳头孢、头孢替坦、头孢呋辛、头孢罗齐、氯碳头孢、头孢西丁、头孢克洛、头孢布烯、头孢曲松、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克肟、头孢托仑、头孢唑肟和头孢他啶)、糖肽抗生素(例如万古霉素、达巴万星、奥利万星和替拉万星)、甘氨环素类(例如替加环素)、抗麻风药(例如氯法齐明和萨力多胺)、洁霉素及其衍生物(例如克林霉素和洁霉素)、大环内酯类及其衍生物(例如泰利霉素、非达霉素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素和醋竹桃霉素)、利奈唑胺、磺胺甲噁唑/甲氧苄氨嘧啶、利福昔明、氯霉素、磷霉素、甲硝唑、氨曲南、杆菌肽、青霉素类(阿莫西林、氨比西林、巴氨西林、羧苄西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林/克拉维酸、氨比西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、克拉维酸/替卡西林、青霉素、普鲁卡因青霉素、苯唑西林、双氯西林和萘夫西林)、喹诺酮类(例如洛美沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、qatifloxacin、莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、吉米沙星、莫西沙星、西诺沙星、萘啶酸、依诺沙星、格雷沙星、加替沙星、曲伐沙星和司帕沙星)、磺酰胺类(例如磺胺甲噁唑/甲氧苄氨嘧啶、柳氮磺胺吡啶和磺胺异噁唑)、四环素类(例如多西环素、地美环素、米诺环素、多西环素/水杨酸、多西环素/ω-3多不饱和脂肪酸和四环素)以及尿道抗感染药(例如呋喃咀啶、乌洛托品、磷霉素、西诺沙星、萘啶酸、甲氧苄氨嘧啶和亚甲基蓝)。

[0205] 适合的化学药物包括但不限于紫杉醇、贝伦妥单抗维多汀、多柔比星、5-FU(氟尿嘧啶)、依维莫司、培美曲塞、美法仑、帕米膦酸钠、阿那曲唑、依西美坦、奈拉滨、奥法木单抗、贝伐单抗、贝林司他、托西莫单抗、卡莫司汀、博来霉素、博舒替尼、白消安、阿仑单抗、伊立替康、凡德他尼、比卡鲁胺、洛莫司汀、柔红霉素、氯法拉滨、卡博替尼、更生霉素、雷莫芦单抗、阿糖孢苷、癌得星、环磷酰胺、地西他滨、地塞米松、多西他赛、羟基脲、氨烯咪胺、亮丙瑞林、表柔比星、奥沙利铂、天冬酰胺酶、雌莫司汀、西妥昔单抗、维莫德吉、天冬酰胺酶菊欧氏杆菌、氨磷汀、依托泊苷、氟他胺、托瑞米芬、氟维司群、来曲唑、地加瑞克、普拉曲沙、甲氨蝶呤、氟尿苷、奥比妥珠单抗、吉西他滨、阿法替尼、伊马替尼甲磺酸、卡莫司汀、艾瑞布林、曲妥珠单抗、六甲蜜胺、拓扑替康、帕纳替尼、伊达比星、异环磷酰胺、依鲁替尼、阿西替尼、干扰素α-2a、吉非替尼、罗米地辛、伊沙匹隆、鲁索利替尼、卡巴他塞、阿多-曲妥珠单抗恩他新、卡非佐米、苯丁酸氮芥、沙格司亭、克拉屈滨、米托坦、长春新碱、丙卡巴肼、甲地孕酮、曲美替尼、美司钠、锶-89氯化物、氮芥、丝裂霉素、白消安、吉妥珠单抗奥佐米星、长春瑞滨、非格司亭、乙二醇化非格司亭、索拉非尼、尼鲁米特、喷司他丁、它莫西芬、米托蒽醌、培门冬酶、地尼白介素-毒素连接物、阿利维A酸、卡铂、帕妥珠单抗、顺铂、泊马度胺、强的松、阿地白介素、巯嘌呤、唑来磷酸、来那度胺、利妥昔单抗、奥曲肽、达沙替尼、瑞格非尼、组氨瑞林、舒尼替尼、司妥昔单抗、奥马他辛、硫鸟嘌呤(硫鸟嘌呤)、达拉菲尼、埃罗替尼、蓓萨罗丁、替莫唑胺、噻替派、萨力多胺、BCG、西罗莫司、盐酸苯达莫司汀、曲普瑞林、三氧化二砷、拉帕替尼、戊柔比星、帕尼单抗、长春花碱、硼替佐米、维A酸、阿扎胞苷、帕唑帕尼、替尼泊苷、亚叶酸、克里唑蒂尼、卡培他滨、恩杂鲁胺、伊匹单抗、戈舍瑞林、伏立诺他、艾代拉利司、色瑞替尼、阿比特龙、埃博霉素、他氟泊苷、硫唑嘌呤、去氧氟尿苷、长春地辛以及全反式维甲酸。

[0206] 在其中CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品与第二试剂同时地共同给予的实施例中，CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以在与第二试剂基本上相同的时间下向受试者给予。如在此背景下所用，“基本上相同的时间”是指CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品与第二试剂的给予，其中CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品与第二试剂的给予之间的时间段处于0与10分钟之间。

[0207] 在其中CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品与第二试剂依序地共同给予的实施例中，可以首先给予CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品，并且然后在一段时间之后给予第二试剂。在其中CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品与第二试剂依序地共同给予的其他实施例中，可以首先给予第二试剂，并且然后在一段时间之后给予CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品。在任何实施例中，CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品与第二试剂的给予之间的时间段可以在从10分钟至约96小时之间。在一些实施例中，时间段可以是约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时或约12小时。可以根据需要在治疗周期过程内重复依序给予。

[0208] 可被给予的CDKL5融合蛋白、组合物、其药物配制品的量在此其他地方进行描述。第二试剂的量将根据第二试剂变化。第二试剂的量可以是治疗有效量。在一些实施例中，第二试剂的有效量在从0.001微克至约1毫克的范围内。在其他实施例中，第二试剂的量在从约0.01IU至约10000IU的范围内。在另外的实施例中，第二试剂的量在从0.001mL至约1mL的范围内。在又其他实施例中，第二试剂的量在总药物配制品的从约1％w/w至约50％w/w的范围内。在另外的实施例中，第二试剂的量在总药物配制品的从约1％v/v至约50％v/v的范围内。在再其他实施例中，第二试剂的量在总的第二试剂组合物或药物配制品的从约1％w/v至约50％w/v的范围内。

[0209] 在一些实施例中，含有CDKL5融合蛋白的组合物或配制品经由注射给予至患者。适合的注射方法包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肌内、皮内、骨内、硬膜外、心内、关节内、海绵窦内、鞘内、玻璃体内、脑内和脑室内注射。含有CDKL5融合蛋白的组合物或配制品的其他适合的给予方法包括但不限于局部、经皮、经鼻或经口递送。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白的剂量在从约0.01μg/g体重至约10mg/g体重的范围内。

[0210] 在其他实施例中，CDKL5融合蛋白可以经由细胞疗法递送至需要治疗的患者。转向图3，该图3示出了经由自体细胞递送CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例。该方法通过体外培养细胞(8000)开始。优选地，细胞是自体细胞。在一个实施例中，自体细胞是神经元或神经元前体细胞，诸如神经干细胞。在一些实施例中，自体细胞是来源于诱导性多能干细胞的神经元。在其他实施例中，自体细胞是来源于脐带血干细胞的神经元。

[0211] 接着，用纯化的CDKL5融合蛋白转导培养细胞(8010)。在其他实施例中，通过将培养细胞暴露于如先前所述的含有CDKL5融合蛋白的培养基来转导培养细胞。在另外的实施例中，用含有CDKL5融合蛋白cDNA的适合载体转染培养细胞。然后将细胞培养适量时间以使得CDKL5融合蛋白表达(8020)。在一些实施例中，将细胞培养约6h至约96h。细胞培养之后，将一种或多种转导细胞给予至患者。

[0212] 在一个实施例中，使用外科技术将转导的自体神经元递送至脑。在一些实施例中，经由注射将一种或多种转导细胞给予至患者。在一些实施例中，配制品中包含一种或多种转导细胞。在一个实施例中，含有一种或多种转导细胞的配制品还包含药学上可接受的载体和/或活性剂。在一些实施例中，经由注射或使用外科技术将含有一种或多种转导细胞的配制品给予至患者。

[0213] 含有CDKL5融合蛋白和其配制品的试剂盒

[0214] 在此所述的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品可以作为组合试剂盒提供。如在此所用，术语“组合试剂盒”或“成套试剂盒”是指在此所述的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品以及用于包装、出售、市售、递送和/或给予包含于其中的元件组合或单一元件诸如活性成分的另外组件。此类另外的组件包括但不限于包装、注射器、泡包装、瓶子等。当同时给予包含在试剂盒中的一种或多种组分(例如活性剂)时，组合试剂盒可以含有在单一药物配制品(例如，片剂)中或在分开的药物配制品中的活性剂。

[0215] 组合试剂盒可以含有在分开组合物或药物配制品中的各试剂、组合物、药物配制品或其组分。分开的组合物或药物配制品可以包含在试剂盒内的单一包装中或分开的包装中。在一些实施例中还提供了缓冲剂、稀释剂、增溶试剂、细胞培养基以及其他试剂。这些另外的组分可以包含在试剂盒内的单一包装中或分开的包装中。

[0216] 在一些实施例中，组合试剂盒还包括印刷在有形表达介质上或以其他方式包含在该有形表达介质中的说明书。说明书可以提供关于包含于其中的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品，和/或其他助剂和/或第二试剂的含量的信息、关于包含于其中的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品，和/或其他助剂和/或第二试剂的含量的安全信息、关于包含于其中的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品，和/或其他助剂和/或第二试剂的剂量、使用适应症和/或一个或多个推荐的治疗方案的信息。在一些实施例中，说明书可以提供用于向患有CDKL5缺陷、Rett综合征和/或其症状的受试者给予CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品，和/或其他助剂和/或第二试剂的说明。

[0217] 无需进一步解释，据信本领域中技术人员可以基于在此的说明最大程度地利用本披露。强调的是，本披露的实施例，尤其是任何“优选”实施例仅仅是实施的可能性实例，仅仅是为了清楚地理解本披露的原理而阐述的。在实质上不背离本披露的精神和原理的情况下可以对本披露的一个或多个所披露实施例进行许多变化和修改。所有此类修改和变化都在本披露的范围之内。

[0218] 在本说明书中引用的所有公开物和专利通过引用结合在此，就好像每个单独的公开物或专利被确切地并单独地指示为通过引用结合，并且通过引用结合在此从而结合引用的公开物披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对在提交日之前的披露，并且不应理解为承认因为先前披露而本披露不能获得比这些公开物更早的申请日。此外，所提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期可能需要单独地确认。

[0219] 如将对于本领域技术人员清楚的是，在阅读本披露时，在此描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组成部分和特征，这些组成部分和特征可以在不偏离本披露的范围或精神的情况下易于与任何其他一些实施例的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。

[0220] 除非另外指明，否则本披露的实施例将采用分子生物学、微生物学、纳米技术学、有机化学、生物化学、植物学等的技术，这些技术是在本领域的技术之内。此类技术在文献中得到充分解释。

[0221] 实例

[0222] 提出以下实例来为本领域的普通技术人员提供如何执行方法和使用在此披露且要求保护的组合物和化合物的完整的披露内容和说明。以下实例仅被视为说明性的而不以任何方式来限定本披露的其余部分。已经做出努力来确保关于数字(例如量、温度等)的精确性，但一些误差和偏差也应当考虑。除非另外指明，否则份数是重量份，温度是以℃计并且压力是在大气压下或接近大气压。标准温度和压力被定义为20℃和1个大气压。

[0223] 实例1：TATk-CDKL5蛋白的产生和纯化。

[0224] 为了产生可递送的TAT-CDKL5融合蛋白，使用了合成的TATκ-PTD，其中TAT结构域中的弗林蛋白酶识别序列的突变实现了重组蛋白的分泌。观察到分泌的蛋白成功被靶细胞摄取。将含有人类CDKL5的TATk-CDKL5融合基因克隆到表达质粒pSecTag2(生命技术公司(Life Technologies))中。此质粒被设计成能够实现基因在哺乳动物宿主中的表达和靶蛋白的高表达水平。将表达自pSecTag2的蛋白质在N-末端处融合至鼠类Igκ链前导序列上，以用于培养基中的蛋白质分泌。用GFP蛋白标记TATk-CDKL5融合蛋白以允许使用抗-GFP抗体进行蛋白质印迹分析。为了有利于蛋白质纯化，TATk-CDKL5融合蛋白被构造成在TATk-GFP-CDKL5基因的C-末端区处包含myc标签和6xHis标签。使用标准质粒递送方法用TATk-GFP-CDKL5表达质粒转染HEK 293T细胞。在转染之后，使细胞在无血清培养基(高葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium))中生长。48小时之后，收集培养基，使用Amicon超离心过滤器(50kDa截留)对该培养基进行渗滤和浓缩。此方法允许缓冲液交换和分泌蛋白的富集。

[0225] 图4A和图4B展示了来自转染的HEK293T细胞中的TATk-GFP-CDKL5蛋白表达的蛋白质印迹分析结果。图4A展示了来自转染的HEK293T细胞的细胞均浆中的TATk-GFP-CDKL5融合蛋白表达。图4B展示了来自转染的HEK293T细胞的浓缩(20X)细胞培养基中的TATk-GFP-CDKL5融合蛋白聚集。

[0226] 实例2：TATk-CDKL5激酶活性的验证。

[0227] 为了纯化TATk-GFP-CDKL5蛋白，在TATk-GFP-CDKL5基因的C-末端区处添加myc标签和6xHis标签。在Ni-NTA树脂上从培养基中纯化TATk-GFP-CDKL5融合蛋白。已显示，CDKL5激酶具有高的自身磷酸化活性。如图5A和图5B(其示出了来自体外激酶活性测定的结果)中所示，纯化的TATk-GFP-CDKL5蛋白保留了其自身磷酸化活性。这证明了纯化的融合蛋白保留了其激酶活性。

[0228] 实例3：HEK293T细胞对TATk-CDKL5的内化。

[0229] 为了评价TATk-GFP-CDKL5融合蛋白的转导效率，将HEK 293T细胞与纯化/浓缩的融合蛋白一起孵育。简言之，如实例1中所述来产生并纯化TATk-GFP-CDKL5融合蛋白。将HEK 293细胞在含有融合蛋白的浓缩培养基中孵育。在不同的孵育时间之后，将细胞裂解并且将总的蛋白质提取物转移至硝化纤维膜以用于免疫印迹，从而对TATk-GFP-CDKL5蛋白进行定量。如图6中所示，在仅孵育约30分钟之后，TATk-GFP-CDKL5被细胞内化。平行处理了其他培养物并且进行固定、用抗-GFP特异性抗体进行免疫染色以可视化转导的TATk-GFP-CDKL5蛋白。如图7A-7B中所展示的，TATk-GFP-CDKL5蛋白被有效地易位到细胞中。靶细胞中的内化通过共聚焦显微镜(图8)来证实。将SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞在含有融合蛋白的浓缩培养基中孵育30分钟。图8示出了TATk-GFP-CDKL5转导的SH-SY5Y细胞的一系列共聚焦图像(1-
12)的图像，从而证明了TATk-GFP-CDKL5蛋白被靶细胞内化并且位于SH-SY5Y细胞的细胞核和细胞质两者中(图8)。

[0230] 实例4：TATk-CDKL5诱导分化并且抑制SHSY5Y成神经细胞瘤细胞系的增殖[0231] 尽管CDKL5对于中枢神经系统具有明显的重要性，但是此激酶的生物学功能大部分仍是未知的。CDKL5基因影响了神经细胞的增殖和分化两者(参见例如瓦利(Valli)等人，2012，生物化学与生物物理学学报(Biochim Biophys Acta.)，1819:1173-1185，以及里西(Rizzi)等人，2011，脑研究(Brain Res.)，1415:23-33)。成神经细胞瘤细胞与正常神经元享有若干个特征，并且因此被认为是用于研究神经元细胞的生物化学特性和功能特性的良好体外模型，特别是当它们在用试剂诸如视黄酸(RA)处理后而被诱导分化时(参见例如，辛格(Singh)，2007脑研究，1154，第8-21页；麦利诺(Melino)，1997，神经肿瘤学杂志(J.Neurooncol.)，31，第65-83页)。出于这些原因，采用成神经细胞瘤(neurobastoma)细胞来体外研究CDKL5功能。

[0232] 与实例3中所述的处理类似，用纯化的TATk-GFP-CDKL5处理SH-SY5Y细胞。在此，将SH-SY5Y细胞与含有纯化的TATk-GFP-CDKL5蛋白的浓缩培养基一起孵育约24小时。使用Hoecsht核染色将细胞增殖评价为有丝分裂指数(细胞中发生有丝分裂的群体的数目与细胞中不发生有丝分裂的数目之间的比率)。通过检查神经突生长(其是神经元分化的标志)来评价分化。对于神经突生长的分析，在存在或不存在促分化剂RA的情况下使细胞另外生长1-2天。使用图像分析系统测量神经突增生。

[0233] 与对照相比，CDKL5表达的诱导(通过TATk-GFP-CDKL5蛋白)对细胞增殖产生强的抑制(例如图9A-9B和图10)，同时不增加凋亡性细胞死亡(数据未示出)。此外，如图11A-11B和图12中所示，TATk-GFP-CDKL5促进了成神经细胞瘤细胞分化，如通过SH-SY5Y细胞的神经突增生所指明的。这些结果证明TATk-CDKL5在体外神经元模型中是具有功能性的。

[0234] 实例5：CDKL5-KO小鼠模型的表征

[0235] 最近在意大利蒙特罗顿多(Monterotondo,Italy)由科尼利厄斯格罗斯(Cornelius Gross)博士领导的组通过EMBL创建了CDKL5敲除小鼠模型(阿门多拉(Amendola)，2014，公共科学图书馆综合(PLoS One)，9(5):e91613)。为了建立CDKL5-缺失功能对新生神经元的树突发育的影响，检查了来源于CDKL5KO小鼠的新生海马颗粒细胞的树突形态。用双皮层蛋白(DCX)的免疫组织化学分析新生神经元的树突形态，利用了在神经突延长阶段过程中此蛋白质在成熟神经元的细胞质中的表达。如图13A-13B中所示，与野生型(+/Y)对应物(图13A)相比，CDKL5敲除小鼠(-/Y)的DCX阳性细胞表现出具有高度不成熟型式的树突树(图13B)。高度不成熟型式可以由很少的分支和延长表明。CDKL5的不存在使得DCX阳性细胞数目减少(图13B)，这是由于凋亡性细胞死亡增加(数据未示出)，观察到该增加影响了有丝分裂期后的不成熟的颗粒神经元(DCX阳性细胞)(富克斯(Fuchs)，2014，疾病神经生物学(Neurobiol Dis.)，70，第53–68页)。此数据表明CDKL5通过影响神经前体存活和新生神经元的成熟而对出生后神经发生具有基础性作用。观察到来自Cdkl5敲除小鼠的室下区(subventricolar zone)(SVZ)的神经元前体细胞(NPC)的培养物表现出体内观察到的小脑颗粒细胞前体中的相同缺陷。换句话说，在来源于野生型小鼠(+/+)的神经元前体细胞的培养物中，存在比来源于CDKL5KO(-/-)小鼠的神经元前体细胞的培养物中更多的神经元(β-微管蛋白III阳性细胞，红色细胞)(图14A和图14B)。这表明CDKL5的缺失降低了有丝分裂期后的神经元的存活率。对β-微管蛋白III阳性细胞中神经突增生的评估证明与野生型神经元相比，由Cdkl5敲除NPC产生的神经元分化较少(图14A和图14B)。这些结果表明来自CDKL5敲除小鼠的有丝分裂期后的NPC不仅在细胞存活方面而且在神经元成熟方面都具有本征缺陷。

[0236] 实例6：TATk-CDKL5蛋白恢复来源于CDKL5KO小鼠的神经元细胞前体的神经突发育。

[0237] 用TATk-GFP-CDKL5或TATk-GFP处理来自CDKL5KO(-/-)小鼠和野生型(+/+)小鼠的神经元前体细胞培养物。通过测量分化的神经元(对β-微管蛋白III呈阳性)的总神经突长度来评价。通过使用图像分析系统图像Pro Plus(媒体控制公司(Media Cybernetics)，银泉(Silver Spring)，马里兰州(MD)，20910，美国(USA))进行了神经突长度的评价。通过用总神经突长度除以区中所计数的细胞数目来计算平均神经突长度/细胞。如图15A-15C和图16中所示，CDKL5的不存在使得新神经元的成熟减少并且用TATk-CDKL5的处理恢复了神经突发育。

[0238] 实例7：TATk-CDKL5向小鼠脑中的递送。

[0239] 用单剂量的使用TATk-GFP-CDKL5、TATk-GFP转染的HEK293T细胞的培养基或来自未转染的细胞的培养基(媒介物)皮下注射七日龄小鼠幼崽(单剂量对应于约200μl的200x浓缩培养基；其可含有约1-1.5μg的融合蛋白)。在48小时之后收集来自转染的培养基并且用Amicon超离心过滤器(50kDa截留)对该培养基进行渗滤和浓缩。给予处理后4小时，将小鼠处死。将脑储存在固定剂中24小时，沿着中线切割并且在于磷酸盐缓冲液中的20％的蔗糖中再保存24小时。将半球冷冻并且储存在-80℃下。用冷冻切片机将右半球切割为30μm厚的冠状切片。在自由漂浮的切片上进行免疫组织化学。通过使用抗-GFP抗体和TSA扩增试剂盒的免疫组织化学来评价脑中的TATk-GFP-CDKL5和TATk-GFP的定位。图像在感觉运动皮层和小脑的水平处获取。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染细胞。展示出TATk-GFP-CDKL5蛋白在小鼠的感觉运动皮层和小脑中的存在的代表性图像分别示出在图17A-17F和图18A-18D中。考虑到TATk-GFP-CDKL5蛋白是皮下给予的，此数据证明TATk-GFP-CDKL5蛋白有效地转运跨过血脑屏障并且进入脑细胞中。

[0240] 实例8：在体内TATk-CDKL5融合蛋白对神经元成熟、存活和连通性的影响[0241] 用TATk-GFP-CDKL5或TATk-GFP对成年小鼠(4-6月龄)连续5天进行脑室内注射(图19)(参见例如图20的实验时间表)。简言之，用氯胺酮(100–125mg/kg)和甲苯噻嗪(10–
12.5mg/kg)麻醉小鼠。将插管(0.31mm直径，脑灌注试剂盒III；Alzet，库栢蒂诺(Cupertino)，加利福尼亚州(CA))立体定位地植入到侧脑室中(A/P–0.4mm尾部，M/L1.0mm，D/V–2.0mm；图19)。植入后七天，通过使用连接至机动化的纳米注射器(以0.5μl/min的速率)的汉密尔顿氏注射器用10μl(约50ng)的于PBS中的TATk-GFP-CDKL5或TATk-GFP对小鼠连续5天进行灌注。最后注射后四小时，将动物处死，并且使用DCX的免疫组织化学分析新生海马颗粒细胞的树突形态。图21和图22证明与野生型对应物的DCX阳性神经元相比，Cdkl5KO小鼠的DCX阳性神经元具有更短的突起(process)(图21A-21B和图22A-22B)。观察到连续五天脑室内给予TATk-GFP-CDKL5融合蛋白将CDKL5敲除小鼠(图22C)中神经突长度和神经突分支数目增加到类似于野生型(图22A)的水平。图23A-23B示出了以下各项的新生颗粒细胞的重构树突树的实例：野生型(+/Y)(图23A)、半合子型CDKL5敲除小鼠(-/Y)(图
23B)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白处理的半合子型CDKL5敲除雄性小鼠。

[0242] DCX阳性细胞的树突大小的定量证明与野生型小鼠(图24A和图24B)相比，CDKL5敲除小鼠(-/Y)具有更短的树突长度(图24A)和减少的区段数目(图24B)。在TATk-GFP-CDKL5处理的CDKL5敲除小鼠(-/Y)中，两个参数都存在增加，与+/Y小鼠相比甚至变得更大(图24A-24B)。通过分别评价每个树突级来检查TATk-GFP-CDKL5处理对树突构造的细节的影响。CDKL5KO小鼠的显著特征是不存在更高级的分支(图25A-25B；红色箭头)。虽然野生型(+/Y)小鼠具有高达10级的分支，但是CDKL5敲除小鼠(-/Y)缺乏8-10级的分支(图25A，箭头)。此外，CDKL5敲除小鼠(-/Y)显示出减小的5-8级的分支长度(图25A)和减小的6-8级的分支数目(图25B)。一起考虑，这些数据表明在Cdkl5KO小鼠中，新生颗粒细胞的树突树具有发育障碍并且此缺陷是归因于中级分支数目和长度的减小以及更高级分支的缺乏。观察到所有这些缺陷被TATk-GFP-CDKL5处理完全挽救(图25A至25B)。

[0243] 为了评价TATk-GFP-CDKL5处理对凋亡性细胞死亡的影响，我们计数了海马齿状回中的表达裂解的半胱天冬酶-3的凋亡细胞的数目(图26)。裂解的半胱天冬酶-3细胞的定量显示TATk-GFP-CDKL5处理完全使CDKL5敲除小鼠(-/Y)中的凋亡性细胞死亡正常化(图26)。观察到CDKL5敲除小鼠(-/Y)在海马齿状回中具有比野生型(+/Y)小鼠少的有丝分裂期后的神经元(DCX阳性细胞)(图27)。TATk-GFP-CDKL5处理的CDKL5敲除小鼠经历有丝分裂期后的神经元数目的增加，从而变得类似于野生型(+/Y)小鼠的有丝分裂期后的神经元数目(图
27)。这表明特征化CDKL5敲除小鼠的有丝分裂期后的不成熟颗粒细胞的死亡增加被TATk-GFP-CDKL5处理挽救。一起考虑，这些数据证明CDKL5敲除小鼠中的用TATk-GFP-CDKL5进行的处理增加了海马体中新生细胞的神经突长度和存活率，这表明注射的TATk-CDKL5从侧脑室扩散到海马体并且恢复了有丝分裂期后的颗粒细胞的成熟和存活。

[0244] 不受任何一个理论束缚，连通性的降低可能是与特征化CDKL5KO小鼠的新生颗粒细胞的树突发育障碍相对应的。突触泡蛋白(SYN；也称为p38)是为突触前末梢的特异性标记的突触泡糖蛋白。在此，在CDKL5敲除小鼠(-/Y)中观察到海马体分子层中的SYN的光密度比野生型(+/Y)小鼠中的明显更低(图28和图30A)，这表明CDKL5KO小鼠的齿状回中具有较少的突触连接。图28A-28C示出了展示出来自以下各项的齿状回(DG)分子层(Mol)的处理用于突触泡蛋白(SYN)免疫荧光的脑切片的代表性图像：野生型雄性小鼠(+/Y)(图28A)、半合子型CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)(图28B)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的半合子型CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)(图28C)。将来自动物的DG的30μm厚的冠状切片的六分之一进行处理以用于免疫组织化学。在冷冻脑的自由漂浮切片上进行免疫组织化学。对于突触泡蛋白免疫组织化学，在4℃下将切片与小鼠单克隆抗-SYN(SY38)抗体(1:1000，MAB 5258，密理博生物科学(Millipore Bioscience)研究试剂)一起孵育48小时并且与Cy3轭合的抗-小鼠IgG第二抗体(1:200；杰克森免疫研究公司(Jackson Immunoresearch))一起孵育2小时。通过免疫组织化学染色的切片的光密度测定法来确定免疫反应性(IR)的强度。使用配备有尼康(Nikon)数码照相机DXM1200(ATI系统)的尼康Eclipse E600显微镜捕获荧光图像。使用Nis-元素软件3.21.03(尼康)进行分子层和皮层的光密度分析。对于每个图像，通过分析图像区域中不含有IR的像素强度的分布来估计强度阈值。然后减去此值以计算每个取样区域的IR。此值以对照CDKL5+/Y小鼠的光密度的百分比给出(平均值+标准误差)。

[0245] 与野生型对应物相比，CDKL5敲除小鼠的皮层锥形神经元的树突分枝明显减少(阿门多拉，2014，公共科学图书馆综合，9(5):e91613)。在新皮层的III层中观察到类似的较低SYN免疫反应性水平(图30B)。在用TATk-GFP-CDKL5处理的CDKL5敲除小鼠(-/Y)中，这些缺陷被完全挽救(图28和图30A和图30B)，这表明使用TATk-GFP-CDKL5的处理对树突结构的正面影响与对神经元的输入的恢复是并行发生的。

[0246] 实例9：在体内TATk-CDKL5融合蛋白对P-AKT的影响

[0247] AKT是与多个细胞途径相关联的中枢信号传导激酶。磷酸化AKT(P-AKT)在CDKL5敲除动物、CDKL5缺陷和Rett综合征中明显减少。图29A-29C示出了展示出来自以下各项的齿状回(DG)分子层(Mol)的处理用于P-AKT免疫荧光的脑切片的代表性图像：野生型雄性小鼠(+/Y)(图29A)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)(图29B)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)(图29C)。对于磷酸-AKT免疫组织化学，在4℃下将切片与小鼠单克隆抗-磷酸-AKT-Ser473抗体(1:1000，细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology))一起孵育24小时并且与Cy3轭合的抗-小鼠IgG第二抗体(1:200；杰克森免疫研究公司)一起孵育2小时。通过免疫组织化学染色的切片的光密度测定法来确定免疫反应性(IR)的强度。使用配备有尼康(Nikon)数码照相机DXM1200(ATI系统)的尼康Eclipse E600显微镜捕获荧光图片。

[0248] 观察到，在CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)中DG分子层中(图31A)和皮层的V层(图31B)中的P-AKT的光密度比+/Y小鼠中的明显更低。在用TATk-GFP-CDKL5连续五天脑室内注射的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)中，此缺陷被完全挽救(图31A和图31B)，这证明CDKL5敲除小鼠中的TATk-GFP-CDKL5处理恢复了AKT活性。

[0249] 实例10：TATk-CDKL5融合蛋白对学习能力和记忆能力的影响

[0250] 与野生型小鼠相比，CDKL5敲除小鼠表现出学习缺失和记忆缺失(参见例如图33和图34A-34B)。

[0251] 为了检查记忆能力和学习能力，向CDKL5敲除小鼠每日给予TATk-GFP-CDKL5融合蛋白的脑室内注射，连续进行10天(参见例如图32的实验时间表)。在10天注射完结的两天休息期之后，所有组中的小鼠接受莫里斯水迷宫(MWM)测试(图33)。MWM测定发现和回忆浸入水中的平台的位置的能力。在MWM任务中，训练小鼠寻找圆形水池中的隐藏逃跑平台。该装置由具有透明圆形逃跑平台(10cm2)的大型圆形水箱(1.00m直径，50cm高度)组成。将水池基本上分为四个均等象限，将这些象限鉴别为东北、西北、东南和西南。用22℃温度下的自来水填充水箱直至高于平台顶部0.5cm，并且使用乳使水变得不透明。将平台以固定位置(在西北象限的中间)置于水箱中。将水池置于大房间中，该房间具有许多内部的(四方形、三角形、圆形和星形)和外部的迷宫视觉提示。训练之后，对每个小鼠测试两个阶段，每个阶段每天4次，连续进行5天，其中阶段间间隔40分钟(采集阶段)。将录像照相机置于水池中央上方并且连接至视频跟踪系统(Ethovision 3.1；诺达思信息技术公司(Noldus Information Technology B.V.)，瓦赫宁恩(Wageningen)，荷兰(Netherlands))。从以下出发点开始、面向水池壁释放小鼠：北、东、南或西并且允许小鼠寻找平台高达60秒。如果小鼠找不到平台，则将它渐渐地引导至平台并且使它在那儿逗留15秒。在试验间隔时间(inter-trail time)(15秒)过程中，将小鼠置于空的笼子中。将查找隐藏平台的潜伏时间作为学习的量度。所有实验阶段在上午9.00与下午15.00之间进行。

[0252] 这个测试的结果展示在图33中。图33示出了展示出以下各项的如经由莫里斯水迷宫测试确定的学习期的定量的图：野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)和用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)。野生型小鼠到第二天学会了查找平台，但是在CDKL5敲除小鼠中没有检测出明显的学习。用TATk-CDKL5融合蛋白处理的CDKL5敲除小鼠在第四天开始恢复学习能力，并且在第5天连续改善。

[0253] 使用被动回避测试进一步检查响应于TATk-GFP-CDKL5融合蛋白处理的记忆能力和学习能力。在连续10天的治疗和两天的休息时间之后，不同组的小鼠接受了被动回避测试(图34)。该实验利用了具有两个腔室(光明和黑暗)的测试笼子。在第一天(条件作用期)，动物被置于光明腔室中并且本能地移动到黑暗腔室中，在该黑暗腔室中，它们遭受单一的不良事件(足部电击)。对于被动回避测试，我们使用了被滑动门分成两个区室的倾斜底板箱(47×18×26cm)和结合减震器(乌戈巴斯勒公司(Ugo Basile)，意大利(Italy))的控制单元。用于巴甫洛夫条件作用的此经典仪器利用了小鼠从照明区域逃跑到黑暗区域的倾向(避暗实验方法)。在第一天，将小鼠分别放置到照明区室中。在60秒适应期之后，打开腔室之间的连接门。一般来说，小鼠快速地步过门并且进入黑暗区室，因为小鼠更喜欢在黑暗中。在进入黑暗区室之后，小鼠接受短暂的足部电击(0.7mA，持续3秒)并且在15秒的潜伏时间之后将其从腔室中移出。如果小鼠在光明区室中逗留试验的持续时间(358s)，则关闭门并且将小鼠从光明区室中移出。在各个小鼠的测试之间，用70％乙醇清洁腔室。在24小时的保留期之后，将小鼠放回到光明区室中并且所测得的它们重新进入黑暗区室所花费的时间(潜伏时间)高达358秒。

[0254] 图34A-34B展示了来自被动回避测试的结果。图34A表明对于所有组，进入黑暗腔室的潜伏时间是类似的。在第二天(测试期)(图34B)，将动物再次置于光明腔室。通过进入黑暗腔室的潜伏时间来测定对不良事件的记忆。CDKL5敲除小鼠(-/Y)在完成此任务方面严重受损，如通过与野生型小鼠(+/Y)相比进入黑暗区室的潜伏期减少所证明的。与野生型小鼠相比，TATk-GFP-CDKL5处理的敲除小鼠表现出类似的潜伏时间。

[0255] 总之，数据证明TATk-CDKL5可以使CDKL5敲除小鼠的学习能力和记忆能力增加且恢复至未处理的野生型小鼠中可见的类似水平。

[0256] 实例11：TATk-CDKL5融合蛋白对运动功能的影响

[0257] CDKL5敲除小鼠在被悬挂时表现出延长的肢抱拢(参见例如图35A-35B)。

[0258] 为了检查TATk-GFP-CDKL5融合蛋白对运动功能的影响，向小鼠每日给予TATk-GFP-CDKL5的脑室内注射，连续进行10天(图35)。完成给予方案后10天，通过尾巴将小鼠悬挂在空中(图35A和图35B)。将所有小鼠悬挂约2分钟并且测量肢抱拢的总时间。将来自此实验的结果展示在图35A-35B中。

[0259] 图35A示出了展示出如通过抱拢测试确定的运动能力的定量的图，其中测量了在2分钟间隔过程中以下各项的肢抱拢所用的时间总量：野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)和根据图32中的注射时间表用TATk-GFP-CDKL5融合蛋白处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATk-GFP-CDKL5)。

[0260] 测量了野生型雄性小鼠(+/Y)和用TAT-GFP-CDKL5蛋白注射5(+/Y)或10(-/Y)天的Cdkl5KO(-/Y)雄性小鼠的体重并且将结果展示在图36中。在注射期过程中没有观察到体重的明显变化，这表明不存在由TAT-GFP-CDKL5蛋白给予导致的任何副作用。

[0261] 总之，数据证明用TATk-CDKL5的处理改善了CDKL5敲除小鼠的运动功能。