来源于滋养层基底层的干细胞及包含其的细胞治疗剂

摘要

本发明涉及来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干细胞及包含其的细胞治疗剂。与现有的来源于整个胎盘或其它组织的干细胞相比，本发明的来源于滋养层基底层的干细胞具有匀质的生长特性、优秀的增殖特性及分化特性，在组织缺损动物模型中具有优秀的组织再生效果，从而可有效地用作细胞治疗剂。

权利要求

1.一种干细胞，其特征在于，来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层。

2.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，上述干细胞对CD44、CD73、CD90以及CD105具有阳性的表面因子表达特性。

3.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，上述干细胞对CD31、CD34、CD45以及HLA-DR具有阴性的表面因子表达特性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的干细胞，其特征在于，来源于上述滋养层基底层的干细胞来源于作为位于绒毛膜与蜕膜之间的整个滋养层中的与绒毛膜相连接的部位的

20至30％厚度的组织。

5.一种细胞治疗剂，其特征在于，包含来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分。

6.根据权利要求5所述的细胞治疗剂，其特征在于，从上述干细胞分化的细胞为选自由软骨细胞、脂肪细胞、骨细胞、神经细胞、韧带细胞以及肌腱细胞组成的组中的一种以上。

7.根据权利要求5或6所述的细胞治疗剂，其特征在于，上述细胞治疗剂用于治疗软骨损伤、软骨缺陷、骨缺损、肌腱-韧带缺损或脂肪组织缺损。

8.根据权利要求7所述的细胞治疗剂，其特征在于，上述软骨缺陷选自由软骨外伤、软骨断裂、软骨软化、软骨坏死、骨软骨炎、软骨缺损以及骨关节炎组成的组。

9.一种组织再生用组合物，其特征在于，包含来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分。

10.根据权利要求9所述的组织再生用组合物，其特征在于，上述组织为选自由软骨、脂肪、骨、神经、韧带以及肌腱组成的组中的一种以上。

11.根据权利要求10所述的组织再生用组合物，其特征在于，上述软骨为透明软骨、纤维软骨或弹性软骨。

12.根据权利要求10所述的组织再生用组合物，其特征在于，上述软骨选自由关节软骨、耳软骨、鼻软骨、胳膊肘软骨、半月板软骨、膝盖软骨、肋软骨、踝关节软骨、气管软骨、喉软骨以及脊椎软骨组成的组。

说明书

来源于滋养层基底层的干细胞及包含其的细胞治疗剂

技术领域

[0001] 本发明涉及来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干细胞及包含其的细胞治疗剂。

背景技术

[0002] 最近生命工程将人类福利作为最终目标来提供可解决粮食、环境、健康问题的新解决办法，其中利用干细胞的技术正成为治疗顽固性疾病的新篇章。以前为了治疗人类的顽固性疾病而提出了脏器移植、基因治疗等，但由于免疫排斥反应和脏器供应不足、载体研发或者缺少针对疾病基因的知识而无法有效地应用。由此，提高了对干细胞的关注，从而认识到具有通过增殖和分化可形成所有器官的能力的全能干细胞既能治疗大部分的疾病又能从根本上解决脏器损害。并且，许多科学家们提出了通过使用干细胞既能实现人体的几乎所有脏器再生又能治疗帕金森病、各种癌、糖尿病和脊椎损伤等的多种可能性。

[0003] 干细胞(stem cell)是指作为未分化的细胞具有自我复制能力及分化成两个以上的互不相同种类的细胞的能力的细胞。干细胞根据细胞学起源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞来源于受精卵或者生成中的胎儿组织等，相反，成体干细胞来源于作为完成胎儿生长后的个体组织的骨髓、脐带血、脂肪、胎盘、肌肉、滑膜、脑、肝、胰脏等。另一方面，由于胚胎干细胞存在道德上的限制，因此在使用为细胞治疗剂的方面存在限制，但与此相反地，由于成体干细胞可主要从骨髓、脂肪、脐带血及胎盘等获取，从而不存在道德上的问题。

[0004] 其中，在上述干细胞为来源于胎盘的干细胞的情况下，利用分娩后废弃的胎盘，从而存在容易提取且可便于确保大量的干细胞的优点。在上述干细胞为来源于脂肪或骨髓的干细胞的情况下，受到所要分离、提取的捐献者的年纪或健康状态等影响而在增殖力或分化能力等上有限制，而且变动性多，但在来源于胎盘的干细胞的情况下，作为成体干细胞中可最早获取的干细胞，几乎不受到根据捐献者的年纪等的变数的干细胞干性影响，而且具有优秀的增殖力及分化能力。并且，来源于胎盘的干细胞具有可分离能够适用于神经系统疾病、肝病、肌肉骨骼疾病等多种疾病的干细胞组的优点。

[0005] 由于上述的优点，正积极进行与来源于胎盘的干细胞相关的研究。例如，在韩国专利授权第818214号中公开了利用含N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC，N-acrtyl-L-cysteine)的培养基从羊膜或蜕膜分离干细胞的方法，在韩国专利授权第871984号中公开了利用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Basic Fibroblast Growth Factor)的培养基培养来源于羊膜、浆膜、底蜕膜及胎盘组织的干细胞的多分化能力。但是，目前为止未执行针对来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞的研究。

发明内容

[0006] 发明要解决的课题

[0007] 对此，本发明人为了在来源于胎盘的干细胞中也找到干细胞干性(stemness)更优秀的干细胞而持续研究的结果，分离作为胎盘的整个滋养层(total chorionic trophoblast layer，tCT)中的与绒毛膜相连接的部位且作为相当于约25％的厚度的组织层的滋养层基底层(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)，从而制备来源于上述滋养层基底层的干细胞，发现了来源于上述滋养层基底层的干细胞作为多能干细胞，与现有的来源于整个胎盘或其它组织的干细胞相比具有匀质的生长特性、优秀的增殖特性及分化特性，而且在组织缺损动物模型中具有优秀的组织再生效果，由此完成了本发明。

[0008] 并且，本发明的目的在于，提供来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干细胞。

[0009] 本发明的另一目的在于，提供将来源于上述滋养层基底层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分包含的细胞治疗剂及组织再生用组合物。

[0010] 用于解决课题的方法

[0011] 为了实现上述目的，本发明提供来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干细胞。

[0012] 并且，本发明提供将来源于上述滋养层基底层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分包含的细胞治疗剂。

[0013] 并且，本发明提供将来源于上述滋养层基底层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分包含的组织再生用组合物。

[0014] 发明的效果

[0015] 与现有的来源于整个胎盘或其它组织的干细胞相比，本发明的来源于滋养层基底层(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干细胞具有匀质的生长特性、优秀的增殖特性及分化特性，而且在组织缺损动物模型中具有优秀的组织再生效果，从而可有效地用作细胞治疗剂。

附图说明

[0016] 图1为示出作为胎盘(Pla)的细微组织的绒毛膜(chorionic membrane，CM)、绒毛膜滋养层(chorionic membrane and chorionic trophoblast layer，CMT)、整个滋养层(total chorionic trophoblast layer，tCT)、滋养层上层部(upper portion of chorionic trophoblast layer，uCT)及滋养层基底层(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的剖面照片的图。

[0017] 图2为示出通过显微镜观察本发明的来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞的继代培养之前(P0)与长时间继代培养之后(P31)的细胞形态的照片(X100)的图。

[0018] 图3为示出通过显微镜观察来源于整个胎盘的干细胞的继代培养之间(P0)的细胞形态与长时间继代培养之后(P29)的细胞形态的照片(X100)的图。

[0019] 图4为示出来源于整个胎盘、胎盘的各细微组织及其它组织的干细胞的群体倍增时间的图。

[0020] 图5为示出来源于整个胎盘、胎盘的各细微组织及其它组织的干细胞的集落形成单位的图。

[0021] 图6为示出本发明的用于确认来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞的表面因子表达特性的流式细胞分析结果的图。

[0022] 图7为示出用于观察来源于整个胎盘、胎盘的各细微组织及其它组织的干细胞的分化成脂肪细胞(Adipogenesis)、软骨细胞(Chondr ogenesis)或骨细胞(Osteogenesis)的程度的各染色结果的图。

[0023] 图8为示出为了观察来源于整个胎盘、胎盘的各细微组织及其它组织的干细胞的分化成软骨细胞的程度而利用番红O(Safranin-O)进行染色后进行定量化的结果的图。

[0024] 图9为示出为了观察来源于整个胎盘、胎盘的各细微组织及其它组织的干细胞的分化成软骨细胞的程度而在进行利用Ⅱ型胶原蛋白(Type II collagen)的免疫组织化学染色后进行定量化的结果的图。

[0025] 图10为示出为了观察来源于整个胎盘、胎盘的各细微组织及其它组织的干细胞的分化成骨细胞的程度而利用碱性磷酸盐(Alkaline phosphate)进行染色后进行定量化的结果的图。

[0026] 图11为示出为了观察来源于整个胎盘、胎盘的各细微组织及其它组织的干细胞的分化成骨细胞的程度而利用茜素红S(Alizarin red S)进行染色后进行定量化的结果的图。

[0027] 图12为示出为了观察来源于整个胎盘、胎盘的各细微组织及其它组织的干细胞的分化成脂肪细胞的程度而利用油红O(Oil red O)进行染色后进行定量化的结果的图。

[0028] 图13为示出向软骨损伤动物模型投入来源于脐带血(UCB)的干细胞或来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞后通过苏木精-伊红(H&E)及番红O(Safranin-O)染色确认软骨再生效果的结果的图。

[0029] 图14为示出向软骨损伤动物模型投入来源于脐带血(UCB)的干细胞或来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞后通过利用国际软骨修复学会(ICRS，International Cartilage Repair Society)宏观评分(macroscopic score)的定量化确认软骨再生效果的结果的图。

具体实施方式

[0030] 以下，对本发明进行详细说明。

[0031] 本发明提供来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干细胞。

[0032] 在本发明中，“干细胞”是指具有自我复制能力及分化成两个以上的互不相同种类细胞的能力的细胞。干细胞根据分化能力可分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多潜能干细胞(pluripotent stem cells)、多能(多功能)干细胞(multpotent stem cells)。

[0033] 在本发明中，“全能干细胞(totipotent stem cells)”是指如下的细胞，即，作为具有可发育为一个完整的个体的全能的性质的细胞，在完成卵子与精子的受精之后，使细胞直到8细胞期为止具有上述性质，而且若分离上述细胞并移植于子宫，则可使上述细胞发育为一个完整的个体。在本发明中，“多潜能干细胞(pluripotent stem cells)”是指如下的细胞，即，作为可增殖为来源于外胚层、中胚层、内胚层的多种细胞和组织的细胞，来源于位于在受精4～5日之后出现的胚泡(blastocyst)的内侧的内细胞团(inner cell mass)，将其称为胚胎干细胞，可分化成多种不同的组织细胞，但无法形成新生命体。在本发明中，“多能干细胞”是指只能分化成形成包含干细胞的组织及器官的特异性细胞的细胞。作为本发明的目的，优选地，上述“干细胞”为多能干细胞。

[0034] 在本发明中，“胎盘(placenta)”是指怀孕期间为了胎儿而形成的生物体内组织，其呈重量为500～600g、直径为15～20cm、厚度为2～3cm左右的圆盘形态。胎盘的一侧与母体相接触，另一侧与胎儿相接触，在上述胎盘中，在母体的血液与胎儿的血管之间实现营养及氧的传递。胎盘可大致分为羊膜、绒毛膜、蜕膜的3层，更详细地，可分为羊膜上皮、羊膜、绒毛膜、滋养层、蜕膜。图1简要示出胎盘的剖面图。

[0035] 在本发明中，“滋养层基底层”是指作为位于绒毛膜与蜕膜之间的滋养层中的相当于与绒毛膜相连接(相邻)部位的20至30％厚度的组织，一般是指相当于约5～6mm的厚度的组织层。

[0036] 在本发明中，“滋养层”是指如下的组织，即，作为位于胚胞外部的胚胎的外胚层，将卵子附着于子宫壁且向胚胎提供营养成分。绒毛膜及羊膜来源于这种滋养层，滋养层的内细胞层覆盖绒毛，且称之为细胞滋养层。

[0037] 在本发明中，“绒毛膜”是指人体胚胎学中的胚胎体最外层的细胞性膜。

[0038] 在本发明中，“蜕膜”是指在娩出后脱落的子宫的粘膜。

[0039] 可通过如下的方法获取本发明的来源于滋养层基底层的干细胞，即，向从胎盘分离的滋养层基底层组织添加酶溶液来进行酶反应，从而获取细胞，并在添加有胎牛血清及抗生剂的培养基中培养上述细胞，而不使用生长因子，然后进行回收来获取。上述酶包括胰蛋白酶(Trypsin)、胶原酶(collagenase)、分散酶(dispase)、脱氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)、蛋白酶(protease)、脂肪酶(lipase)、透明质酸酶(hyaluronidase)及弹性蛋白酶(elastase)等，但并不限定于此。上述胶原酶包括胶原酶A、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅲ或胶原酶Ⅳ等。

[0040] 本发明的来源于滋养层基底层的干细胞具有如下的特征。

[0041] (a)成纤维细胞(fibroblastic cell)形状的形态学特征。

[0042] (b)以实现25至30以上的继代次数的方式可长时间增殖的能力。

[0043] (c)可分化成脂肪细胞、软骨细胞或骨细胞的能力。

[0044] (d)集落形成能力。

[0045] (e)对CD44、CD73、CD90及CD105的阳性免疫学特性。

[0046] (f)对CD31、CD34、CD45及HLA-DR的阴性免疫学特性。

[0047] 本发明的来源于滋养层基底层的干细胞可分化成互不相同种类的细胞，例如，可分化成脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、神经细胞、韧带细胞或肌腱细胞(tenocyte)等多种种类的细胞，但并不限定于此。

[0048] 在本发明中，“分化(differentiation)”是指通常比较单一的系被分化成实质上不同的两种以上的部分系的现象，具体地是指细胞在通过分裂增殖来进行生长的过程中使不同的结构或功能特殊化的现象，即，生物的细胞、组织等为了执行各自担当的任务而改变形态或功能的现象。相对地，“未分化”是指未发生上述的分化现象且还保持作为干细胞的特征的状态。

[0049] 分化干细胞的方法可根据现有的公知方法进行，对其不进行特别限定。例如，优选地可使用如下的方法，即，通过在包含地塞米松(dexamethasone)、吲哚美辛(indomethacin)、胰岛素及3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，3-isobutyl-1-methylxanthine)的培养基培养上述干细胞来分化成脂肪细胞的方法；通过在包含地塞米松、骨形态生成蛋白-6(BMP-6，bone morphogenetic protein 6)、转化生长因子-β(TGF-β，Transforming growth factor beta)、抗坏血酸(ascorbic acid)及L-脯氨酸(L-proline)的培养基培养上述干细胞来分化成软骨细胞的方法；在包含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸盐(β-glycrophosphate)及抗坏血酸-2-磷酸盐(ascorbic acid-2-phosphate)的培养基培养上述干细胞来分化成骨细胞的方法等。

[0050] 虽然不特别限定测定通过上述方法分化的来源于滋养层基底层的干细胞的分化程度的方法，但可使用作为本领域公知的技术的流式细胞分析方法、免疫细胞化学方法、使用聚合酶链反应(PCR)或基因表达图谱来测定细胞表面标记或形态的变化的方法、使用光学显微镜或共聚焦显微镜来观察细胞的形态变化的方法、测定基因表达图谱的变化的方法等，优选地，可使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、油红O(Oil-red O)染色法、番红O(Safranin O)染色法、Ⅱ型胶原蛋白(Type II collagen)免疫组织化学染色法，碱性磷酸盐(ALP，alkaline phosphate)染色法或茜素红S(Alizarin red S)染色法等。

[0051] 与现有的来源于整个胎盘或其他组织的干细胞相比，本发明的来源于滋养层基底层(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干细胞具有匀质的生长特性、优秀的增殖特性及分化特性，而且在组织缺损动物模型中组织再生效果优秀。

[0052] 因此，本发明提供将来源于滋养层基底层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分包含的细胞治疗剂。

[0053] 虽然并未特别限定被分化的上述细胞，但被分化的上述细胞包括脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、神经细胞、韧带细胞、肌腱细胞等，而且可根据治疗目的选择适当的细胞。

[0054] 本发明的术语“细胞治疗剂(cellular therapeutic agent)”是指如下的医药品，即，作为从人类分离或者通过培养及特殊操作制备的细胞及组织而以治疗、诊断及预防为目的使用的医药品(美国FDA规定)，为了复原细胞或组织的功能而在体外增殖筛选存活的自身细胞、同种细胞或异种细胞或者通过其他方法使细胞的生物学特性发生变化等的一系列操作，来使这些细胞适用于治疗、诊断及预防疾病的目的。

[0055] 本发明的来源于滋养层基底层的干细胞可用于使身体的组织或器官通过目的细胞群落例如干细胞或分化细胞群落的植入、移植或注入而被调整、强化、治疗或替代的多种种类的治疗方案。本发明的来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞可通过替代或强化存在的组织使其成为新的组织或发生变化的组织或者使其与生物学组织或结构相结合。

[0056] 优选地，本发明的细胞治疗剂可用于治疗软骨损伤、软骨缺陷、骨缺损、肌腱-韧带缺损或脂肪组织缺损等。

[0057] 在本发明中，“软骨缺陷”是指身体内的软骨产生损伤、缺陷(defect)或不足的情况，例如，包括软骨外伤、软骨断裂、软骨软化、软骨坏死、骨软骨炎、软骨缺损或骨关节炎等，但并不限定于此。

[0058] 并且，向关节内投入本发明的来源于滋养层基底层的干细胞，从而治疗关节软骨的病变，或者，向肌腱或韧带部位投入上述干细胞，从而可适用于治疗或预防等的目的。例如，向关节、肌腱或韧带部位投入本发明的来源于滋养层基底层的干细胞，从而实现针对上述组织的损伤部位的恢复或调整，而且可利用来源于本发明的滋养层基底层的干细胞的软骨组织结构物等来源于干细胞的物质，以使关节(例如，膝盖关节等)的组织重组或再生等的方法进行治疗。

[0059] 本发明的细胞治疗剂的优选剂量随个体的状态及体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及期间而异，但可通过本领域普通技术人员选择适当的剂量。给药次数可以为一天一次，也可分次进行给药，上述剂量不管在任何方面都不限制本发明的范围。

[0060] 本发明的来源于滋养层基底层(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干细胞具有优秀的增殖能力和分化能力，从而具有优秀的组织再生效果。

[0061] 因此，本发明提供将来源于滋养层基底层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分包含的组织再生用组合物。

[0062] 虽然未特别限定上述组织，但可包括软骨、脂肪、骨、神经、韧带、肌腱等的组织。

[0063] 上述软骨包括透明软骨(hyaline cartilage)、纤维软骨(fibrocar tilage)或弹性软骨(elastic cartilage)等，例如，可以为关节软骨(ar ticular Cartilage)、耳软骨、鼻软骨、胳膊肘软骨、半月板软骨(men iscus)、膝盖软骨、肋软骨、踝关节软骨、气管软骨、喉软骨或脊椎软骨，但并不限定于此。

[0064] 上述脂肪与体内位置无关地包括所有脂肪，例如，皮下脂肪(subcutaneous fat)、位于肠胃间的脂肪(网膜(omentum)，肠系膜(mesentery))、骨髓脂肪(bone marrow fat)、腹膜后脂肪(retroperitoneal fat)等，但并不限定于此。

[0065] 以下，通过下述实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于详细说明本发明，本发明的范围并不限定于这些实施例。

[0066] 实施例1：获取来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞[0067] 胎盘是根据韩国三星首尔医院临床试验伦理委员会指南从在韩国三星首尔医院同意捐赠的剖腹产正常分娩的产妇收集的。将收集的胎盘组织放入被灭菌的容器并移动，在从胎盘组织去除羊膜后，利用经过灭菌的手术镊W和手术刀小心地分离相当于位于绒毛膜(CM)与蜕膜(DC)之间的滋养层(tCT)中的与绒毛膜相连接(相邻)的部位的约25％厚度(约5～6mm厚度)的滋养层基底层组织。将分离的滋养层基底层组织移动至150mm的盘后，利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗8～10次，从而去除血液及血球细胞。将完成清洗的上述滋养层基底层组织移动至50ml的管后，投入添加有0.2％的胶原酶的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基，在37℃的温度下，利用搅拌器反应2～3小时，从而获取来源于滋养层基底层的细胞。利用70μm的网过滤所获取的来源于滋养层基底层的细胞，从而去除未分解的组织，在投入添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基后，在25℃的温度下，以1000rpm离心分离4分钟。在去除上清液后的所沉淀的细胞中投入不包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基，在37℃的温度下，在5％的CO2条件下进行培养。在上述培养物中筛选附着于培养容器的底面的细胞，从而获取来源于滋养层基底层的干细胞。

[0068] 比较例1：获取来源于其他组织的干细胞

[0069] 1-1.获取来源于整个胎盘的干细胞

[0070] 切碎整个胎盘组织，利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行清洗，从而从胎盘组织去除血液及血球细胞。向所清洗的上述胎盘组织投入添加有0.2％的胶原酶的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基，在37℃的温度下，利用搅拌器进行反应，从而获取胎盘细胞。利用70μm的网过滤所获取的上述胎盘细胞，从而去除未分解的组织，在投入添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基后，在25℃的温度下，以1000rpm离心分离4分钟。在去除上清液后的所沉淀的细胞中投入不包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基，在37℃的温度下，在5％的CO2条件下进行培养。在上述培养物中筛选附着于培养容器的底面的细胞，从而获取来源于整个胎盘(Whole placenta，Pla)的干细胞。

[0071] 1-2.获取来源于胎盘细微组织的干细胞

[0072] 从胎盘分别分离作为细微组织的绒毛膜(chorionic membrane，C M)、绒毛膜滋养层(chorionic membrane and chorionic trophoblast layer，CMT)、整个滋养层(total chorionic tropholast layer，tCT)及滋养层上层部(upper portion of chorionic tropholast layer，uCT)组织。更具体地，在整体胎盘组织中，利用经过灭菌的手术镊W和手术刀去除羊膜后，通过小心地去除蜕膜来分离绒毛膜滋养层，将其中的一部分重新分离成绒毛膜及整个滋养层。为了从上述整个滋养层组织分离滋养层上层部，利用经过灭菌的手术镊W和手术刀小心地分离相当于除了上述实施例1的滋养层基底层之外的位于绒毛膜(CM)与蜕膜(DC)之间的整个滋养层(tCT)中的与蜕膜相连接(相邻)的部位的约75％厚度的组织。将通过上述步骤分别分离的胎盘细微组织移动至150mm的盘后，利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗8～10次，从而去除血液及血球细胞。将完成清洗的上述胎盘细微组织移动至50ml的管后，投入添加有0.2％的胶原酶的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基，在37℃的温度下，利用搅拌器反应2～3小时，从而分别获取来源于绒毛膜、绒毛膜滋养层、整个滋养层及滋养层上层部的细胞。利用70μm的网过滤所获取的各细胞，从而去除未分解的组织，在投入添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基后，在25℃的温度下，以
1000rpm离心分离4分钟。向去除上清液后的所沉淀的细胞中投入不包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基，在37℃的温度下，在5％的CO2条件下进行培养。在上述培养物中筛选附着于培养容器的底面的细胞，从而分别获取来源于绒毛膜、绒毛膜滋养层、整个滋养层及滋养层上层部的干细胞。

[0073] 1-3.分离来源于骨髓的干细胞

[0074] 将骨髓(Bone Marrow)移动至50ml的管后，投入同量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行清洗，在25℃的温度下，以2580rpm离心分离10分钟。反复进行2次上述清洗步骤后，将除去上清液后的所沉淀的骨髓悬浮于同量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)后(共5ml)，将上述溶液缓慢地移动至预先准备的25ml的聚蔗糖(Ficoll)溶液后，在25℃的温度下，以2580rpm离心分离30分钟。在因密度差而分离的三个层中，仅分离位于中间层的细胞层并进行清洗后，重新在
25℃的温度下，以2580rpm离心分离5分钟。向通过上述步骤获取的细胞中投入不包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基，在37℃的温度下，在5％的CO2条件下进行培养，从而获取来源于骨髓的干细胞。

[0075] 1-4.分离来源于脐带血的干细胞

[0076] 将脐带血(Umbilical Cord Blood)移动至50ml的管后，投入同量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行清洗，在25℃的温度下，以2580rpm离心分离10分钟。反复进行2次上述清洗步骤后，将除去上清液后的所沉淀的脐带血悬浮于同量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)后(共5ml)，将上述溶液缓慢地移动至预先准备的25ml的聚蔗糖(Ficoll)溶液后，在25℃的温度下，以2580rpm离心分离30分钟。在因密度差而分离的三个层中，仅分离位于中间层的细胞层并进行清洗后，重新在25℃的温度下，以2580rpm离心分离5分钟。向通过上述步骤获取的细胞中投入不包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基，在
37℃的温度下，在5％的CO2条件下进行培养，从而获取来源于骨髓的干细胞。

[0077] 1-5.分离来源于脂肪或滑膜的干细胞

[0078] 将脂肪(Adipose)或滑膜(Synovium)组织移动至150mm的盘后，利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗2～3次，从而去除血液及血球细胞。在将上述脂肪或滑膜组织切成小块后，将各组织移动至50ml的管，投入添加有0.2％的胶原酶的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基后，在37℃温度的条件下，利用搅拌器进行反应，从而获取脂肪或滑膜细胞。利用70μm的网过滤所获取的上述脂肪或滑膜细胞，从而去除未分解的组织，投入添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基后，在25℃的温度下，以1000rpm离心分离4分钟。向去除上清液后的所沉淀的细胞中投入不包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基，在37℃的温度下，在5％的CO2条件下分别进行培养，从而获取来源于脂肪或滑膜的干细胞。

[0079] 实施例2：继代培养来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞[0080] 利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗在上述实施例1中获取的来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞后，每2～3日更换未包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基并进行培养。在上述干细胞生长80％以上的时点上实施TryPLE处理，并从培养容器分离干细胞，在以1/4的比率稀释所分离的干细胞之后，以在其他培养容器进行培养的方法进行继代培养。重复进行如上所述的继代培养，并测定不再进行继代培养的继代次数(passage number)，用显微镜观察继代培养之前(P0)与长时间继代培养之后的细胞形态。并且，利用在上述比较例1中获取的来源于整个胎盘(Whole placenta，Pla)的干细胞，以相同的方法进行继代培养后，用显微镜观察继代培养之前(P0)与长时间继代培养之后的细胞形态。在图2及图3分别示出其结果。

[0081] 如图2所示，本发明的来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞具有继代次数达到31的优秀的增殖能力，从而确认到可进行长时间培养。

[0082] 并且，如图3所示，可确认到来源于整个胎盘(Whole placenta，Pla)的干细胞从继代培养初期呈现成纤维细胞形状的形态特性且混合有多个互不相同的形态的细胞，而不是一个形态。即，与图2相比，在继代培养前后，来源于滋养层基底层的干细胞仅特异性维持单一的细胞，但来源于整个胎盘的干细胞混合有互不相同形态的细胞。

[0083] 实施例3：来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞的集落形成能力分析

[0084] 确认了在上述实施例1中获取的来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞的群体倍增时间及集落形成能力。更具体地，以上述实施例2的方法对在上述实施例1获取的来源于滋养层基底层的干细胞进行第一次继代培养，在完成上述继代培养的时点上，在100mm的盘分别接种(seeding)5×103个后，在未包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基培养10日。测定从P2到P6的干细胞的数量变成两倍所需的时间(群体倍增时间)，将所培养的上述干细胞为对象进行吉姆沙染色法(Giemsa stain)，从而对形成在干细胞的群落进行计数。并且，利用在上述比较例1中获取的来源于整个胎盘、其它胎盘细微组织及其他组织的干细胞，以相同的方法测定群体倍增时间及集落形成能力。当测定集落形成能力时，将来源于整个胎盘的干细胞的结果值作为100％进行换算。在图4及图5分别示出其结果。

[0085] 如图4所示，确认了本发明的来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞的群体倍增时间(population doubling time)明显短于来源于整个胎盘、其它胎盘细微组织及其他组织的干细胞的群体倍增时间，从而细胞增殖更快。

[0086] 并且，如图5所示，确认了与来源于整个胎盘、其它胎盘细微组织及其他组织的干细胞相比，本发明的来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞的集落形成能力明显优秀。

[0087] 实施例4：来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞的表面标志分析[0088] 为了确认在上述实施例1中获取的来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞的免疫学特性，而进行了如下的实验。首先，利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗来源于滋养层基底层的干细胞，实施TryPLE处理后，收集干细胞，并以1000rpm离心分离4分钟。去除上清液后，为了抑制非特异性结合而添加2％的胎牛血清(FBS)及磷酸缓冲盐溶液(PBS)的混合液，清洗干细胞后，以1000rpm离心分离5分钟。去除上清液后，将干细胞悬浮于磷酸缓冲盐溶液(PBS)，并以1×105cell分株于流式细胞仪专用圆底烧瓶。向其分别添加抗体(PE标记的小鼠抗人单克隆抗体，PE-conjugated mouse anti-human monoc lonal antibody)，在冰块中孵化30分钟后，以1000rpm离心分离5分钟。重新除去上清液后，利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行清洗，并以1000rpm离心分离5分钟。反复进行2次上述步骤。最后，去除上清液后，使干细胞单一化，并利用流式细胞仪(FACS)来分析免疫学特性。并且，利用相同的方法分析在上述比较例1中获取的来源于整个胎盘、其它胎盘细微组织及其他组织的干细胞的免疫学特性。在表1及图6示出了其结果。

[0089] 表1

[0090]

[0091]

[0092] 如表1及图6所示，确认到本发明的来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞对CD44、CD73、CD90及CD105呈现阳性的标记因子表达特性，对CD31、CD34、CD45及HLA-DR呈现阴性的标记因子表达特性。

[0093] 实施例5：确认来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞的分化成软骨细胞的能力

[0094] 为了确认在上述实施例1获取的来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞的分化成软骨细胞的能力，而在公知的软骨细胞分化诱导培养基(包含有0.1μM的地塞米松、50μg/mL的抗坏血酸、40μg/mL的L-脯氨酸、10ng/mL的转化生长因子-β3、500ng/mL的骨形态生成蛋白-6、50mg/ml的ITS通用型培养混合剂(ITS premix)的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基)中培养干细胞3周，从而诱导分化成软骨细胞。为了测定上述干细胞的分化成软骨细胞的程度，根据现有的公知的方法进行利用番红O(Safranin-O)染色及Ⅱ(Type II)型胶原蛋白的免疫化学染色法。并且，以相同的方法测定在上述比较例1中获取的来源于作为整个胎盘、其它胎盘细微组织及其他组织的干细胞的分化成软骨细胞的能力。在图7至图9示出其结果。

[0095] 如图7至图9所示，确认到与来源于整个胎盘、其他胎盘细微组织及其他组织的干细胞相比，本发明的来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞具有可更均匀地分化成软骨细胞的优秀的软骨细胞分化能力。

[0096] 实施例6：确认来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞的分化成骨细胞的能力

[0097] 为了确认在上述实施例1获取的来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞的分化成骨细胞的能力，而在公知的骨细胞分化诱导培养基(包含有10％的胎牛血清(FBS)、1％的抗生素(anti-biotics)、100μM的地塞米松、50mM的抗坏血酸-2-磷酸盐、10μM的β-甘油磷酸盐、250μM的抗坏血酸的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基)中培养干细胞4周，从而诱导分化成骨细胞。此时，在开始分化诱导后经过2周的时点上，根据现有的公知的方法通过碱性磷酸盐(ALP，Alkaline phosphate)染色法进行染色，经过4周的时点上，根据现有的公知的方法通过茜素红S(Alizarin red S)染色法进行染色，从而分析分化成骨细胞的程度。并且，以相同的方法测定在上述比较例1中获取的来源于整个胎盘、其它胎盘细微组织及其他组织的干细胞的分化成骨细胞的能力。在图7、图10及图11示出其结果。

[0098] 如图7、图10及图11所示，确认到与来源于整个胎盘、其他胎盘细微组织及其他组织的干细胞相比，本发明的来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞具有可更均匀地分化成骨细胞的优秀的骨细胞分化能力。

[0099] 实施例7：确认来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞的分化成脂肪细胞的能力

[0100] 为了确认在上述实施例1中获取的来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞的分化成脂肪细胞的能力，而以3～4天为替换周期在公知的脂肪细胞分化诱导培养基1(包含有10％的胎牛血清(FBS)、1％的抗生素(Anti-biotics)、1μM的地塞米松、20μM的吲哚美辛、10μM的胰岛素、50μM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基)及脂肪细胞分化诱导培养基2(包含有10％的胎牛血清、1％的抗生素、10μM的胰岛素的达尔伯克改良伊格尔培养基)中培养干细胞3周，从而诱导分化成脂肪细胞。为了测定上述干细胞的分化成脂肪细胞的程度，根据现有的公知的方法进行油红O(Oil red O)染色。并且，以相同的方法测定在上述比较例1中获取的来源于整个胎盘、其它胎盘细微组织及其他组织的干细胞的分化成脂肪细胞的能力。在图7及图12示出其结果。

[0101] 如图7及图12所示，确认到与来源于整个胎盘、其他胎盘细微组织及其他组织的干细胞相比，本发明的来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞具有可更均匀地分化成脂肪细胞的优秀的脂肪细胞分化能力。

[0102] 实施例8：验证来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞在软骨损伤动物模型中作为细胞治疗剂的效果

[0103] 为了验证在上述实施例1中获取的来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞在组织缺损动物模型中作为细胞治疗剂的效果，而进行了如下的实验。更具体地，为了制作家兔(rabbit)关节软骨损伤动物模型，而选择健康的家兔，并根据体重利用适量的氯胺酮和甲苯噻嗪进行注射麻醉后，确认家兔完全被全身麻醉，在剃掉两侧下肢的膝关节部位的毛后，在维持姿势的同时，使用医用胶布进行固定。使用聚维酮对两侧膝关节部位进行消毒，通过触摸确认髌骨位置后，沿着经过膝关节的上部及下部、髌骨的内侧的切割线通过旁正中入路(paramedian approach)到达膝关节内，通过向外侧掀动髌骨来弯曲膝关节，从而观察关节内部。在确认无特别病理结果后，从髁间窝(interchondylar notch)的上端前端向上1mm的位置上用尖锥制作伤痕后，以其为中心利用钻头制作直径为3mm且深度为5mm的孔，从而造成软骨全层(full thickness)损伤。在造成如上所述的软骨损伤8周和16周后，观察损伤部位，从而确认软骨损伤部位未自然愈合。利用注射器混合透明质酸和本发明的来源于滋养层基底层的干细胞后，向制作在上述动物模型的右侧的软骨损伤部位注入
500μL的上述混合液(上述500μL的量为考虑到组合物的量的缺少或者手术时失误的情况而为了手术的便利充分准备的量)。然后，将髌骨复原至原来位置后，利用吸水性线缝合髌骨周围的软组织，而且利用非吸水性线缝合皮肤。作为阳性对照组，混合透明质酸和来源于脐带血的干细胞，并以与上述混合液相同量注入相对侧腿。在确认家兔从麻醉中醒来后，允许家兔可自由的移动，为了防止手术后5天之内的感染而投入镇痛剂和抗生剂。经过8周和16周后，从各家兔获取造成过损伤及进行过治疗的关节软骨部位的切片，并进行苏木精-伊红及番红O(Safranin O)染色，通过利用国际软骨修复学会(ICRS，International Cartilage Repair Society)宏观评分(macroscopic score)的定量化分析新形成的软骨。在图13及图
14示出其结果。

[0104] 如图13及图14所示，与注入来源于脐带血的干细胞的组相比，注入本发明的来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞的组的新生成的软骨细胞层的整体厚度为2倍以上。因此，确认到来源于滋养层基底层(bCT)的干细胞在损伤的关节软骨部位中能够以优秀的效率生成软骨细胞，从而可有效地治疗关节软骨损伤。

[0105] 通过上述实验结果，可确认到在现有的来源于整个胎盘的干细胞混合有来源于具有多种特性的细微组织的干细胞，从而无法实现均匀地分化成互不相同的细胞的能力，与其相反，本发明的来源于作为胎盘的细微组织的滋养层基底层的干细胞在优秀的分化能力和针对其他干细胞的多种特性的匀质性的方面，与现有的来源于整个胎盘的干细胞相比，可实现优秀的特性。尤其，与来源于作为其他胎盘细微组织的绒毛膜、绒毛膜滋养层、滋养层及滋养层上层部的干细胞相比，本发明的来源于滋养层基底层的干细胞在成长、增殖、形态及分化的特性方面呈现一致的模式，而且呈现最优秀的干细胞的特性。因此，当使用上述来源于滋养层基底层的干细胞时，可提高分化成所需要的细胞的效率，在多种疾病方面可有效地用作细胞治疗剂。