诱导人褐色脂肪细胞祖细胞分化的方法和组合物

摘要

本发明涉及从人骨骼肌中发现的褐色脂肪祖细胞中体外和体内招募褐色脂肪细胞的组合物和方法。还提供治疗代谢疾病的方法。此外，提供治疗低体温症的方法。在一些实施方式中，褐色脂肪细胞招募者为人蛋白质或肽。在其他实施方式中，褐色脂肪细胞招募者可为非人蛋白质或肽。在其他实施方式中，褐色脂肪细胞招募者是小分子或天然产物。

权利要求

1.试剂在从分离自人骨骼肌的BAT祖细胞中招募褐色脂肪细胞中的用途，其中所述试剂选自以下的一种或多种：抗组胺剂例如法莫替丁；

抗多巴胺能剂例如盐酸硫必利或硫乙哌丙嗪或螺环哌啶酮；

微管蛋白配体例如秋水仙碱；

萝芙木生物碱或衍生物例如利血平或昔可平；

钾通道配体例如米诺地尔；

钙通道拮抗剂例如非洛地平；

丙磺舒；

前列腺素F2(PGF2)衍生物例如9β,11α-PGF2或9ɑ,11β-PGF2；

垂体腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)基因衍生的肽例如55aa(aa 25-79)的PACAP前肽；

类黄酮例如堪非醇；

成纤维细胞生长因子(FGF)例如FGF7或FGF10或FGF13；

瞬时受体潜在黑素抑制素8(TRPM8)配体例如薄荷醇或依色林；

韩蛙皮素；

基质细胞衍生因子1(SDF-1)例如同种型SDF-1γ；

环加氧酶抑制剂例如二氟苯水杨酸；

双胍例如二甲双胍；

磷酸二酯酶抑制剂例如PDE3抑制剂例如氰胍佐旦；

可溶鸟苷酸环化酶(sGC)的刺激物例如瑞斯固特；

b型利钠肽(BNP)；

睫状神经营养因子(CNTF)；

白介素6(IL-6)；

食欲素B；和

ɑ2肾上腺素能受体激动剂例如盐酸胍法辛。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述试剂选自以下的一种或多种：抗组胺剂例如法莫替丁；

抗多巴胺能剂例如盐酸硫必利或硫乙哌丙嗪；

微管蛋白配体例如秋水仙碱；

萝芙木生物碱或衍生物例如利血平或昔可平；

钾通道配体例如米诺地尔；

钙通道拮抗剂例如非洛地平；

丙磺舒；

前列腺素F2(PGF2)衍生物例如9β,11α-PGF2或9ɑ,11β-PGF2；

垂体腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)基因衍生的肽例如55aa(aa 25-79)的PACAP前肽；

类黄酮例如堪非醇；

成纤维细胞生长因子(FGF)例如FGF7或FGF10；

瞬时受体潜在黑素抑制素8(TRPM8)配体例如薄荷醇或依色林；

韩蛙皮素；

基质细胞衍生因子1(SDF-1)例如同种型SDF-1γ；和环加氧酶抑制剂例如二氟苯水杨酸。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂能体外或体内诱导或体内和体外均能诱导UCP1、FABP4(aP2)、PPARγ2、mtTFA、PGC-lα、和/或COX IV在BAT祖细胞中表达。

4.如权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂具有选自下组的一种或多种生物活性：(a)引起下述中一种或多种的增加或减少：β3肾上腺素能受体(β3-AR)、溶质载体家族

2、促葡萄糖转运蛋白成员4(SLC2A4)、极长链脂肪酸蛋白3伸长(ELOVL3)、CD36抗原、II型碘化甲状腺氨酸脱碘酶(DIO2)、BMP5、BMP6、FGF7、FGF10、FGF13、FGF21、脂肪酸结合蛋白7(FABP7)、CXCL12、非典型趋化因子受体3(ACKR3)、胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)、垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)、腺苷酸环化酶4(ADCY4)、细胞死亡活化剂CIDE-A(CIDEA)、分泌性卷曲相关蛋白1(SRFP1)、SRFP2、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子D(VEGF-D)、转化生长因子β-2(TGFB2)、cAMP-特异性3',5'-环磷酸二酯酶4B(PDE4B)、cAMP-特异性3',5'-环磷酸二酯酶4D(PDE4D)、高亲和性cAMP-特异性3',5'-环磷酸二酯酶7A(PDE7A)，和cAMP-特异性3',5'-环磷酸二酯酶7B(PDE7B)；

(b)引起褐色脂肪组织和/或骨骼肌组织产热增加；

(c)引起骨骼肌、白色脂肪组织或肝脏的胰岛素敏感度增加；

(d)引起葡萄糖耐受增加；

(e)引起基础呼吸、最大呼吸数或非偶联呼吸增加；

(f)引起代谢率增加；和

(g)引起肝脂肪变性减少。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述试剂引起下述中一种或多种的增加或减低：β3肾上腺素能受体(β3-AR)、溶质载体家族2、促葡萄糖转运蛋白成员4(SLC2A4)、极长链脂肪酸蛋白3伸长(ELOVL3)、CD36抗原和II型碘化甲状腺氨酸脱碘酶(DIO2)。

6.如权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂能调控对象的代谢响应或预防或治疗对象的代谢紊乱。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述代谢紊乱是以下的一种或多种：肥胖、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血压、高脂血症、肝脂肪变性、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、高尿酸血症、多囊卵巢综合征、黑棘皮病、贪食、内分泌异常、甘油三酯存储疾病、Bardet-Biedl综合征、Laurence-Moon综合征、Prader-Willi综合征、神经退行性疾病和阿尔茨海默氏症。

8.在需要的对象中促进褐色脂肪生成的方法，所述方法包括给予对象选自以下的一种或多种的试剂：抗组胺剂例如法莫替丁；

抗多巴胺能剂例如盐酸硫必利或硫乙哌丙嗪或螺环哌啶酮；

微管蛋白配体例如秋水仙碱；

萝芙木生物碱或衍生物例如利血平或昔可平；

钾通道配体例如米诺地尔；

钙通道拮抗剂例如非洛地平；

丙磺舒；

前列腺素F2(PGF2)衍生物例如9β,11α-PGF2或9ɑ,11β-PGF2；

垂体腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)基因衍生的肽例如55aa(aa 25-79)的PACAP前肽；

类黄酮例如堪非醇；

成纤维细胞生长因子(FGF)例如FGF7或FGF10或FGF13；

瞬时受体潜在黑素抑制素8(TRPM8)配体例如薄荷醇或依色林；

韩蛙皮素；

基质细胞衍生因子1(SDF-1)例如同种型SDF-1γ；

环加氧酶抑制剂例如二氟苯水杨酸；

双胍例如二甲双胍；

磷酸二酯酶抑制剂例如PDE3抑制剂例如氰胍佐旦；

可溶鸟苷酸环化酶(sGC)的刺激物例如瑞斯固特；

b型利钠肽(BNP)；

睫状神经营养因子(CNTF)；

白介素6(IL-6)；

食欲素B；和

ɑ2肾上腺素能受体激动剂例如盐酸胍法辛。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述试剂选自以下的一种或多种：抗组胺剂例如法莫替丁；

抗多巴胺能剂例如盐酸硫必利或硫乙哌丙嗪；

微管蛋白配体例如秋水仙碱；

萝芙木生物碱或衍生物例如利血平或昔可平；

钾通道配体例如米诺地尔；

钙通道拮抗剂例如非洛地平；

丙磺舒；

前列腺素F2(PGF2)衍生物例如9β,11α-PGF2或9ɑ,11β-PGF2；

垂体腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)基因衍生的肽例如55aa(aa 25-79)的PACAP前肽；

类黄酮例如堪非醇；

成纤维细胞生长因子(FGF)例如FGF7或FGF10；

瞬时受体潜在黑素抑制素8(TRPM8)配体例如薄荷醇或依色林；

韩蛙皮素；

基质细胞衍生因子1(SDF-1)例如同种型SDF-1γ；和环加氧酶抑制剂例如二氟苯水杨酸。

10.如权利要求8或9所述的方法，还包括调控对象的代谢响应和/或预防或治疗对象的代谢紊乱。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述代谢紊乱是以下的一种或多种：肥胖、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血压、高脂血症、肝脂肪变性、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、高尿酸血症、多囊卵巢综合征、黑棘皮病、贪食、内分泌异常、甘油三酯存储疾病、Bardet-Biedl综合征、Laurence-Moon综合征、Prader-Willi综合征、神经退行性疾病和阿尔茨海默氏症。

12.如权利要求8所述的方法，还包括使对象的细胞接触所述试剂。

13.如权利要求12所述的方法，还包括在所述接触步骤后将所述细胞移植入对象。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述细胞是分离自人骨骼肌的BAT祖细胞。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述细胞对CD34为阳性。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述细胞对CD31为阴性。

17.预防对象低体温症的方法，包括给予对象选自以下的一种或多种的试剂：抗组胺剂例如法莫替丁；

抗多巴胺能剂例如盐酸硫必利或硫乙哌丙嗪或螺环哌啶酮；

微管蛋白配体例如秋水仙碱；

萝芙木生物碱或衍生物例如利血平或昔可平；

钾通道配体例如米诺地尔；

钙通道拮抗剂例如非洛地平；

丙磺舒；

前列腺素F2(PGF2)衍生物例如9β,11α-PGF2或9ɑ,11β-PGF2；

垂体腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)基因衍生的肽例如55aa(aa 25-79)的PACAP前肽；

类黄酮例如堪非醇；

成纤维细胞生长因子(FGF)例如FGF7或FGF10或FGF13；

瞬时受体潜在黑素抑制素8(TRPM8)配体例如薄荷醇或依色林；

韩蛙皮素；

基质细胞衍生因子1(SDF-1)例如同种型SDF-1γ；

环加氧酶抑制剂例如二氟苯水杨酸；

双胍例如二甲双胍；

磷酸二酯酶抑制剂例如PDE3抑制剂例如氰胍佐旦；

可溶鸟苷酸环化酶(sGC)的刺激物例如瑞斯固特；

b型利钠肽(BNP)；

睫状神经营养因子(CNTF)；

白介素6(IL-6)；

食欲素B；和

ɑ2肾上腺素能受体激动剂例如盐酸胍法辛。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述试剂选自以下的一种或多种：抗组胺剂例如法莫替丁；

抗多巴胺能剂例如盐酸硫必利或硫乙哌丙嗪；

微管蛋白配体例如秋水仙碱；

萝芙木生物碱或衍生物例如利血平或昔可平；

钾通道配体例如米诺地尔；

钙通道拮抗剂例如非洛地平；

丙磺舒；

前列腺素F2(PGF2)衍生物例如9β,11α-PGF2或9ɑ,11β-PGF2；

垂体腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)基因衍生的肽例如55aa(aa 25-79)的PACAP前肽；

类黄酮例如堪非醇；

成纤维细胞生长因子(FGF)例如FGF7或FGF10；

瞬时受体潜在黑素抑制素8(TRPM8)配体例如薄荷醇或依色林；

韩蛙皮素；

基质细胞衍生因子1(SDF-1)例如同种型SDF-1γ；和环加氧酶抑制剂例如二氟苯水杨酸。

说明书

诱导人褐色脂肪细胞祖细胞分化的方法和组合物

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本发明要求2014年2月24日提交的美国临时申请号61/966,496的优先权和权益，其全部内容通过引用纳入本文。

技术领域

[0003] 本发明涉及在例如2型糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗和血脂障碍的情况中增加褐色脂肪细胞和/或褐色脂肪细胞质量的组合物和方法。具体地，本发明鉴定和描述增加或促进从骨骼肌分离的褐色脂肪组织(BAT)祖细胞分化为褐色脂肪细胞的化合物。此外，本发明鉴定和描述与涉及褐色脂肪细胞分化和/或质量的调控的基因产物相互作用的化合物。此外，本发明提供鉴定预防和治疗2型糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗和血脂障碍的化合物的方法及其治疗应用。本文用于研究、预防、和治疗各种代谢疾病例如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抵抗和血脂障碍。

[0004] 背景

[0005] 肥胖的流行性与糖尿病、高血压、冠心病、癌症和其他疾病的流行增加密切相关。白色脂肪组织的作用是储存脂质，并且其与肥胖关联。褐色脂肪组织("BAT")的作用是实际上与之相反。其专门用于脂质燃烧和能量耗散为热量。事实上，褐色脂肪细胞包含大量线粒体(其中发生细胞燃烧)并且独特表达解偶联蛋白质-1("UCP1")。UCP1作为氧化磷酸化的解偶联剂，导致能量耗散为热量。交感神经系统刺激线粒体发生和UCP1表达及活性。啮齿动物中BAT关联的产热作用在低温暴露后增加(例如预防低体温症)，或者导致过热、燃烧过量吸收的脂肪和预防体重增加。通过改变对体重增加的易感性和通过消耗大量葡萄糖，BAT也改善胰岛素敏感度。因此其在维持体温、能量平衡和葡萄糖代谢方面有重要作用。

[0006] 转基因动物实验支持了BAT潜在的抗肥胖特性。例如，已报道BAT的遗传消融会引起肥胖，而BAT含量和/或功能(和/或UCP1表达)的增加据报道会促进瘦且健康的表型。具体地，具有较高含量BAT的小鼠比对照小鼠的体重增加更少并且胰岛素敏感性更高。近期，异位BAT长效制剂在小鼠肌肉中得到证实，其显示出保护免于体重增加和代谢综合征的遗传机制。

[0007] 虽然UCP1据报道在控制啮齿动物能量平衡方面起作用，并且在人新生儿中存在表达UCP1的BAT，但长期认为成人中没有生理相关的UCP1表达。事实上，表达UCP1的BAT据信在生命早期即消失，而且成人据信不含BAT。然而近期大量研究证实事实上BAT在大多数成人中维持，尽管其处于比新生儿和儿童明显低的水平。

[0008] 因此，需要仔细鉴定和研究在成年体内提供更多BAT和/或刺激UCP1表达的方法，用于研究、预防和治疗各种代谢疾病例如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抵抗、血脂障碍和1型糖尿病。

[0009] 在例如PCT公开号WO2009151541和WO2013071063中，申请人先前鉴定到各种组织中存在能分化为褐色脂肪细胞的细胞，二者全文通过引用纳入本文。然而，仍需要能例如诱导UCP基因表达、促进BAT祖细胞体外分化为褐色脂肪细胞、促进BAT祖细胞体内分化为褐色脂肪细胞或这些活性的组合的试剂(例如化合物、蛋白质、生物制品等)。

[0010] 概述

[0011] 本发明提供从人骨骼肌中发现的BAT祖细胞中体外和体内招募或生产褐色脂肪细胞的组合物。这些试剂或其组合可用于促进BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞和/或诱导UCP1、FABP4(aP2)、PPARγ2、mtTFA、PGC-lα和/或COX IV在BAT祖细胞中体外或体内表达，或体内体外均表达。此外，这些试剂可用于治疗患者的代谢疾病，包括但不限于肥胖症、糖尿病、胰岛素抵抗、高血脂症，和其他症状。

[0012] 本发明部分基于如下发现：不同蛋白质、肽和小分子(统称试剂)在BAT祖细胞分化中起重要作用。具体地，已发现本文公开的不同试剂显著诱导从人骨骼肌分离的BAT祖细胞分化为成熟、功能性褐色脂肪细胞。用一种或多种这些不同试剂处理这些BAT祖细胞诱发这些细胞进行褐色脂肪细胞分化。在一些情况中，用试剂处理一段时间(例如数小时、1天、2天、3天或更短或更长)后引入脂肪生成培养基导致褐色脂肪细胞分化。在其他情况中，引入脂肪生成培养基的同时和/或之后用试剂处理导致褐色脂肪细胞分化。

[0013] 由于褐色脂肪组织(BAT)独特用于能量支出，本文所述试剂有用于治疗肥胖和相关紊乱，例如糖尿病。该试剂还可用于减少对象(包括食用动物)中脂肪储存，从而例如改善其肉质。

[0014] 因此，在一个方面，本发明特征为治疗对象的方法，例如降低对象例如人的脂肪储存或重量。所述方法包括给予对象治疗有效量的本文试剂或试剂组合。

[0015] 在其他方面，本文特征为需要降低脂肪储存或体重的对象的治疗方法，包括给予试剂活化的BAT祖细胞群，其中所述试剂活化的祖细胞群经历褐色脂肪细胞生成。所述方法可任选包括鉴定需要减少脂肪储存或体重的对象。

[0016] 在其他方面，本文包括提高对象(例如对胰岛素有抗性的对象)的胰岛素敏感性的方法。所述方法包括给予对象试剂和/或试剂活化的BAT祖细胞群，其中所述试剂活化的BAT祖细胞群经历褐色脂肪细胞生成。所述方法可任选包括鉴定需要提高胰岛素敏感性的对象。

[0017] 在另一方面，本文特征为调控对象中褐色脂肪组织功能或发育(例如促进BAT脂肪细胞生成)的方法。所述方法包括给予对象试剂和/或试剂活化的BAT祖细胞群，其中所述试剂活化的祖细胞群经历褐色脂肪细胞生成。

[0018] 在一些实施方式中，本文方法可包括将试剂活化的BAT祖细胞群植入对象。试剂活化的细胞可直接植入或可以支架、基质或细胞可附连的其他可植入装置的形式给予(示例包括由下述制成的运载体：例如胶原蛋白、纤维粘连蛋白、弹力蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶、自组装的小肽及其组合)。通常，所述方法包括植入试剂活化的BAT祖细胞群，所述群包括足量的细胞以促进对象中褐色脂肪细胞质量增加，例如对象中褐色脂肪细胞增加至少1％、例如2％、5％、7％、10％、15％、20％、25％或更多。

[0019] 在一些实施方式中，所述方法包括通过使从对象分离的BAT祖细胞接触一种或多种本文所述试剂，评估对象中BAT脂肪细胞生成的水平。BAT分化可通过测量下述任意来评估：例如BAT标记物、例如解偶联蛋白(UCP)表达，例如UCP1；BAT形态(例如使用视觉观察细胞，如通过显微镜)；或BAT热力学，例如细胞色素氧化酶的活性、Na+-K+-ATP酶的酶单位或其他参与BAT产热的酶。

[0020] 通常，所述对象能是哺乳动物。在一些实施方式中，所述对象是人对象，例如肥胖人对象。在一些实施方式中，所述对象是非人哺乳动物，例如实验动物、伴侣动物、或家畜，例如为食用饲养的奶牛、猪、或羊。通常，当蛋白质或肽用于从BAT祖细胞招募褐色脂肪细胞时，所述蛋白质或肽将来自对象的相同或相关物种，例如人、猫、狗、奶牛、猪或羊。所述蛋白质或肽还可针对对象为异源。

[0021] 在一些实施方式中，所述方法包括评估对象的下述的一种或多种：重量、白色脂肪组织储存、褐色脂肪组织储存、脂肪组织形态、胰岛素水平、胰岛素代谢、葡萄糖水平、产热能力和寒冷敏感度。评估可在给予所述试剂和/或试剂诱导的BAT祖细胞之前、期间和/或之后进行。例如，所述评估可在给药之前和/或之后至少1天、2天、4天、7天、14天、21天、30天或更多或更少时进行。

[0022] 在一些实施方式中，所述方法包括用试剂或植入试剂诱导的BAT祖细胞的一个或多个额外治疗回合，从而例如增加褐色脂肪细胞质量，继而例如维持或进一步减低对象的肥胖。

[0023] 在一些实施方式中，使用蛋白质或肽试剂时，BAT祖细胞可经遗传工程改造以稳定表达或瞬时表达更高水平的该蛋白质或肽。该细胞可为例如培养的哺乳动物细胞例如人细胞。使用的表达的重组蛋白或肽通常来自与BAT祖细胞相同或相关的物种，例如人细胞中表达的人蛋白质或肽。重组的蛋白质或肽还可针对BAT祖细胞为异源。

[0024] 在其他方面中，本文提供一种或多种本文所述试剂的用途，用于促进BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞和/或诱导UCP1、FABP4(aP2)、PPARγ2、mtTFA、PGC-lα和/或COX IV在BAT祖细胞中体外或体内表达，或体内体外均表达。

[0025] 本文还提供一种或多种本文所述试剂的用途，用于治疗选自下组的一种或多种疾病或病症：超重、肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、高胰岛素血症、高血压、高脂血症、肝脂肪变性、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、高尿酸血症、多囊卵巢综合征、黑棘皮病、贪食、内分泌异常、甘油三酯存储疾病、Bardet-Biedl综合征、Laurence-Moon综合征、Prader-Willi综合征、神经退行性疾病和阿尔茨海默氏症。还提供用于治疗前述疾病的方法，包括给予需要的对象一种或多种本文所述试剂。

[0026] 另一方面涉及药物组合物，包括一种或多种本文所述试剂和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体。

[0027] 一个具体方面涉及试剂在从分离自人骨骼肌的BAT祖细胞中招募褐色脂肪细胞中的用途，其中所述试剂选自以下的一种或多种：

[0028] 抗组胺剂例如法莫替丁；

[0029] 抗多巴胺能剂例如盐酸硫必利或硫乙哌丙嗪或螺环哌啶酮；

[0030] 微管蛋白配体例如秋水仙碱；

[0031] 萝芙木生物碱或衍生物例如利血平或昔可平；

[0032] 钾通道配体例如米诺地尔；

[0033] 钙通道拮抗剂例如非洛地平；

[0034] 丙磺舒；

[0035] 前列腺素F2(PGF2)衍生物例如9β,11α-PGF2或9ɑ,11β-PGF2；

[0036] 垂体腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)基因衍生的肽例如55aa(aa 25-79)的PACAP前肽；

[0037] 类黄酮例如堪非醇；

[0038] 成纤维细胞生长因子(FGF)例如FGF7或FGF10或FGF13；

[0039] 瞬时受体潜在黑素抑制素8(TRPM8)配体例如薄荷醇或依色林；

[0040] 韩蛙皮素；

[0041] 基质细胞衍生因子1(SDF-1)例如同种型SDF-1γ；

[0042] 环加氧酶抑制剂例如二氟苯水杨酸；

[0043] 双胍例如二甲双胍；

[0044] 磷酸二酯酶抑制剂例如PDE3抑制剂例如氰胍佐旦；

[0045] 可溶鸟苷酸环化酶(sGC)的刺激物例如瑞斯固特；

[0046] b型利钠肽(BNP)；

[0047] 睫状神经营养因子(CNTF)；

[0048] 白介素6(IL-6)；

[0049] 食欲素B；和

[0050] ɑ2肾上腺素能受体激动剂例如盐酸胍法辛。

[0051] 在一些实施方式中，所述试剂选择以下的一种或多种：

[0052] 抗组胺剂例如法莫替丁；

[0053] 抗多巴胺能剂例如盐酸硫必利或硫乙哌丙嗪；

[0054] 微管蛋白配体例如秋水仙碱；

[0055] 萝芙木生物碱或衍生物例如利血平或昔可平；

[0056] 钾通道配体例如米诺地尔；

[0057] 钙通道拮抗剂例如非洛地平；

[0058] 丙磺舒；

[0059] 前列腺素F2(PGF2)衍生物例如9β,11α-PGF2或9ɑ,11β-PGF2；

[0060] 垂体腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)基因衍生的肽例如55aa(aa 25-79)的PACAP前肽；

[0061] 类黄酮例如堪非醇；

[0062] 成纤维细胞生长因子(FGF)例如FGF7或FGF10；

[0063] 瞬时受体潜在黑素抑制素8(TRPM8)配体例如薄荷醇或依色林；

[0064] 韩蛙皮素；

[0065] 基质细胞衍生因子1(SDF-1)例如同种型SDF-1γ；和

[0066] 环加氧酶抑制剂例如二氟苯水杨酸。

[0067] 在一些实施方式中，所述试剂能体外或体内诱导或体内和体外均能诱导UCP1、FABP4(aP2)、PPARγ2、mtTFA、PGC-lα、和/或COX IV在BAT祖细胞中表达。

[0068] 在一些实施方式中，试剂可具有选自下组的一种或多种生物活性：

[0069] (a)引起下述中一种或多种增加或减少：β3肾上腺素能受体(β3-AR)、溶质载体家族2、促葡萄糖转运蛋白成员4(SLC2A4)、极长链脂肪酸蛋白3伸长(ELOVL3)、CD36抗原、II型碘化甲状腺氨酸脱碘酶(DIO2)、BMP5、BMP6、FGF7、FGF10、FGF13、FGF21、脂肪酸结合蛋白7(FABP7)、CXCL12、非典型趋化因子受体3(ACKR3)、胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)、腺苷酸环化酶4(ADCY4)、细胞死亡活化剂CIDE-A(CIDEA)、分泌性卷曲相关蛋白1(SRFP1)、SRFP2、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子D(VEGF-D)、转化生长因子β-2(TGFB2)、cAMP-特异性3',5'-环磷酸二酯酶4B(PDE4B)、cAMP-特异性3',5'-环磷酸二酯酶4D(PDE4D)、高亲和性cAMP-特异性3',5'-环磷酸二酯酶7A(PDE7A)，和cAMP-特异性3',5'-环磷酸二酯酶7B(PDE7B)；

[0070] (b)引起褐色脂肪组织和/或骨骼肌组织产热增加；

[0071] (c)引起骨骼肌、白色脂肪组织或肝脏的胰岛素敏感度增加；

[0072] (d)引起葡萄糖耐受增加；

[0073] (e)引起基础呼吸、最大呼吸数或非偶联呼吸增加；

[0074] (f)引起代谢率增加；和

[0075] (g)引起肝脂肪变性减少。

[0076] 在一些实施方式中，所述试剂可引起下述的一种或多种的增加或减少：β3肾上腺素能受体(β3-AR)、溶质载体家族2、促葡萄糖转运蛋白成员4(SLC2A4)、极长链脂肪酸蛋白3伸长(ELOVL3)、CD36抗原和II型碘化甲状腺氨酸脱碘酶(DIO2)。

[0077] 在一些实施方式中，所述试剂能调控对象的代谢响应或预防或治疗对象的代谢紊乱。在一些实施方式中，所述代谢紊乱可为以下的一种或多种：肥胖、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血压、高脂血症、肝脂肪变性、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、高尿酸血症、多囊卵巢综合征、黑棘皮病、贪食、内分泌异常、甘油三酯存储疾病、Bardet-Biedl综合征、Laurence-Moon综合征、Prader-Willi综合征、神经退行性疾病和阿尔茨海默氏症。

[0078] 另一方面涉及在需要的对象中促进褐色脂肪生成的方法，所述方法包括给予对象选自一种或多种本文所述试剂的试剂。在一些实施方式中，所述方法还可包括调控对象的代谢响应和/或预防或治疗对象的代谢紊乱。所述代谢紊乱可为以下的一种或多种：肥胖、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血压、高脂血症、肝脂肪变性、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、高尿酸血症、多囊卵巢综合征、黑棘皮病、贪食、内分泌异常、甘油三酯存储疾病、Bardet-Biedl综合征、Laurence-Moon综合征、Prader-Willi综合征、神经退行性疾病和阿尔茨海默氏症。在一些实施方式中，所述方法还包括使对象细胞接触试剂和任选在所述接触步骤后移植所述细胞到对象中。在一些实施方式中，所述细胞可为分离自人骨骼肌的BAT祖细胞。所述细胞可对CD34为阳性和/或对CD31为阴性。

[0079] 除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。本文所述方法和材料用于本公开；本领域已知的其他合适的方法和材料也可使用。材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利、数据库条目和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。

附图说明

[0080] 图1显示不同试剂(在第-3天至d0和d0至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对PPARγ2mRNA表达的效果。

[0081] 图2显示不同试剂(在第-3天至d0和d0至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对PPARγ2mRNA表达的效果。

[0082] 图3显示不同试剂(在第-3天至d0和d0至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对UCP1mRNA表达的效果。

[0083] 图4显示不同试剂(在第-3天至d0和d0至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对UCP1mRNA表达的效果。

[0084] 图5显示不同试剂(在第-3天至d0与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对PPARγ2mRNA表达的效果。

[0085] 图6显示不同试剂(在第-3天至d0与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对PPARγ2mRNA表达的效果。

[0086] 图7显示不同试剂(在第-3天至d0与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对PPARγ2mRNA表达的效果。

[0087] 图8显示不同试剂(在第-3天至d0和d0至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对PPARγ2mRNA表达的效果。

[0088] 图9显示不同试剂(在第-3天至d0和d0至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对UCP1mRNA表达的效果。

[0089] 图10显示FGF7和FGF10(均为100nM，在第-3天至d0和d0至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对UCP1mRNA表达的效果。

[0090] 图11显示FGF7和FGF10(均为100nM，在第-3天至d0和d0至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对PPARγ2mRNA表达的效果。

[0091] 图12显示FGF7(1nM，在第0天至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对UCP1mRNA表达的效果。罗格列酮(rosi,1μM)、骨形态发生蛋白-7(bmp7,6nM)或rosi和bmp7均在第-3天至d0与细胞孵育。

[0092] 图13显示FGF7(1nM，在第0天至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对PPARγ2mRNA表达的效果。罗格列酮(rosi,1μM)、骨形态发生蛋白-7(bmp7,6nM)或rosi和bmp7均在第-3天至d0与细胞孵育。

[0093] 图14显示FGF10(10nM，在第-3天至d0与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对UCP1mRNA表达的效果。罗格列酮(rosi,1μM)、骨形态发生蛋白-7(bmp7,6nM)或rosi和bmp7均在第-3天至d0与细胞孵育。

[0094] 图15显示FGF10(10nM，在第-3天至d0与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对PPARγ2mRNA表达的效果。罗格列酮(rosi,1μM)、骨形态发生蛋白-7(bmp7,6nM)或rosi和bmp7均在第-3天至d0与细胞孵育。

[0095] 图16显示FGF7(1nM，在第0天至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)或FGF10(10nM，在第-3天至d0与所述细胞孵育)对UCP1mRNA表达的效果。罗格列酮(rosi,1μM)、骨形态发生蛋白-7(bmp7,6nM)或rosi和bmp7均在第-3天至d0与细胞孵育。

[0096] 图17显示FGF7(1nM，在第0天至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)或FGF10(10nM，在第-3天至d0与所述细胞孵育)对PPARγ2mRNA表达的效果。罗格列酮(rosi,1μM)、骨形态发生蛋白-7(bmp7,6nM)或rosi和bmp7均在第-3天至d0与细胞孵育。

[0097] 图18显示不同试剂(在第-3天至d0和d0至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对PPARγ2mRNA表达的效果。

[0098] 图19显示不同试剂(在第-3天至d0和d0至d3与褐色脂肪细胞祖细胞孵育)对UCP1mRNA表达的效果。

[0099] 图20A-20C显示荧光显微图，揭示UCP1蛋白表达的免疫组化(IHC)分析结果(FITC,绿色)和细胞核数量(DAPI,蓝色)。在接触罗格列酮(1μM)后于最小分化培养基(MDM)中分化8天的CD31-细胞深度分化为高水平表达UCP1的褐色脂肪细胞(图20A)，而未接触罗格列酮的细胞显示出低很多水平的分化和UCP1表达(图20B)。维持在增殖培养基(EGM-2)中的细胞未分化并且未表达UCP1(图20C)。

[0100] 图21显示褐色脂肪细胞祖细胞在不同条件下(rosi和BMP-7在第-3天至d0天使用)培养9天后经诱导分化后的BODIPY 500/510C1,C12荧光信号。

[0101] 图22显示荧光显微结果，揭示了细胞内脂质液滴形成的BODIPY试验结果(BODIPY 500/510C1,C12,绿)。CD31-细胞在接触罗格列酮(1μM)3天后(第-3天至第0天)于最小分化培养基(MDM)中分化8天。

[0102] 图23A-23H显示CD31-细胞的光学显微镜照片，显示在用促进褐色脂肪细胞形成的数种试剂处理后引起褐色脂肪细胞分化。图23A：载剂(DMSO)。图23B：罗格列酮。图23C:BMP7。图23D:二氟苯水杨酸。图23E:昔可平。图23F:山柰酚。图23G:丙磺舒(Probenecid)。图
23H:硫必利。

[0103] 发明详述

[0104] 本文所用“试剂活化的”表示BAT祖细胞已经用一种或多种本文所述试剂处理并且至少部分定向为分化成褐色脂肪细胞。所述细胞可为自体的、同种异体的或异种的。“褐色脂肪细胞生成”表示从BAT祖细胞经体内、体外或部分体内和部分体外生成褐色脂肪细胞。应理解褐色脂肪细胞生成可被诱导，即所谓“BAT祖细胞”在被例如本文所述一种或多种试剂诱导前并不必然定向至分化为褐色脂肪细胞并且可从干细胞或体细胞重编程或转分化为褐色脂肪细胞。“招募褐色脂肪细胞”表示促进或增加BAT祖细胞向褐色脂肪细胞的分化，和/或增加褐色脂肪细胞体内和/或体外的含量或浓度。

[0105] 本文提供促进BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞和/或诱导UCP1基因体内表达、体外表达或体内体外均表达的试剂(例如化合物、蛋白质、生物制品等)。该试剂可通过筛选化合物、蛋白质、生物制品等来鉴定。例如，在一些实施方式中，BAT祖细胞(例如分离自人骨骼肌的那些)可用于就诱导UCP基因表达和/或BAT祖细胞向褐色脂肪细胞分化的能力来筛选试剂。以此方法鉴定的试剂可用于各种研究、诊断和治疗目的，包括例如治疗代谢疾病例如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性、血脂障碍等。在一些实施方式中，通过本文所述试验鉴定的试剂在改善其物理化学性质和/或药代动力学性质而言最优化。

[0106] BAT祖细胞体外和体内表达UCP1、FABP4(aP2)、PPARγ2、mtTFA、PGC-lα、和/或COX IV可根据本文所述方法得到提高。在一些实施方式中，接触脂肪生成培养基可用于刺激BAT祖细胞中UCP1、FABP4(aP2)、PPARγ2、mtTFA、PGC-lα、和/或COX IV的表达增加。

[0107] 因此，在一些实施方式中，下述试剂或其组合可用于促进BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞和/或诱导UCP1、FABP4(aP2)、PPARγ2、mtTFA、PGC-lα和/或COX IV在BAT祖细胞中体外或体内表达，或体内体外均表达：PDE3抑制剂(例如氰胍佐旦)、PDE4抑制剂(例如咯利普兰)、前列腺素F2(PGF2)衍生物例如9β,11α-前列腺素F2或9ɑ,11β-前列腺素F2、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP,ADCYAP1,UniProt P18509)基因衍生的肽(例如一部分)例如55aa(aa 25-79)的PACAP前肽、BDNF(脑源性神经营养因子)、TGR5激动剂例如齐墩果酸、BMP-7、类黄酮例如山柰酚(KMP,CAS编号 520-18-3)、可溶鸟苷酸环化酶(sGC)的刺激物例如瑞斯固特(riociguat)(BAY 63-2521,CAS 625115-55-1)、成纤维细胞生长因子(例如FGF7(成纤维细胞生长因子-7、KGF、角化细胞生长因子)、FGF10(成纤维细胞生长因子-10、KGF-2、角化细胞生长因子-2)、或FGF13(成纤维细胞生长因子-13))、BNP(b-型利钠肽)、TRPM8(CMRI)配体例如薄荷醇或依色林、铃蟾肽例如来自蟾蜍的(UniProt P84214)、CNTF(睫状神经营养因子,UniProt P05231)、白介素-6(IL-6)、食欲素B、SDF-1γ(CXCL12)、或盐酸胍法辛。

[0108] 此外，在其他实施方式中，可用于促进BAT祖细胞向褐色脂肪细胞分化和/或诱导UCP1表达的其他试剂或其组合包括前列腺素J2(PGJ2)、24(S)-羟基胆固醇、各种形式的维生素D、例如1,25-二羟基维生素D3或 24,25-二羟基维生素D3、和环加氧酶抑制剂例如二氟苯水杨酸。

[0109] 在其他实施方式中，可用于促进BAT祖细胞向褐色脂肪细胞分化和/或诱导UCP1表达的额外试剂或其组合包括骨形态发生蛋白例如BMP5(骨形态发生蛋白5,UniProt P22003)和BMP6(骨形态发生蛋白6,UniProt P22004)、血小板衍生生长因子受体样蛋白(PDGFRL,UniProt Q15198)、血管内皮生长因子D(VEGF-D、FIGF、UniProt O43915)、CYTL1(细胞因子样蛋白1,UniProt Q9NRR1)、SCG2(分泌粒蛋白-2,UniProt P13521)、NPTX2(神经元五聚蛋白-2,UniProt P47972),OLFML2B(嗅球蛋白样蛋白2B,UniProt Q68BL8),TFPI2(组织因子通路抑制剂2,UniProt P48307)、IFNE(干扰素ε,UniProt Q86WN2)、前列腺素F2-ɑ受体(PTGFR,前列腺素类FP受体,UniProt P43088)配体例如前列腺素F2、CNTF(睫状神经营养因子)、白介素-6(IL-6,UniProt P05231)、白介素-15(IL-15,UniProt P40933),CXCL12((趋化因子(C-X-C基序)配体 12)、基质细胞-衍生因子1、SDF1、UniProt P48061同种型SDF-1g/UniProt P48061-3)、和/或非典型趋化因子受体3(ACKR3、CMKOR1、CXCR7、GPR159、RDC1、UniProt P25106)的配体例如SDF1(CXCL12)。

[0110] 在其他实施方式中，可用于促进BAT祖细胞向褐色脂肪细胞分化和/或诱导UCP1表达的其他试剂或其组合包括双胍如二甲双胍、抗组胺剂例如法莫替丁、抗多巴胺能剂如盐酸硫必利、螺环哌啶酮、硫乙拉嗪、微管调控剂如秋水仙碱、萝芙木生物碱或衍生物例如利血平或昔可平、钾通道配体如米诺地尔、丙磺舒(Probenecid)或钙通道拮抗剂如非洛地平。

[0111] 在一些实施方式中，用本文试剂之一或组合治疗对象(包括人对象)导致对象骨骼肌中的UCP1mRNA或蛋白质生产增加。例如，在一些实施方式中，用罗格列酮治疗对象诱导骨骼肌中褐色脂肪细胞的出现或分化、增加骨骼肌中或附近(肌纤维之间，位于骨骼肌组织的表面和/或邻近处)存在的褐色脂肪细胞中UCP1基因的表达、或二者兼有。在一些实施方式中，骨骼肌中褐色脂肪细胞的出现或分化可在患有代谢疾病的对象中诱导。褐色脂肪细胞可提供具有高线粒体和细胞呼吸和脂肪酸氧化率的葡萄糖储器，将能量消散为热量(解偶联的氧化磷酸化)。对象代谢率可增加并且可经诱导而降低体重。诱导褐色脂肪细胞出现或分化还可使胰岛素敏感性、血糖内稳态和心血管疾病风险因素得到改善。褐色脂肪细胞还可分泌用于达到健康能量平衡和低体脂水平、增加胰岛素敏感度并改善血糖内稳态或心血管健康的因子。

[0112] 因此，在一些实施方式中，本文试剂或其组合可用于治疗对象，包括人对象。在一些方面，这些试剂可促进BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞。在其他方面，这些试剂可诱导体外或体内诱导或体内和体外均能诱导UCP1、FABP4(aP2)、PPARγ2、mtTFA、PGC-lα、和/或COX IV在BAT祖细胞中表达。

[0113] 在一些方面，治疗的代谢疾病可为肥胖、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血压、高脂血症、肝脂肪变性、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、高尿酸血症、多囊卵巢综合征、黑棘皮病、贪食、内分泌异常、甘油三酯存储疾病、Bardet-Biedl综合征、Laurence-Moon综合征、Prader-Willi综合征、神经退行性疾病和阿尔茨海默氏症。

[0114] 在其他实施方式中，试剂可用于活化分离的自体BAT祖细胞，其然后用于治疗对象，包括人对象。

[0115] 鉴定分子通路

[0116] 进行基因芯片研究以鉴定在CD31-祖细胞分化为褐色脂肪细胞中和/或诱导UCP1表达中起作用的分子通路。根据WO2013071063先前所述从人骨骼肌活检中分离CD31-细胞，其通过引用纳入本文，所述CD31-细胞用于下述两个研究：(1)cAMP研究：根据WO2013071063所述分化CD31-细胞并通过引用纳入本文(对照)+添加载剂(对照1样品)或cAMP(cAMP样品)；和(2)罗格列酮研究：根据WO2013071063所述分化CD31-细胞，除了罗格列酮从脂肪生成培养基中忽略(对照2样品)。在该研究中仅在第二样品(罗格列酮样品)中加入罗格列酮。如上所述，这些试剂已显示为促进CD31-细胞分化为褐色脂肪细胞和UCP1表达。

[0117] 从这些样品中纯化总RNA，并且用Illumina人WG-6珠芯片(北卡罗来纳州达勒姆的表达分析公司(Expression Analysis,Inc.))评估转录概况。用新式通路分析(Ingenuity Pathway Analysis)7.0(试验版本)分析结果。这些结果用于确定哪种分子通路参与CD31-细胞分化为褐色脂肪细胞，以及更重要地，确定哪种分子通路可用于开发促进褐色脂肪细胞出现和UCP1表达的试剂。

[0118] 基于该工作，发现下述机制和试剂促进从BAT祖细胞向褐色脂肪细胞的发育：PPARγ配体(例如罗格列酮),PDE3抑制剂(例如氰胍佐旦),PDE4抑制剂(例如咯利普兰),BMP7(骨形态发生蛋白7,UniProt P18075),BMP5(骨形态发生蛋白5,UniProt P22003),BMP6(骨形态发生蛋白6,UniProt P22004),FGF7(成纤维细胞生长因子-7,KGF,角化细胞生长因子),FGF10(成纤维细胞生长因子-10,KGF-2,角化细胞生长因子-2),BNP(b-型钠尿肽),FGF13(成纤维细胞生长因子-13),BDNF(脑源性神经营养因子),可溶鸟苷酸环化酶(sGC)的刺激物(例如瑞斯固特(BAY 63-2521,CAS 625115-55-1)、TRPM8(CMRI)配体(例如薄荷醇、依色林),血小板衍生生长因子受体样蛋白(PDGFRL,UniProt Q15198),血管内皮生长因子D(VEGF-D,FIGF,UniProt O43915),CYTL1(细胞因子样蛋白质1,UniProt Q9NRR1),SCG2(分泌粒蛋白-2,UniProt P13521),NPTX2(神经元五聚蛋白-2,UniProt P47972),OLFML2B(嗅球蛋白样蛋白2B,UniProt Q68BL8),TFPI2(组织因子通路抑制剂2,UniProt P48307),IFNE(干扰素ε,UniProt Q86WN2),和前列腺素F2-ɑ受体(PTGFR,前列腺素类FP受体,UniProt P43088)配体例如前列腺素F2。基于基因芯片数据发现的可促进从BAT祖细胞向褐色脂肪细胞的发育的其他机制/试剂包括：垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP,ADCYAP1,UniProt P18509)基因衍生的肽例如55aa(aa 25-79)的PACAP前肽(200nM-2μM)、CNTF(睫状神经营养因子)、白介素-6(IL-6,UniProt P05231)、白介素-15(IL-15,UniProt P40933)、CXCL12(趋化因子(C-X-C基序)配体 12)、基质细胞衍生因子1(SDF1,UniProt P48061)同种型SDF-1g/UniProt P48061-3)和/或非典型趋化因子受体3(ACKR3,CMKOR1,CXCR7,GPR159,RDC1,UniProt P25106)的配体例如SDF1(CXCL12)。

[0119] 筛选人UCP1mRNA的潜在调控剂

[0120] CD31-细胞可用作鉴定诱导这些细胞分化为褐色脂肪细胞或调控UCP1表达的试剂(例如化合物、蛋白质、生物制品等)的工具。例如，基于RT-PCR的方法可用于测量UCP1mRNA水平，其可受到某些试剂影响。

[0121] 这允许鉴定这样的试剂，其能提高CD31-细胞向褐色脂肪细胞分化和/或通过提高UCP1基因转录和/或通过稳定UCP1转录本而增加UCP1表达。

[0122] 例如，PPARγ配体例如罗格列酮可用于促进CD31-祖细胞分化为褐色脂肪细胞(图1-19,20A,21,22)。其他示例为使用重组蛋白，人BMP-7(图1-19,21)。

[0123] WO2013071063中在先公开并通过引用纳入本文的强有力方法通过同时定量对应于褐色脂肪细胞标记物UCP1、脂肪细胞标记物PPARγ2、和用作对照的“管家”基因亲环蛋白A的mRNA物质来检测CD31-细胞向褐色脂肪细胞的分化。

[0124] 该方法允许分析大量样品以鉴定能提高CD31-细胞向褐色脂肪细胞分化的试剂。在分化为褐色脂肪细胞时，CD31-细胞针对给定水平的亲环蛋白A表达非常高水平的UCP1和PPARγ2mRNA。标准化至亲环蛋白A mRNA水平的UCP1和PPARγ2mRNA水平表明CD31-细胞向褐色脂肪细胞分化的水平，无论样品中细胞总数为多少。

[0125] 因此，通过多重TaqMan实时PCR对UCP1、PPARγ2和亲环蛋白A mRNA的定量用于定量CD31-细胞向褐色脂肪细胞的分化。

[0126] 使用该方法，鉴定或证实下述试剂促进BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞和/或诱导UCP1、FABP4(aP2)、PPARγ2、mtTFA、PGC-lα和/或COX IV在BAT祖细胞中体外或体内表达，或体内体外均表达：PPARγ配体例如罗格列酮、PDE3抑制剂(例如氰胍佐旦)、PDE4抑制剂(例如咯利普兰)、前列腺素F2(PGF2)衍生物例如9β,11α-前列腺素F2、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP,ADCYAP1,UniProt P18509)基因衍生的肽例如55aa(aa 25-79)的PACAP前肽、BDNF(脑源性神经营养因子)、TGR5激动剂例如齐墩果酸、BMP-7、类黄酮(KMP,CAS编号 520-18-3)、可溶鸟苷酸环化酶(sGC)的刺激物例如瑞斯固特(BAY 63-2521,CAS 625115-55-1)、FGF7(成纤维细胞生长因子-7、KGF、角化细胞生长因子)、FGF10(成纤维细胞生长因子-10、KGF-2、角化细胞生长因子-2)、BNP(b-型利钠肽)、TRPM8(CMRI)配体例如薄荷醇或依色林、铃蟾肽、CNTF(睫状神经营养因子)、白介素-6(IL-6)、食欲素B、SDF-1γ(CXCL12)、和FGF13(成纤维细胞生长因子-13)。

[0127] 除非另有说明，所有分析和分子生物级别的有机和无机化学品购自西格玛(Sigma)化学品公司(密歇根州圣路易斯)、生命技术公司(Life Technologies)(纽约州格兰德岛)、GenScript公司、Prospec公司、LifeTein公司、AnaSpec公司。罗格列酮购自卡曼化学公司(Cayman Chemical)(#71742)并且重组的人BMP7(rhBMP7)购自R&D系统公司(100μg/ml,6.3μM,#354-BP-010)。

[0128] 细胞培养

[0129] 细胞以10,000/cm2接种在0.2％明胶包被板上(48孔组织培养，Chemglass#CLS-3500-048)，在内皮细胞生长培养基-2(EGM2)(BulletKit生长培养基,Lonza#CC-3162)中37℃培养至传代(2-4天)并直至分化(另外10-16天)。EGM2培养基中2或3天后，用脂肪生成培养基替换培养基来诱导细胞分化，所述脂肪生成培养基根据Rodriguez等[21]所述进行改良，并且可含有或不含有分化诱导剂(例如PPARγ激动剂)。上述MDM包含：DMEM/Ham's F-12 
50/50混合物(3.151g/l,17.5mM D-葡萄糖,3.651g/l L-谷氨酰胺)(Cellgro#10-090-CV)、
5μg/ml(0.86μM)胰岛素、1μM地塞米松、100μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.2nM 3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸,10μg/ml(127nM)转铁蛋白和1％青霉素-链霉素。若罗格列酮用作分化诱导剂，其可以1μM或足以诱导BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞的任何其他浓度添加。

[0130] 对于细胞扩增研究，EGM2培养基中生长的融合细胞仅在37℃通过用胰蛋白酶-EDTA处理3-5分钟来脱离，然后1:3或 1:4分离并如上所述培养。

[0131] 通过定量逆转录、实时PCR对UCP1和PPARγ2mRNA进行定量

[0132] 用PureLink RNA分离试剂盒(英杰公司(Invitrogen)#12183-016)从细胞中制备总RNA。第一链cDNA用高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，加利福尼亚州福斯特城)和随机引物进行合成。

[0133] 使用以下进行定量实时PCR：应用生物系统公司StepOnePlusTM仪器、TaqMan基因表达主混物(应用生物系统公司#4369016)、和人解偶联蛋白-1"UCP1"(GenBank NM_021833)和人肽酰脯氨酰异构酶A“亲环蛋白A”(GenBank NM_021130)的定制TaqMan基因表达探针和引物。还开发定制TaqMan基因表达试剂用于以多重化形式(具有UCP1和亲环蛋白A)同时测量过氧化物酶体增殖物激活受体γ，转录本变体2(PPARγ2)(GenBank NM_015869)：UCP1FAM-MGB探针:TCA AGG GGT TGG TAC CTT CC(SEQ ID NO.:1),正义引物:CAC TAA CGA AGG ACC AAC GG(SEQ ID NO.:2),和反义引物:TTC CAG GAT CCA AGT CGC AA(SEQ ID NO.:3).亲环蛋白A NED-MGB探针:ACT GCC AAG ACT GAG TGG TT(SEQ ID NO.:4),正义引物:CAA ATG CTG GAC CCA ACA CA(SEQ ID NO.:5),和反义引物:TCA CTT TGC CAA ACA CCA CA(SEQ ID NO.:6).PPARg2VIC-MGB探针:TCA CAA GAA ATG ACC ATG GTT G(SEQ ID NO.:7),正义引物:AGC GAT TCC TTC ACT GAT ACA C(SEQ ID NO.:8),和反义引物:CCA GAA TGG CAT CTC TGT GT(SEQ ID NO.:9)。

[0134] 亲环蛋白A用作对照以解释由于逆转录效率引起的任何变化。通过将靶mRNA水平标准化至亲环蛋白A mRNA水平来确定任意单位(基于Cts)。

[0135] 统计学分析

[0136] 数据表示为平均值±SEM。显著性使用未配对斯氏t检验进行评估。显著性设置为p<0.05处。

[0137] 细胞形态学图片

[0138] 使用手持数码相机(尼康Coolpix 950)和用于细胞培养物观察的倒置显微镜(尼康TMS)拍摄细胞图片；图像使用Adobe Photoshop Elements 8功能使用自动对比度和自动水平进行优化。

[0139] 本文中使用的章节标题和子标题仅用于组织目的而非旨在以任何方式限制所述主题。此外，虽然本发明结合不同实施方式进行描述，但并非旨在将本发明限制在这些实施方式中。相反，本领域技术人员将理解，本发明涵盖各种替代、改良、和等同方案。

[0140] UCP1蛋白的定量

[0141] 褐色脂肪细胞祖细胞分化为褐色脂肪细胞可通过免疫组织化学(IHC)定量UCP1蛋白质来进行检测。

[0142] CD31-细胞的培养和向褐色脂肪细胞的分化使用缺少罗格列酮(最小分化培养基，MDM)或含有1μM罗格列酮(参考分化培养基，RDM)的脂肪生成分化培养基进行。15天分化后，细胞用4％多聚甲醛PBS pH 7.4固定，并用UCP1抗体(Abcam ab23841)和Alexafluor 488羊抗兔抗体孵育以根据标准方案定量相对UCP1水平(绿)。在固定细胞之前，细胞核用5μM DAPI(蓝色)标记10分钟。各处理条件在96孔板中重复评估三次，对应于总计各数据点约360-480孔。InCell 1000 Developer Toolbox软件用于开发自动化细胞检测脚本用于测量UCP1信号强度，使用细胞核和胞质检测算法。作为读数，使用细胞内UCP1信号的总强度，标准化至细胞数量。

[0143] 在一些实施方式中，使用该技术鉴定的试剂或其组合包括：法莫替丁、盐酸硫必利、盐酸胍法辛、利血平、米诺地尔、螺环哌啶酮、二氟苯水杨酸、昔可平、丙磺舒、二甲双胍、硫乙哌丙嗪、秋水仙素和非洛地平。

[0144] 检测褐色脂肪细胞分化

[0145] BODIPY荧光染料标记的中性脂质纳入胞质脂质液滴，这允许通过荧光细胞成像对细胞脂肪酸摄取和脂肪生成分化进行分析。细胞用 500/510C12(分子探针公司(Molecular Probes)#D-3823)孵育3-6小时，然后在微板基的高通量、高含量、亮场和荧光细胞成像仪和分析仪(Cyntellect 或GE保健IN细胞分析仪(GE Healthcare IN 
Cell Analyzer))上成像。

[0146] 其它实施方式

[0147] 本发明的各方面可以单独使用、联用或以前述实施方式未具体讨论的各种排列来使用，并且因此其应用并不限制于前面描述或附图说明所示组件的细节和排列。例如，一个实施方式的所述方面可与其它实施方式所述方面以任何方式组合。

[0148] 权利要求中修饰所提要素使用的顺序术语“第一”、“第二”、“第三”等本身并不暗指所提要素其一相对另一个的任何优先、居先或级别高低，或实行方法多个行动的时间顺序，而是仅仅用作标记把有某一名称的所提要素与有相同名称的另一要素(但是就顺序术语使用而言)区分开以区别所提的多个要素。

[0149] 而且，本文所用的词语和术语是为了描述目的，而不是限制性的。本文使用“包含”、“包括”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化意味着涵盖其后列出的项目及其等价物，以及额外的项目。

[0150] 本发明提供能体外和体内招募褐色脂肪细胞的新型组合物及其他。尽管讨论了本发明的具体实施方式，但以上说明书仅为说明性而非限制性的。本领域的技术人员在阅读本说明书后将清楚了解本发明的许多变化。本发明的全部范围应该通过参考所附权利要求书连同其等同物的全部范围，以及说明书连同此类变化来确定。

[0151] 通过引用纳入

[0152] 本文中应用的所有公开、专利和专利申请通过引用全文纳入本文用于所有目的，就如同各公开、专利或专利申请被具体地说明通过引用纳入本文一样。

[0153] 参考文献

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