用于测定样品中可溶性抗体的存在的基于蛋白L的生物测定方法及其试剂盒

摘要

本发明涉及一种生物测定方法，其中定性和/或定量测定包括人在内的动物的体液样品，优选地血浆或血清中特定可溶性抗体的存在。所述方法利用，用能量供体标记的第一组和用能量受体标记的第二组；第一组，或第二组，包含可溶性抗体的抗原并且第二组，或第一组，分别包含能够结合所述动物的抗体的Fab区域的Fab结合部分。供体和受体形成能够能量转移的能量转移对。本发明进一步包括用于所述生物测定方法的试剂盒。

权利要求

1.一种生物测定方法，其中定性和/或定量测定包含人在内的动物的体液的样品中所述动物的特定可溶性抗体的存在，所述方法利用a) 包含能量供体的第一组，和

b) 包含能量受体或猝灭剂的第二组，

其中

i) 所述第一组或所述第二组包含所述可溶性抗体的抗原，和ii) 所述第二组或所述第一组分别包含分别与所述能量供体，或所述能量受体包括猝灭剂偶联的抗原结合片段(Fab)结合部分(FBM)，所述部分能够结合所述动物的抗体的Fab区域，其中所述能量供体和所述能量受体或猝灭剂形成能够能量转移的能量转移对；和所述FBM选自蛋白L、重组蛋白L、Ch1结合蛋白及其功能结构域、片段和组合，优选重组蛋白L及其功能结构域、片段和组合。

2.权利要求1的生物测定方法，特征在于所述可溶性抗体为人可溶性抗体。

3.权利要求1的生物测定方法，特征在于所述可溶性抗体为除人之外的动物的可溶性抗体。

4.前述权利要求中任一项的生物测定方法，包括步骤：a) 使所述样品、所述第一组和所述第二组接触以获得反应混合物，b) 让所述反应混合物反应，

c) 用具有激发波长的辐射激发所述能量供体从而形成激发的标记抗原，d)

i) 检测从所述供体的能量转移导致的来自所述受体的发射辐射，借此增强的发射信号与所述样品中特定可溶性抗体的增加的水平相关，或ii) 当利用猝灭剂时，检测来自所述供体的发射辐射，借此下降的所述供体发射信号与所述样品中特定可溶性抗体的增加的水平相关。

5.权利要求4的生物测定方法，特征在于在步骤a)中所述样品与包含FBM的所述组接触，并让其反应；然后加入包含所述抗原的第一或第二组。

6.权利要求4或5的生物测定方法，特征在于步骤a)包括两个连续阶段：i) 其中所述样品与固定的捕获免疫球蛋白接触的第一阶段，借此所述样品的可溶性抗体被所述捕获免疫球蛋白捕获，和其后ii) 其中所述样品的所述捕获的可溶性抗体与所述第一组和所述第二组接触以获得所述反应混合物的第二阶段。

7.权利要求4-6中任一项的生物测定方法，特征在于步骤a)包括加入kosmotropic、离液序列高的、导致沉淀的和/或盐析的(outsalting)试剂，优选选自硫酸铵、聚乙二醇(PEG)、有机溶剂、盐、尿素、胍、酸和碱。

8.权利要求7的生物测定方法，特征在于所述发射的检测至少进行两次，i) 当所述反应混合物中包含变性和/或离液剂时一次，和ii) 当所述反应混合物中不包含所述变性和/或离液剂时一次，借此若存在，发射的差异与所述可溶性抗体的亲合力相关。

9.权利要求8的生物测定方法，特征在于所述变性和/或离液剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、硫氰酸盐、胍和二乙胺。

10.前述权利要求任一项的生物测定方法，特征在于所述体液选自血液、血浆、血清、脑脊液、唾液、尿、鼻咽分泌、支气管肺泡分泌、抽吸液、灌洗液、眼液、胸膜液、渗出液、腹水、精液、胆汁、渗漏液及其任何组合，优选血浆、血清和脑脊液。

11.前述权利要求任一项的生物测定方法，特征在于所述可溶性抗体选自人免疫球蛋白A、D、E、包括亚类1、2、3和4的G，以及M；和其它物种的相应免疫球蛋白；优选相应于人免疫球蛋白A、E、包括亚类1、2、3和4的G，以及M。

12.前述权利要求任一项的生物测定方法，特征在于所述可溶性抗体选自抗选自以下的抗原的抗体：微生物抗原，其包括细菌学、寄生虫、真菌和病毒抗原，外源性抗原，自身抗原，过敏原和肿瘤抗原。

13.前述权利要求任一项的生物测定方法，特征在于所述能量转移对能够荧光共振能量转移(FRET)。

14.权利要求13的生物测定方法，特征在于所述生物测定为时间-分辨FRET (TR-FRET)测定或双光子激发FRET测定。

15.权利要求1-11中任一项的生物测定方法，特征在于所述测定为发光氧通道效应(LOC)测定。

16.用于前述权利要求任一项的生物测定方法的试剂盒，特征在于所述试剂盒包含i) 含有能量供体标记的第一种试剂，和ii) 含有能量受体标记或猝灭剂标记的第二种试剂

其中

a) 所述第一种试剂或所述第二种试剂包含包括人在内的动物的可溶性抗体的抗原，和b) 所述第二种试剂或所述第一种试剂分别包含分别与所述能量供体或所述能量受体或猝灭剂偶联的Fab结合部分(FBM)，所述FBM能够结合所述动物的抗体的Fab区域，其中所述供体标记与所述受体标记或猝灭剂标记形成能够能量转移，优选地荧光共振能量转移(FRET)，最优选地时间分辨FRET (TR-FRET)、双光子激发FRET (TP-FRET)或发光氧通道效应(LOC)的能量转移对；和所述FBM选自蛋白L、重组蛋白L、Ch1结合蛋白及其功能结构域、片段和组合；优选重组蛋白L及其功能结构域、片段和组合。

17.权利要求16的试剂盒，特征在于所述可溶性抗体为人可溶性抗体。

18.权利要求16或17的试剂盒，特征在于所述可溶性抗体为除人之外的动物的可溶性抗体。

19.权利要求16-18中任一项的试剂盒，特征在于所述第一种试剂或第二种试剂的供体的量分别与所述第二种试剂或第一种试剂的受体包括猝灭剂的量的比率为i) 至少10 %，优选至少90 %，和

ii) 不超过1000 %，优选不超过120 %，和iii) 最优选约100 %，

其中与100%对应的比率通过等量供体与受体包括猝灭剂来获得。

说明书

用于测定样品中可溶性抗体的存在的基于蛋白L的生物测定

方法及其试剂盒

发明领域

[0001] 本发明涉及一种方法，其中定性和/或定量测定包括人在内的动物的体液样品，优选地血浆或血清中特定可溶性抗体的存在。本发明特别地涉及用于诊断目的的无分离血清学测定。

[0002] 发明背景本文中用以阐明发明背景的出版物和其它材料，特别地，提供关于实践的额外细节的案例，通过引用结合。

[0003] 本领域已知多种血清学方法的备选方案。Chappel等人对用于诊断HIV的免疫测定的综述[Chappel RJ, Wilson KM, Dax EM. Immunoassays for the diagnosis of HIV: meeting future needs by enhancing the quality of testing (用于诊断HIV的免疫测定：通过提高检验质量满足未来需求). Future Microbiology 2009, 4, 963-982]比较全面地说明了已知的技术。

[0004] 传统技术如酶联免疫吸附测定(ELISA)或酶免疫测定(EIA)需要广泛的洗涤步骤，但具有相当高的灵敏度和特异性。这些检验的缺点为其需要数个洗涤和孵育步骤，因此其实施需要相当大量的动手时间。另一方面，快速检验一般需要较少的时间并且可不分离。然而，这样的检验的缺点为可获得通常相当低的灵敏度和特异性。

[0005] Tian & Heyduk 2009 [Anal Chem.2009,81, 5218–5225]公开了一种利用抗体的二价性质的均相免疫传感器设计。根据Tian & Heudyk 2009该免疫传感器设计可应用于，例如自身免疫或传染性疾病的诊断中的，抗体检测。所公开的设计利用使用柔性接头与短互补性寡核苷酸缀合的抗体的抗原，每一寡核苷酸包含可形成Föster(或荧光)共振能量转移(FRET)供体-受体对的荧光染料。

[0006] Liu等人[Anal. Chem.  2008, 80, 7735–7741]提出了基于双光子激发FRET (TPE-FRET)的均相免疫测定。他们证明抗-BSA抗体可使用用供体和受体分开标记的牛血清白蛋白(BSA)测定。提出了体内或胞内分析应用。

[0007] 我们先前的工作[PLOS ONE 2013, 8(5), e62739]描述了基于测量通过特异性IgG分子桥接的供体标记的抗原和受体标记的抗原之间TR-FRET的测定。所公开的测定依赖于在两个不同的反应中用受体和供体荧光染料二者标记目的抗原。由于两个标记反应通常利用不同的活化方法进行，用其它荧光团标记抗原可导致“掩蔽”抗原表位因此阻止抗体识别抗原。

[0008] 本发明的目标和概述本发明的一个目标为提供用于测定包含体液的样品中特定可溶性抗体的存在的生物测定方法。

[0009] 本发明提供其中定性和/或定量测定包含包括人在内的动物的体液的样品中所述动物的特定可溶性抗体的存在的生物测定方法，所述方法利用a) 包含能量供体的第一组，和
b) 包含能量受体或猝灭剂的第二组，
其中
i) 所述第一组或所述第二组包含所述可溶性抗体的抗原，和
ii) 所述第二组或所述第一组分别包含分别与所述能量供体，或所述能量受体包括猝灭剂偶联的抗原结合片段(Fab)结合部分(FBM)，所述部分能够结合所述动物的抗体的Fab区域，
其中所述能量供体和所述能量受体或猝灭剂形成能够能量转移的能量转移对；和FBM选自蛋白L、重组蛋白L、Ch1结合蛋白及其功能结构域、片段和组合，优选重组蛋白L及其功能结构域、片段和组合。

[0010] 本发明的另一个目标为提供用于生物测定方法的试剂盒。

[0011] 本发明提供用于前述权利要求任一项的生物测定方法的试剂盒，特征在于所述试剂盒包含i) 含有能量供体标记的第一种试剂，和
ii) 含有能量受体标记或猝灭剂标记的第二种试剂
其中
a) 所述第一种试剂或所述第二种试剂包含所述包括人在内的动物的可溶性抗体的抗原，和
b) 所述第二种试剂或所述第一种试剂分别包含分别与所述能量供体，或所述能量受体或猝灭剂偶联的Fab结合部分(FBM)，所述FBM能够结合所述动物的抗体的Fab区域，其中所述供体标记与所述受体标记或猝灭剂标记形成能够能量转移，优选地荧光共振能量转移(FRET)，最优选时间分辨FRET (TR-FRET)、双光子激发FRET (TP-FRET)或发光氧通道效应(luminescent oxygen channelling) (LOC)的能量转移对；和
所述FBM选自蛋白L、重组蛋白L、Ch1结合蛋白及其功能结构域、片段和组合；优选重组蛋白L及其功能结构域、片段和组合。

[0012] 附图简述图1示意性说明免疫球蛋白G分子的结构。

[0013] 图2示意性说明本发明的测定原理。

[0014] 图3说明抗原与FBM的TR-FRET活性组合，如在IgG分子及其片段中例示的。

[0015] 图4使用SA作为抗原说明FRET-桥测定与基于蛋白L的测定之间的比较。X轴在每一点处示出蛋白L浓度/抗体浓度。

[0016] 图5使用GST作为抗原说明FRET-桥测定与基于蛋白L的测定之间的比较。X轴在每一点处示出蛋白L浓度/抗体浓度。

[0017] 图6说明以抗-GST可溶性抗体作为对照对Eu-标记的GST-VP1u和AF-标记的蛋白L滴定的抗-SA抗体(蛋白L和抗原二者均20 nM)。

[0018] 图7说明以抗-SA抗体作为对照对Eu-标记的SA和AF-标记的蛋白L滴定的抗-GST抗体(蛋白L和抗原二者均20 nM)。

[0019] 图8说明以抗-GST可溶性抗体作为对照对AF-标记的SA和Eu-标记的蛋白L滴定的抗-SA抗体(蛋白L和抗原二者均20 nM)。

[0020] 图9说明以抗-SA可溶性抗体作为对照对AF-标记的GST-VP1u和Eu-标记的蛋白L滴定的抗-GST可溶性抗体(蛋白L和抗原二者均20 nM)。

[0021] 图10说明对恒定的蛋白L (受体标记的)和抗原(供体标记的)浓度(每一20 nM)滴定的抗-SA Fab-片段(1/8-1/32稀释)和完整抗-SA (50-10 nM)。

[0022] 图11示意性说明当利用GullSORB通过离心去除IgGs时本发明的测定原理。

[0023] 图12说明211个血清样品的检验结果。

[0024] 图13说明当利用GullSORB通过离心去除IgGs时211个血清样品的检验结果。

[0025] 发明详述本发明利用用单一荧光团(供体或受体)标记的抗原与用单一荧光团(若抗原中为受体则为供体，若抗原中为供体则为受体)标记的Fab结合部分(FBM)联合。图1示意性说明IgG分子的结构，IgG的片段如http://www.biologyexams4u.com/2012/11/antigen-antibody-interaction.html中所描绘。FBM为能够结合Fab区域中的轻链、重链、轻链和重链二者、轻链与重链之间的界面或轻链和重链形成的表面的部分，例如蛋白L(κ轻链结合部分)。由于FBM中存在其它荧光团，对于每一抗原仅需单个标记反应，因此降低会有可能导致抑制各个可溶性抗体识别抗原(由于荧光团“掩蔽”表位)的标记与相关表位中的氨基酸的连接的可能性。靶向轻链的FBM (如我们的实施例中所使用的蛋白L)的使用使得能够在检测多种抗原时使用相同试剂。此外，如果使用靶向轻链的FBM，利用这些试剂的测定可应用于检测来自几乎所有类别(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)的免疫球蛋白(Igs)。

[0026] 图2示意性地说明了本发明的一个典型测定设置。当可溶性抗体在同一Fab-臂或两个Fab臂(或FBM在一个Fab-臂，抗原在另一个)结合两种反应组分(荧光团-标记的如蛋白L所例示的FBM，和荧光团标记的抗原)时，形成可测量的FRET-对。仅示出了抗原中供体标记(D)和蛋白L中受体标记(A)的设置。标记的顺序可颠倒。图3中示意性地例示了TR-FRET (和FRET)活性的抗原-抗体-蛋白L复合体。示出了IgG的组合，但也可能的是抗原和蛋白L与其它类别的免疫球蛋白分子(IgD、IgA、IgE和IgM)连续结合形成的复合体。游离轻链与抗原和蛋白L的复合体也会产生TR-FRET信号。

[0027] 免疫球蛋白包含与轻链(人具有κ和λ轻链)复合以形成免疫球蛋白分子的重链(人具有分别存在于IgG、IgD、IgA、IgM和IgE中的γ、δ、α、μ和ε重链)。如图1中通过人IgG分子所例示的，免疫球蛋白包含由Ig重链中的恒定结构域形成的Fc区域和两个(或更多个)Fab区域，每一Fab区域由重链和轻链(二者中均具有恒定和可变结构域)形成。由于抗体的二价或多价性质(两个或多个抗原结合位点，即可变区)，通过使用适当的试剂对建立用于循环抗体的均相，即无分离，快速测定是可能的，所述试剂对当通过与特定的可溶性抗体结合而引起试剂彼此接近时能够产生信号。在本发明中一对能够能量转移的荧光团(通过TR-FRET对：螯合的铕作为供体和AlexaFluor647作为受体例示)如下连接：一个荧光团(供体或受体)与FBM (通过κ轻链结合部分，蛋白L例示)连接，另一个荧光团(如果FBM中为供体则为受体，如果FBM中为受体则为供体)与抗原连接，以使得能够在均相测定中检测特定抗体。

[0028] 适于这样的目的的生物化学测定在此处称为接近测定。接近测定为其中特异性结合，例如可溶性抗体对抗原的识别，引起一组两个标记彼此接近以建立编制的信号（orchestrated signal）的测定。通常这样的测定为荧光或发光标记、能量供体与能量受体包括猝灭剂构成的各种各样的能量转移测定。传统上这样的测定基于具有适当的能量积分重叠以允许接近，1-10 nm距离内时能量转移的两种荧光染料(Förster T, Ann Physik 6:55, 1948)。

[0029] 能够原位监测试剂接近的其它技术为例如闪烁接近测定、生物分子荧光互补测定、酶片段互补测定或氧通道效应测定。氧通道效应测定代表不同的能量转移途径，其中供体标记在供体珠中并且由激发时能够产生氧自由基的酞菁构成的光敏剂组成(Ullman EF等人，Clin Chem 1996; 42: 1518-26)。当接近受体珠时(≤ 200 nm)受激的氧触发反应，例如以铕螯合物作为受体时在613 nm处产生发射。适于该应用的嵌有供体和受体的纳米珠-从PerkinElmer (AlphaScreen®珠，PerkinElmer, Walltham, MA, USA)可得。

[0030] Liu等人(2008)描述了使用两个荧光团，供体和受体之间的双光子激发(TPE) FRET (TPE-FRET)测量牛血清白蛋白的FRET测定。FRET具有产生的发射难以与受体的直接激发区分这一一般局限，因为荧光能量转移需要强光谱重叠，即受体的激发需要与供体发射重叠。由于合适的有机荧光染料的斯托克位移较窄，供体的激发不可避免地也激发受体。Liu等人(2008)尝试使用双光子激发(TPE)规避该问题，所述双光子激发是避免一些基质(例如血清样品的基质)相关背景例如散射的有效工具。然而，TPE不避免FRET的主要问题，因为与受体相比供体激发差异较小。

[0031] Tian & Heyduk (2009)描述了FRET与补体杂交测定组合，其用来测量循环抗体以诊断免疫性。在该测定中通过用短寡核苷酸序列标记一组两个用FRET供体或受体标记的抗原建立非常靠近的接近。在该测定中允许互补序列杂交，因此引起抗原极为接近从而建立格外强的FRET信号。优化序列以便游离抗原-寡核苷酸缀合物不能有效形成杂交体。Tian & Heudyk (2009)提供数据显示该原理起作用。然而事实上，该测定设计和标记为复杂的。

[0032] 本发明的发明人近来开发了一种基于TR-FRET的均相免疫测定，称为FRET-桥测定，其利用供体-和受体-标记的抗原(Saraheimo等人, PLOS ONE 2013, 8(5), e62739)。在该测定形式中供体-和受体-标记的抗原与IgG分子的同时结合可通过TR-FRET测量，因此使得能够检测对给定抗原特异的抗体。FRET-桥测定利用标记的链霉亲和素(SA)，一个四聚体蛋白作为抗原建立。然而，当使用单价抗原评估FRET-桥测定的表现时，他们观察到该测定的灵敏度降低。FRET-桥测定还需要用两个荧光团分开标记抗原，这相当具有挑战性。供体和受体的标记化学通常不同，这可导致抗原在不同的位点被标记。其可导致两批抗原丧失不同的表位，这可进一步导致阻止两种抗原与相同抗体结合。同样，FRET的效率取决于供体和受体荧光团之间的距离，因此对于FRET的空间需求也限制FRET-桥测定中使用的抗原的尺寸。

[0033] 随后本发明的发明人决定检验使用携带有一个荧光团(供体或受体)的FBM和携带有另一个荧光团(分别为受体或供体)的抗原的测定设置。理论上，如图3中所例示的，FBM和抗原与单个Fab (或对侧的)结合会产生FRET-对，其形成足够接近的荧光团用于通过TR-FRET检测结合。相同的FBM可用于检测多种的抗原，并且会因此减少建立用于不同抗原的测定所需的标记反应的数目。此外，基于标记的FBM (如通过蛋白L所例示的)的测定为高度通用的，因为其可用于与几乎无限范围的抗原组合检测不同的可溶性抗体亚类。出乎意料地，本发明人观察到与上文提及的FRET-桥测定相比用此新方法改善TR-FRET信号强度(信号强度大约7-10倍增加) (图4和图5)。这可反映每一可溶性抗体分子形成至少两种这样的复合体的能力，两个荧光团的极其接近和或蛋白L的交联功能(每分子掺入4个FBM)。

[0034] 本发明的发明人实现对于诊断目的对给定抗原特异的抗体的存在的血清学测定可简单地通过将待测定可溶性抗体的标记抗原与FBM组合使用而实施。这可通过用能量转移对的供体(或受体)标记抗原和用能量转移对的受体(或供体)标记FBM而进行。因此，包含待测定的可溶性抗体的样品之间的反应导致多数抗体会结合受体-标记的FBM并且这些抗体中的一些会以一个或两个抗原结合位点结合供体标记的抗原的表位，因此，使得能够在供体和受体之间能量转移。如果用具有供体激发波长的辐射激发反应混合物，标记的抗原受激接着发生能量从供体向受体转移，其后受体发射可测量的辐射。样品包含的所述特异性的抗体越多，检测到的受体的发射辐射的信号越高。如果测定设置涉及猝灭剂样品中抗体越多会导致信号越低，这与抗体浓度成比例。

[0035] 实例或原理验证测定利用荧光团标记的重组蛋白L和荧光团标记的抗原(一个荧光团充当受体，另一个作为供体)检测抗原-特异性免疫球蛋白(通过IgG例示)。蛋白L为最初衍生自大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)的细菌表面蛋白(Akerstrom和Bjorck 1989, J Biol Chem 264:19740–19746)，具有通过κ轻链结合Ig分子而不干扰抗原结合的能力(Akerstrom和Bjorck 1989, J Biol Chem 264:19740–19746)。蛋白L能够经由其轻链(假设κ链)结合所有的免疫球蛋白类别(IgG、IgM、IgA、IgE和IgD) (De Chateau等人 1993, Scand J Immunol 37:339–405)。因此，蛋白L结合比其它抗体结合蛋白例如蛋白A和G更广范围的Ig类别和亚类(Bjorck 1988, J Immunol 140(4):1194-1197; Nilson等人
1992, JBC 267:2234-2239)。这两种组分，抗原和蛋白L与可溶性抗体的相同Fab-臂的结合可在结合反应之后立即通过TR-FRET测量。该方法不需要洗涤步骤，这意味着，其为均相免疫测定。所述测定测量抗微生物免疫球蛋白(IgG和/或IgM)的存在或不存在并告知受试者对于所研究的微生物抗原的终生暴露记录和免疫状态(包括疫苗-诱导的)。除了微生物抗原，这样的检验还适合研究对自身抗原、过敏原等的反应。

[0036] 本发明人理解试剂，即用供体或受体标记的抗原和用能量转移对标记的FBM出乎意料地不需额外的功能特征并且所述系统可用于检测体液中响应给定抗原的特异性抗体，很可能体液中99%的抗体靶向其它不相关的抗原。只要所述标记不干扰待检测的可溶性抗体与标记抗原的表位或FBM结合的能力，本发明的生物测定理论上就有功能。本质上具有抗原结合位点的免疫球蛋白的Fab臂将能够结合抗原和FBM二者。

[0037] 本发明的想法原则上可利用任何基于能量转移对和/或接近的测定实施。然而，考虑提供简单测定的目标以及血清学样品通常包含复杂的样品基质，优选，例如通过样品基质组分，有效消除背景发射的备选方案。

[0038] 定义如会对本领域技术人员显而易见的，术语可溶性抗体和抗体在本申请的语境中指可溶性抗体。由于本发明具体地指向用于诊断目的的血清学测定，膜结合抗体，例如B细胞受体(BCR)不是目的性的因此不涉及。

[0039] 术语体液在本申请的语境中指包括人在内的动物身体中的或其排泄的任何液体。体液因此指例如血液、其组分血浆和血清、脑脊液、唾液、尿、鼻咽和支气管肺泡分泌、抽吸或灌洗液、眼液、胸膜液、渗出液和腹水、精液、胆汁和渗漏液(例如来自中耳或鼻旁窦)。体液特别地指血浆、血清和脑脊液。

[0040] 术语抗原在本专利的语境中指抗原、半抗原或包含相关表位位点的抗原片段。

[0041] 术语Fab结合部分(FBM)在本申请的语境中指能够结合Ig分子Fab区域中的轻链、重链、轻链和重链二者、轻链与重链之间的界面或轻链和重链形成的表面的分子，优选多肽，即蛋白质。FBM可结合免疫球蛋白的Fab区域中的恒定或可变结构域。FBM具体地选自蛋白L、重组蛋白L、Ch1结合蛋白及其功能结构域、片段和组合；优选地重组蛋白L及其功能结构域、片段和组合。“其功能结构域、片段和组合”指包含至少一个具有结合Ig分子Fab区域中的轻链、重链、轻链和重链二者、轻链与重链之间的界面或轻链和重链形成的表面的能力的蛋白L、重组蛋白L和Ch1结合蛋白的结构域和/或片段。

[0042] 术语标记(label和labelling)在本申请的语境中指可检测的标记分子，其可包括荧光化合物、合适的金属元素例如镧系元素或其螯合物、荧光或能量受体(accepting)，其也可为嵌有荧光或猝灭化合物的纳米珠，或光敏剂、荧光纳米点、嵌有螯合物的珠、作为受体的量子点、上转换晶体（upconverting crystal）或包含那些的纳米珠。在本申请的语境中，上述标记可直接共价或非共价地与所定义的抗原偶联，或其可通过间接手段连接，例如通过亲和素或链霉亲和素与生物素化组分的相互作用，使用抗体例如抗地高辛配基或抗荧光素，或抗物种抗-IgG抗体、外源凝集素、寡核苷酸或其它一般性使用的间接标记方法。

[0043] 术语能量转移应广义理解为其中当通过电磁辐射，通常光激发时供体能够通过非辐射、辐射或中间体手段向受体转运能量的信号产生，所述受体可最终猝灭供体信号或接受能量并产生不同的信号。供体为能够，例如通过激发辐射，吸收能量的化合物，并且与适当受体或猝灭剂极其接近时会向受体或猝灭剂捐献能量(通过适当机制例如荧光共振能量转移，FRET)。受体可为有色的、荧光的或非荧光的有机化合物。其还可为有机金属化合物或金属纳米珠、量子点、纳米点或包含适当能量接纳化合物的纳米珠。典型的但并非限制性的技术为各种类型的FRET、猝灭反应和氧通道效应反应。时间分辨FRET (TR-FRET)为利用供体与受体的激发态差异因此在检测中使用时间分辨(门控检测)的技术。能量转移的具体实例为使用镧系元素和其螯合物，或嵌有镧系元素的珠作为供体，使用包含镧系元素的上转换晶体作为受体，或包含镧系元素的珠作为LOC中的最终受体的TR-FRET。

[0044] 本发明的优选实施方案对于本发明的测定，抗原的标记取决于所选择的系统。对于FRET和TR-FRET类型的测定最有效的方式技术上为用各自的供体和受体组共价标记抗原或其片段和FBM。每抗原或片段和FBM的标记的总量取决于，例如其大小。较高数目的标记使得形成的复合体中至少一个标记对能够良好地接近，除非标记封闭表位位点并阻止反应。

[0045] 为了优化实际的测定，一个备选方案为使用间接标记程序，其利用分别用供体和受体标记的两个亲和素/链霉亲和素组和生物素化的抗原，或将生物素与另一个结合对(例如半抗原抗-半抗原)组合。

[0046] 本发明中使用FRET的优选方式为使用时间分辨以区分供体和受体发射与建立的能量转移活化的发射。通过使用时间分辨可改善信号特异性并且还避免所有的环境样品和试剂相关的背景问题(Hemmilä I, Applications of fluorescence in immunoassays(荧光在免疫测定中的应用), Willey & Sons Ltd, New York, 1991)。优选的标记对由荧光Eu螯合物(参见例如Hemmilä I和Mukkala V-M; Crit Rev Clin Lab Sci 2001; 38; 441-519, Mathis G和Bazin H, Lanthanide Luminescence (镧系元素发光), Springer, Heidelberg,  pp 47-88)连同合适的受体，例如别藻蓝蛋白、Cy-5、一些若丹明类、AlexaFluor 647或来自其它源的相似产品(HiLight, DyLight, Ulight等) (Hemmilä I和Laitinen V, Lanthanide Luminescence (镧系元素发光), Springer, Heidelberg, pp.361-280)组成。相似地优选的标记对由荧光铽(Tb)螯合物和受体组，例如若丹明、荧光素、Cy-3组成。由上文提及的螯合物组成的纳米珠也可用作供体。受体可包括量子点、纳米点、纳米珠、嵌有荧光或猝灭化合物的纳米珠、光敏剂、嵌有螯合物的珠、上转换晶体或包含前述任何的纳米珠。

[0047] 相似地在LOC测定原理中，优选的标记组包括包含酞菁的供体珠和包含适当化学发光反应和Eu二酮螯合物作为受体的受体珠，那些珠从PerkinElmer轻易可得。

[0048] 在本发明许多优选的生物测定方法中，可溶性抗体为人可溶性抗体。在本发明一些优选的生物测定方法中，可溶性抗体为除人之外的动物的可溶性抗体。

[0049] 本发明的一个典型生物测定方法包括步骤：a) 使样品、第一组和第二组接触以获得反应混合物，
b) 让反应混合物反应，
c) 用具有激发波长的辐射激发能量供体从而形成激发的标记抗原，
d)
i) 检测从供体的能量转移导致的来自受体的发射辐射，借此增强的发射信号与样品中特定的第一种可溶性抗体的增加的水平相关，或
ii) 当利用猝灭剂时，检测来自供体的发射辐射，借此下降的供体发射信号与样品中特定的第一种可溶性抗体的增加的水平相关。

[0050] 在本发明许多优选的生物测定方法中，在步骤a)中样品与包含FBM的组接触，并让其反应；然后加入包含抗原的第一或第二组。

[0051] 在本发明一些优选的生物测定方法中步骤a)包括两个连续阶段，i) 其中样品与固定的捕获免疫球蛋白接触的第一阶段，借此样品的可溶性抗体被所述捕获免疫球蛋白捕获，和其后
ii) 其中所述样品的所述捕获的可溶性抗体与第一组和第二组接触以获得反应混合物的第二阶段。

[0052] 在本发明一些优选的生物测定方法中步骤a)包括加入kosmotropic、离液序列高的、导致沉淀的和/或盐析的(outsalting)试剂，例如，但不限于，硫酸铵、聚乙二醇(PEG)、有机溶剂、盐、尿素、胍、酸和碱。

[0053] 在本发明一些优选的生物测定方法中发射的检测至少进行两次，i) 当反应混合物中包含变性或离液剂时一次，和
ii) 当反应混合物中不包含所述变性和/或离液剂时一次，
借此若存在，发射的差异与可溶性抗体的亲合力相关。在这样的生物测定方法中变性和/或离液剂优选选自十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、硫氰酸盐、胍和二乙胺。

[0054] 在本发明优选的生物测定方法中所述体液选自血液、血浆、血清、脑脊液、唾液、尿、鼻咽分泌、支气管肺泡分泌、抽吸液、灌洗液、眼液、胸膜液、渗出液、腹水、精液、胆汁、渗漏液及其任何组合，优选血浆、血清和脑脊液。

[0055] 在本发明优选的生物测定方法中所述可溶性抗体选自人免疫球蛋白A、D、E、G (包括亚类1、2、3和4)和M；以及其它物种的相应免疫球蛋白(例如认为IgY是IgG的鸟和爬虫类同等物)；优选相应于人免疫球蛋白A、E、G (包括亚类1、2、3和4)和M。

[0056] 在本发明优选的生物测定方法中所述可溶性抗体选自抗选自以下的抗原的抗体：微生物抗原包括细菌学、寄生虫、真菌和病毒抗原，外源性抗原，自身抗原，过敏原和肿瘤抗原。

[0057] 在本发明优选的生物测定方法中所述能量转移对能够荧光共振能量转移(FRET)。在这样的生物测定方法中所述生物测定优选为时间-分辨FRET (TR-FRET)测定或双光子激发FRET测定。

[0058] 在本发明一些优选的生物测定方法中，所述测定为发光氧通道效应(LOC)测定。

[0059] 在本发明许多优选的试剂盒中所述可溶性抗体为人可溶性抗体。在本发明一些优选的试剂盒中可溶性抗体为除人之外的动物的可溶性抗体。

[0060] 在本发明试剂盒的许多优选实施方案中第一种试剂或第二种试剂的供体的量分别与第二种试剂或第一种试剂的受体包括猝灭剂的量的比率为i) 至少10 %，优选至少90 %，和
ii) 不超过1000 %，优选不超过120 %，和
iii) 最优选约100 %，
其中与100%对应的比率通过等量供体与受体包括猝灭剂获得。
实施例

[0061] 实施例1原理验证，用于检测可溶性抗体的基于蛋白L的均相(溶液相)TR-FRET测定
方法
重组蛋白L购自Thermo Scientific (Pierce Protein Biology Products) 并用QuickAIIAssay Eu-螯合物蛋白标记试剂盒 (BN products & Services Oy)和Alexa Fluor® 647 (AF647)蛋白标记试剂盒(Invitrogen)分开标记。标记依照制造商的说明进行。AF647和Eu-螯合物-标记的链霉亲和素(分别为AF647-SA和Eu-SA)分别从Invitrogen和PerkinElmer订购。人细小病毒B19 (B19V)次要衣壳蛋白VP1的独特区域在大肠杆菌中作为GST-融合蛋白(本文表示为GST-VP1u)表达，纯化并用Eu (使用BN Products & Services Oy的QuickAIIAssay Eu-螯合物蛋白标记试剂盒)和AF647 (使用Invitrogen的蛋白标记试剂盒)依照制造商的说明单独标记。对于使用抗-GST抗体的实验GST-VP1u充当抗原。抗SA的单克隆抗体(MAb) (抗-SA) (克隆S3E11, 6.1 mg/ml)购自Thermo Scientific (Pierce Protein Biology Products)。单克隆抗-GST来自Abcam Ltd (1 mg/ml)，无IgG牛血清白蛋白(BSA)来自Jackson ImmunoResearch Inc。

[0062] TR-FRET值用Wallac Victor2 荧光计(PerkinElmer)通过在320 nm处激发接着延迟70 µs然后用615 nm (Eu)和665 nm (AF647)发射滤光片记录荧光计数100 µs而测量。考虑665 nm处的Eu发射，将测量的TR-FRET值按照下式归一化：AF647N = AF647–k*Eu，其中AF647N = 归一化的AF647荧光计数，AF647 = 未归一化的A647计数(在655 nm处的)，k = 665 nm处的Eu发射/615 nm处的Eu发射和Eu = Eu荧光计数(615 nm)。发现常数k不依赖于Eu-SA浓度，藉此在后续计算中使用值0.001342 (1:1000-1:8000的Eu-SA稀释度中的AF647-比Eu-计数的平均值)。

[0063] 对于所有的TR-FRET测定的基本方案如下：在补充有0.2% BSA的Tris缓冲盐水(TBS; 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl [pH 7.4]) (TBS-BSA)中稀释反应组分后，1:1混合蛋白L与MAb，在+37 °C孵育15 min并与标记的抗原1:1混合。将终反应体积(20 µl/孔)吸至384-孔微孔板(来自PerkinElmer的ProxiPlate-384 Plus F、Black 384-浅孔微孔板)上。

[0064] 结果为了评估蛋白L和抗原相对于抗体浓度的最佳量，我们针对恒定浓度的抗原(Eu-或AF-标记的SA和GST-VP1u，20 nM)和蛋白L (Eu-或AF-标记的，20 nM)滴定了抗体(抗-GST和抗-SA，50 nM-3.1 nM)。在用抗-SA MAb的实验中，抗-GST MAb充当对照，反之亦然。用AF-标记的蛋白L和Eu-标记的抗原，链霉亲和素(图4)和GST (图7)二者均抗体浓度剂量-依赖性地诱导TR-FRET信号。然而，当供体标记(Eu)在蛋白L中时，AF-SA (图8)诱导比AF-GST-VP1u (图7)显著更高的TR-FRET反应。在两种实验设置中在对照抗体存在(或不存)时检测接近测量背景的TR-FRET信号(AF-L和Eu-L，图6-9)。

[0065] 实施例2基于蛋白L的TR-FRET测定依赖于抗原和蛋白L与单个Fab片段的同时结合
方法
按先前方法(Saraheimo等人PLOS ONE 2013, 8(5), e62739)使用木瓜蛋白酶片段化抗-SA MAb (S3E11)，简言之，在100 nM L-半胱氨酸(在PBS，pH 7.4中)中1:10稀释木瓜蛋白酶25 mg/ml, 40 U/mg (P3125, Sigma-Aldrich)并通过RT孵育15 min预活化。在反应缓冲液(10 mM L-半胱氨酸和10 mM EDTA/PBS)中1:3稀释抗-SA MAb得到2 mg/ml的抗体溶液。在反应缓冲液中进一步1:100稀释预活化的木瓜蛋白酶。切割反应通过混合1份木瓜蛋白酶溶液与1份稀释的抗体而建立。切割在37℃进行4 h，其后通过添加0.3 M碘乙酰胺(在PBS中)以达到30 mM的终浓度而灭活木瓜蛋白酶。使用Gammabind™ Plus Sepharose™ (GE Healthcare)吸附以除去完整的IgG分子和大致彼此分离切割产物(Fab和Fc部分)。简言之，将Gammabind™珠平衡至PBS+(PBS加上额外的150 mM NaCl和0.01 % Tween 20)，与反应混合物混合并RT孵育15 min。离心(500×g, 2 min)沉积珠并回收上清液。用150 µl PBS+洗涤珠两次，所得上清液与初始上清液汇集在一起。将包含Fab片段和灭活的木瓜蛋白酶的上清液池浓缩并使用Amicon Ultra 10 kDa离心过滤单元(Millipore)依照产品说明将缓冲液交换为PBS。

[0066] 结果我们连续稀释了抗-SA Fab-片段和抗体并将其分开与标记的蛋白L和SA混合。如图10中所示，Fab片段产生TR-FRET信号的剂量依赖性增加，与MAb所诱导的信号类似。Fab片段诱导的信号强度大约为MAb所诱导的那些的一半，这反映与MAbs的浓度相比Fab片段的浓度较低。结果证实TR-FRET可源自单个Fab片段。

[0067] 实施例3与FRET-桥测定比较
方法
上文描述了用于基于蛋白L的应用的测定。相应MAbs (抗-SA和抗-GST)和AF-标记的蛋白L的浓度不同，而抗原(Eu-SA和Eu-GST-VP1u)的浓度保持恒定(10 nM)。抗体浓度在25 nM - 3.1 nM范围内，而蛋白L浓度始终比抗体浓度高两倍(50 nM - 6.3 nM)。对于FRET-桥测定，最终的反应混合物(20 µl)由分配在384-孔微孔板上的10 µl抗原混合物和10 µl抗体溶液组成。抗原和抗体在补充有0.2%牛血清白蛋白(BSA)的TBS中稀释。

[0068] 结果两种抗原，SA和GST-VP1u在蛋白L测定中均诱导更高的TR-FRET信号(分别图4和图5)。
事实上，GST-VP1u抗原在FRET-桥测定中不诱导任何信号(图5)，补充了我们先前的假设(Saraheimo等人PLOS ONE 2013, 8(5), e62739)：在FRET-桥测定中抗原的多价性(multimericity)是有益。我们先前也观察到多数TR-FRET活性衍生自大的免疫复合体，其形成实际上可能受到单价抗原（monomeric antigens）抑制。在蛋白L测定中，与GST-VP1u相比SA诱导两倍高的TR-FRET信号。因此，看起来有可能在蛋白L方法中抗原的多价性也是有益的，即使抗原多价性不是必须的。

[0069] 实施例4基于蛋白L的均相(溶液相) TR-FRET适用于血清学反应的检测，原理验证
方法
普马拉病毒(PUUV)是一种动物传染病的病原体，当传播给人时可诱导轻微出血热肾病综合征(HFRS)。该感染诱导强烈的抗PUUV核衣壳(N)蛋白的血清学反应(在诊断时IgM和IgG二者往往实几乎都存在)。重组PUUV N蛋白购自Reagena  ltd (Finland)并使用QuickAIIAssay Eu-螯合物蛋白标记试剂盒(BN products & Services Oy)按照制造商的说明进行Eu-标记。AF647标记的重组蛋白L如实施例1中所描述来制备。对于测定表现的评估，建立图2和图11中所示意性描绘的两种测定形式。图2中描绘的测定设计为检测抗给定抗原的IgM和IgG二者，实际上所有的抗原特异性Ig类别。图11中描绘的测定设计为检测除IgG之外的Ig类别，主要为IgM。进行图11中所描绘的测定之前将分析物(待研究的溶液，在本实施例中为血清)与GullSORB试剂(Meridian Bioscience Inc.)混合并通过离心去除IgGs。在TBS-BSA中稀释测定组分，AF647标记的蛋白L和Eu-标记的PUUV N蛋白，并分配到
384孔微孔板(来自PerkinElmer的ProxiPlate-384 Plus F; black 384-浅孔微孔板)上，加入5 µl血清稀释物。37℃ 30 min后，用Wallac Victor2荧光计(PerkinElmer)测量TR-FRET值，并如实施例1中所述将值归一化。所有的实验一式两份进行。优化后将25 nM蛋白L和5 nM与PUUV-N 1/100血清稀释物一起使用。将样品的TR-FRET信号与阴性对照血清池诱导的TR-FRET信号比较(归一化的TR-FRET值的平均值除以来自阴性对照，PUUV-阴性对照血清池的归一化TR-FRET值的平均值)，检验值作为整数报告。

[0070] 结果我们通过研究211个血清样品(表1)评估该检验：61个急性的，27个恢复期的/过去感染的和123个血清阴性。使用良好表征的血清组（serum panel），我们将蛋白L TR-FRET测定阈值设置在超过背景3倍的信号水平(大于等于用阴性血清池获得的TR-FRET信号的3倍的值被认为是阳性)。用图2中所描述的检验设置，61个急性阶段中的59个和27个过去感染样品中的14个鉴定为PUUV血清阳性(表1和图12)。123个PUUV血清阴性样品中的7个在蛋白L TR-FRET测定中产生假阳性结果(表1和图12)。当用GullSORB预处理血清样品时，61个急性阶段中的58个和过去及血清阴性样品中的0个在蛋白L TR-FRET测定中产生阳性结果(表1和图
13)。这些结果提供蛋白L TR-FRET测定在溶液中（assay in-solution）用于使用人血清作为样品材料的抗体检测的适用性的原理验证。

[0071] 表1 211个血清样品的检验结果实施例5
发光氧通道效应测定
通过例如获得用从PerkinElmer (www.perkinelmer.fi)可得的表面包覆有链霉亲和素的供体和受体珠以及用生物素标记的抗原，发光氧通道效应(LOC)测定形式可应用于本发明。可使用从PerkinElmer可得的Envision读板机测量当在613 nm处激发珠时产生的信号。

[0072] 其它优选的实施方案会理解的是，本发明的方法和试剂盒可以以多种实施方案的形式并入，仅其中的一些在本文中公开。对本领域技术专家会显而易见的是存在其它实施方案并且其不背离本发明的精神。因此，所描述的实施方案为说明性的并且不应解释为限制性的。