NMRE11(t)；并且在该方法中：t4是固定值，表示表征患者对治疗性电离辐射的放射敏感性 DNA断裂率达到其残基值时的时间；t3和t2固定和组织反应的预测方法 值，分别表示在取自抗放射性患者的对照组细胞

摘要

中，大约25％和50％DSB修复结束的时间；t1是固本发明涉及一种表征细胞样品对电离辐射 定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞的细胞反应的方法，所述细胞样品取自患者未经 中，识别的DSB数量达到最大值后的时间。辐照或只经轻微辐照的区域内的细胞，所述方法包括以下步骤：(i)扩增所述取样的细胞，所述扩增的细胞构成“细胞样品”；(ii)在所述细胞样品上，在观测时间t，通过标记物pH2AX、pATM和MRE11中的至少两个确定得到的核灶平均数(所述平均数分别称为NpH2AX(t)、NpATM(t)、NMRE11(t))，(所述观测时间t为时间t＝0分钟(称为t0，未经辐照状态)以及用吸收剂量D辐照后，选自t＝t1、t2、t3和t4中的至少一个观测时间；(iii)确定选自由以下各项构成的组中的至少一个参数：根据CTCAE分类的放疗后组织反应的严重等级，通过至少使用平均数NpH2AX(t)和NpH2AX(tx)，其中tx为t4(优选的)或者为t3；样品放射敏感性分类，通过至少使用平均数NpH2AX(t)、NpATM(t)和

权利要求

1.表征细胞样品对电离辐射的放射敏感性的方法，所述细胞样品得自患者未经辐照或只经轻微辐照区域内获得的细胞，在该方法中：扩增所述取样的细胞，所述扩增的细胞构成“细胞样品”；

(i)在所述细胞样品上，在观测时间t，通过标记物pH2AX、pATM和MRE11中的至少两个确定得到的核灶平均数(所述平均数分别称为NpH2AX(t)、NpATM(t)、NMRE11(t))，所述观测时间t为时间t＝0分钟(称为t0，未经辐照状态)以及用吸收剂量D辐照后，选自t＝t1、t2、t3和t4中的至少一个观测时间；

(ii)确定选自由以下各项构成的组中的至少一个参数：-根据CTCAE分类的放疗后组织反应的严重等级，通过至少使用平均数NpH2AX(t)和NpH2AX(tx)，其中tx为t4(优选的)或者为t3；

-样品放射敏感性分类，通过至少使用平均数NpH2AX(t)、NpATM(t)和NMRE11(t)；

并且在该方法中

——t4是固定值，表示DNA断裂率达到其残基值时的时间，并且t4有利地在t3的6倍至t3的8倍之间选择，但在该情况下必须至少为12小时，并优选在12小时至48小时之间，并且更优选为大约24小时；

——t3是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中，大约25％DSB修复结束的时间，并且，t3有利地在t2的3倍至t2的5倍之间选择，但在该情况下必须至少为2.5小时且至多为6小时，并优选在3小时至5小时之间，并且更优选为大约4小时；

——t2是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中，大约50％DSB修复结束的时间，并且，t2有利地在t1的5倍至t1的7倍之间选择，但在该情况下必须至少为35分钟且至多为90分钟，并优选在45分钟至75分钟之间，并且更优选为大约60分钟；

——t1是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中，识别的DSB数量达到最大值后的时间，并且，t1有利地在辐照结束后的5分钟至15分钟之间选择，并优选在7.5分钟至

12.5分钟之间，并且还更优选为10分钟左右。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述细胞样品上，确定100个细胞在时间t观察到的微核平均数[用％表示](该数被称为NMN(t))，时间t至少为t0(未经辐照)和用吸收剂量D辐照后的t4。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中确定了在t＝t0、t1、t2和t4时的平均数NpH2AX(t)，以及在t＝t0、t1和t2时的平均数NpATM(t)，以及在t＝t0、t1、t2和t3时的平均数NMRE11(t)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品细胞是取自患者皮肤活检的成纤维细胞。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中吸收剂量D在0.5Gy至4Gy之间，优选在

1Gy至3Gy之间，更优选在1.7Gy至2.3Gy之间，还更优选为2Gy。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中t1在8分钟至12分钟之间选取，t2在50分钟至70分钟之间选取、t3在3.5小时至4.5小时之间选取，并且t4在22小时至26小时之间选取。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中t1是10分钟、t2是60分钟、t3是4小时、t4是24小时，并且D是2Gy。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中确定了根据CTCAE分类的严重等级，并将其表示为无量纲的参数，其为CTCAE＝5-Max[NpATM(t1)；NpATM(t2)]/10。

9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中通过以下方式确定放射敏感性：(a)如果NpH2Ax(t4)＜2并且NpATM(t1)＞NpATM(t2)，并且NpATM(t1)＞30并且A＜10并且B＜5并且C＜2；条件是：C＝NpH2AX(t0)+NMN(t0)；

2

B＝t0时大细胞核(大于150μm )的百分比％；

A＝NMRE11(t0)+小pH2AX灶数/t0时细胞；

则认为样品是抗放射性的；

(b)如果(NpH2AX(t4)＞8或NMN(t4)＞24)，则认为样品是高放射敏感性的；

(c)在所有其他情况下，认为样品为中度放射敏感性的。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中NpH2AX、NpATM和/或NMRE11的确定涉及免疫荧光试验。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中选择取自抗放射性患者的所述对照细胞作为用以显示在利用2Gy吸收剂量辐照后，体外克隆存活率大于55％的细胞。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中选择取自抗放射性患者的所述对照细胞作为取自放疗治疗中或治疗后未显示有显著组织反应的患者的细胞。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中也按如下方式确定了放射敏感性类别的评分(类)：——如果NpH2AX(t4)＜2并且

如果NpATM(t1)＞NpATM(t2)并且

如果NpATM(t1)＞30并且

如果A＜10并且

如果B＜5并且

如果C＜2

其中C＝NpH2AX(t0)+NMN(t0)；

其中B＝t0时大细胞核(大于150μm2)的百分比％；

其中A＝NMRE11(t0)+t0时小pH2AX灶数/细胞；

那么则认为放射敏感性类别(类别标准)是“I类”(抗放射性细胞)；

——如果(NpH2AX(t4)＞8或NMN(t4)＞24)那么则认为类别标准是“III类”(高放射敏感性细胞)。

——认为所有其他情况的类别标准是“II类”(表现出中度放射敏感性的细胞)。

说明书

表征患者对治疗性电离辐射的放射敏感性和组织反应的预测

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医学放射生物学领域，具体涉及放射生物学实验室方法领域。本发明涉及一种用于预测细胞、组织和临床放射敏感性的新型方法，该方法基于若干细胞参数和酶参数的测定和相关性。

背景技术

[0002] 约1％至15％通过放疗治疗癌症的患者会表现出组织反应(如皮炎或直肠炎)，这可能会对提供成功的治疗有影响，以至可能导致医生在既定方案完成之前就决定停止放疗治疗。另外，所述组织反应是患者对电离辐射的超高敏感性的指标。此外，即使是在可见的组织标记物首次出现之前就中断放疗治疗，放疗治疗也可能会增加治疗后的发病率或者甚至增加患者的死亡率，不仅因为过早中断治疗使得不能完全根除想要治疗的癌症，而且辐射本身也会对健康组织造成继发性损害。

[0003] 众所周知，组织对电离辐射的敏感性问题与DNA损伤修复机制是分不开的。事实上，在细胞水平上，电离辐射可以通过产生自由基(尤其是通过过氧化)和DNA损伤相关的其他活性物质，使某些类型的化学键断裂。由内源性或外源性攻击(如由电离辐射和自由基)所导致的DNA损伤，可以导致不同类型的DNA功能损伤，特别是，能量积累的损伤：碱基损伤、单链断裂和双链断裂(DSB)。未修复的DSB与细胞死亡、毒性、以及更具体地说，放射敏感性相关。修复差的DSB与基因组不稳定性、致突变现象和癌症易感性有关。机体对每种类型的DNA损伤都有特定的修复系统。哺乳动物有两种主要的DSB修复方法：缝合修复(双链连接)和重组修复(插入同源或非同源的单链)。

[0004] 众所周知，在不同器官之间以及不同个体之间，组织对电离辐射的敏感性高度可变；1981年，由Fertil和Malaise提出了“内在放射敏感性”的概念。此外，针对放疗的疗效和副作用的各种研究已经表明，有些个体具有很高的抗放射性，而其他个体，相比之下，则表现出放射敏感性，可导致临床上公认的副作用，但并不会造成随后的致死作用。即使排除某些罕见的极端敏感的案例，遗传起源似乎证明，放射敏感性一般源于遗传易感性，因此认为其因人而异。因此为了能够确定特定患者在无风险的情况下可接受的最大累积剂量，期望存在一种预测试验方法。这一问题主要出现在高电离剂量的放疗中。然而，该问题也有可能在任何其他与放疗使用相同剂量的强电离剂量的暴露中出现。

[0005] 众所周知，一般称为ATM和ATR的激酶家族中的两种蛋白参与DSB的检测、修复和信号转导；它们的行动至少需要存在一种已知能标定BRCA1的蛋白，并需要存在多种ATM底物的有序磷酸化级联(见由N.Foray等发表在EMBO杂志22卷(11)，p.2860-2871(2003)的文章“A subset of ATM-and ATR-dependent phosphorylation events requires the BRCA 1protein”)。在细胞放射敏感性的解释性模型中使用ATM酶进行试验(参见Joubert等“, DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute 
radiation response；At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity？”，发表于lnt.J.Radiat.Biol.,vol.84(2),p.107-125(2008))，并且该试验鉴定了三种类型的放射敏感性：抗放射性细胞(被称为I类放射敏感性)、中度放射敏感细胞(被称为II类放射敏感性)和极度放射敏感细胞(被称为III类放射敏感性)。然而，在此基础上并未提出预测模型。特别是没有建立临床数据(组织严重等级0到5)与放射生物学数据之间的定量关系。同样，2008年1月25日N.Foray在“Rencontres Nucléaire&Santé”会议(XP55131242)上所做的报告“Les réparatoses:nouveaux concepts sur la prédiction de la radiosensibilité”中为了描述辐射诱导双链断裂的数量，讨论了不同标记物pH2AX和MRE11的作用以及它们随时间的变化。该报告未提及用于定量和列出临床水平观察到的放射敏感性水平的组织严重等级。

[0006] 许多文献描述了ATM用于检测和修复DNA损伤的条件。专利申请WO 2004/013634(KUDOS制药有限公司)描述了ATM依赖型DNA损伤信号转导通路中一个组分的识别，该组分与包括MRE11/Rad51/NBS1复合体在内的其他DNA损伤的响应因子相互作用。专利申请US 2007/0072210(Ouchi和Aglipay)提出了一种筛选促进对DNA损伤响应的潜在治疗试剂的方法，其中将一种已知为BAAT1的蛋白(其与乳腺癌易感基因BRCA1相关)与ATM蛋白及候选化合物混合；如果相对于不含候选化合物的对照混合物来说，ATM磷酸化增加，则认为后者是促进DNA修复的潜在活性成分。专利申请EP 2 466 310 A1(慕尼黑亥姆霍兹中心)描述了在组蛋白H2AX的磷酸化形式(称为γ-H2AX或g-H2AX)存在下的DNA双链断裂修复。专利申请WO 
00/47760和专利US 7,279,290(圣裘德儿童研究医院)描述了ATM的激酶功能基团在DNA修复中的作用。

[0007] 由此，这些文献描述了修复途径，但并未显示出任何与建立临床数据关联的相关性。

[0008] 专利EP 1 616 011 B1(国际遗传工程和生物技术中心)公开了一种诊断DNA修复中遗传缺陷的方法，该方法基于以下三个步骤：培养从待测样品中分离的细胞，用嵌合多肽孵育所述细胞，以及表征细胞响应。所述细胞响应是指以下生化标记物的表达率，所述生化标记物由p53、ATM、Chk1、Chk2、BRCA1、BRCA2、Nbs1、MRE11、Rad50、Rad51和组蛋白等类型的细胞内蛋白构成。然而，通过辐射诱导的表达无法预测所述蛋白的功能(某些症状中蛋白虽然已经突变，但其表达率正常)：这些程序不是功能试验。

[0009] 专利申请WO 01/90408、WO2004/059004和WO 2006/136686(法国核能源局)描述了观察电离辐射后DNA损伤的方法。第一篇文献公开了DNA损伤切口的活性，但不能定量DNA切除和再合成的酶活性，也不能定量DSB的修复。其他两篇文献描述了通过超螺旋环状双链DNA定量评估生物介质修复DNA的能力(根据第三篇文献：在多孔聚丙烯酰胺水凝胶膜中固化)。这些方法并未直接关注生理环境中的原位DSB，并且也没有验证其临床应用的相关性。

[0010] KR20030033519提出了由催化剂或超氧化物歧化酶的活性推导放射敏感性的方法，KR20030033518中使用了谷胱甘肽过氧化物酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶。这些方法没有检测与DNA损伤或修复直接相关的标记物。

[0011] 专利申请US 2011/312514(Dana Farber癌症研究所)提出用FANCD2灶(foci)作为检测标记物。专利申请US 2007/0264648(美国国家放射科学研究所)提出了DNA寡聚物在预测放疗过程中是否出现副作用的用途。然而，即使在FANCD2灶的含量正常的情况下，也可以观察到一些放射敏感性。

[0012] 专利申请US 2008/234946和US 2012/041908(南佛罗里达大学等)描述了预测癌细胞而不是健康细胞的放射敏感性的方法；此外，该方法基于基因组数据，而不是功能试验。

[0013] 专利申请WO 2014/154854(蒙彼利埃中心医院)描述了利用至少一种放射敏感性生物标记物来预测受试者的放射敏感性的方法。该方法不能检测与DNA损伤或修复直接相关的标记物；此外，该方法基于蛋白质组数据。再者，该专利申请未描述放射生物学数据与组织反应的严重程度之间的定量关系。

[0014] 专利申请WO 2013/187973(加州大学)描述了用于测定细胞和(或)受试者相对于对照群体的放射敏感性的系统和方法。具体来说，所述方法包括辐照生物样品，通过使用选自包括抗-pH2AX、抗-MRE11和抗-ATM的一系列标记物中的一种或多种，对来自血样中的红细胞、淋巴细胞或原代细胞内辐射诱导灶进行检测定量。在辐照后低于两个小时的不同观察时间对辐射诱导灶进行定量能够确定其修复动力学，从经验上来说这与受试者的放射敏感性相关。然而，由于淋巴细胞的细胞核很小，所以对淋巴细胞灶进行分析非常困难。再者，所述方法也因此不允许医师做出治疗患者的决定。

[0015] 专利US 8,269,163(纽约大学医学院)描述了大量可以用作为标记物的蛋白质，这些标记物用于对于意外暴露于电离辐射的人的严重程度进行简便、快速的鉴别，从而可以对患者进行区分，以便安排他们进行适当的紧急治疗。所述专利涉及生物剂量学(意外剂量测定)，使用已知剂量进行放射敏感性的检测。

[0016] 专利申请WO 2010/88650(得克萨斯大学)描述了用于对特定放疗治疗敏感或抵抗的癌细胞进行识别的方法和组合物；因此并不适用于所有的放疗治疗。

[0017] 专利申请WO 2010/136942(飞利浦)描述了利用生物标记物在放疗过程中对患者的放疗治疗进行监测的总体方法。该方法包括从成像过程分离的图像中获得至少一种描述符，其中所述描述符属于准备进行放疗的目的组织，或者属于所述目标区域附近的组织。该方法进一步包括选择至少一种疾病特异性的生物标记物，该标记物适用于对目的区域组织放疗的副作用进行检测或定量。该方法进一步包括获得针对所选疾病的特异性生物标记物的至少一个体外测量值。该方法进一步包括利用相关技术，处理所述生物标记物的至少一个体外测量值的至少一种描述符，得到能够指示目的组织区域中放射毒性的输出信号。然而，所述专利的学说只考虑到组织的依赖性毒性，而没考虑到个体差异性，并且主要基于图像分析。

[0018] 专利申请WO 2010/109357描述了一种安排适应性放疗方案的方法和装置，该适应性放疗方案是基于对正常组织并发症的概率以及根据每个患者的特异性标记物肿瘤对照的概率进行优化而得到的。与正常组织相关标记物的值包括体外试验值、蛋白质谱特征和患者的病史数据。体外试验值可能源于细胞、蛋白质组和基因，例如，但不限于，多种细胞计数、HB、CRP、PSA、TNF-α、铁蛋白、转铁蛋白、LDH、IL-6、铁调素、肌酸酐、葡萄糖、HbAlc以及调聚物长度。从患者病史中得到的标记物包括前期腹部手术、荷尔蒙药物或抗凝血剂、糖尿病、年龄及肿瘤生长相关的测量结果。也设想到了与放射毒性无关的生物标记物，如与多种形式的切除治疗或化疗试剂相关的生物标记物。然而，也未考虑个体放射敏感性。

[0019] 尽管存在众多现有技术，但是申请人要指出的是，上述模式都未描述能够评估放疗后组织反应风险的个体放射敏感性的定量方法，该方法可用于任何患者以及任何类型的导致DSB的电离辐射，并且该方法是预测方法。因此提供预测个体放射敏感性方法的问题仍然没有可操作的方案。本发明的目的在于提出一种预测组织和临床放射敏感性的新方法。

发明内容

[0020] 本发明人发现，当DNA双链断裂(DSB)所代表的辐射导致的损伤类型未被修复时，其放射敏感性是最可预测的，并且当其修复较差时，具有基因组不稳定性，根据本发明的方法也源自所述发现。本发明人发现，DSB大多数可由称为缝合的主要修复模式修复，和/或由称为MRE11-依赖性重组的次要错配修复模式修复。由ATM蛋白调控这两种修复模式之间的平衡。标记物pH2AX表明由缝合修复模式识别的DSB。标记物MRE11表明已经通过MRE11-依赖性错配修复模式修复的DSB位点。标记物pATM提供了通过使H2AX磷酸化并抑制MRE11-依赖性通路来激活缝合通路的信息。

[0021] 发明人还观察到，在氧化型应激后，特别是在导致DSB的电离辐射相关的应激之后，细胞质形式的ATM蛋白转入细胞核。

[0022] 为了观察外源性攻击对DNA的损伤，DNA的自然状态以及DNA的辐射诱导状态都必须要考虑。此外，辐照后，必须要考虑DNA修复，其动力学取决于损伤修复机制，并由此取决于辐射诱导损伤的类型。此外，众所周知，DNA修复的有效性和速度具有个体差异性，并且特定的遗传条件也会导致特殊的放射敏感性。

[0023] 根据本发明，通过基于以下方面的方法上述问题得以解决：1)扩增非转化的细胞，特别是来自皮肤活检的细胞；2)对静止期人类细胞有效的机理模型；3)对任何治疗程序都有效的DSB识别、修复和信号转导的功能试验。

[0024] 本发明的第一个主题是表征取自患者的细胞样品对电离辐射的细胞放射敏感性的方法，该方法开始于从所述患者的未经辐照或只经轻微辐照的区域内获取细胞，在该方法中：

[0025] (i)扩增所述取样的细胞，所述扩增的细胞构成“细胞样品”；

[0026] (ii)在所述细胞样品上，在观测时间t，通过标记物pH2AX、pATM和MRE11中的至少两个确定得到的核灶平均数(所述平均数分别称为NpH2AX(t)、NpATM(t)、NMRE11(t))，所述观测时间t为时间t＝0分钟(简称t0，未经辐照状态)以及用吸收剂量D辐照后，选自t＝t1、t2、t3和t4中的至少一个观测时间；

[0027] (iii)确定选自由以下各项构成的组中的至少一个参数：

[0028] -根据CTCAE分类的放疗后组织反应的严重等级，通过至少使用平均数NpH2AX(t)和NpH2AX(tx)，其中tx为t4(优选的)或者为t3；

[0029] -样品放射敏感性分类，通过至少使用平均数NpH2AX(t)、NpATM(t)和NMRE11(t)；

[0030] 并且在方法中

[0031] ——t4是固定值，表示DNA断裂率达到其残基值(residual value)时的时间，并且t4有利地在t3的6倍至t3的8倍之间选择，但在这种情况下必须至少为12小时，并优选在12小时至48小时之间，并且更优选为大约24小时；

[0032] ——t3是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中，大约25％DSB修复结束的时间，并且t3有利地在t2的3倍至t2的5倍之间选择，但在这种情况下必须至少为2.5小时且至多为6小时，并优选在3小时至5小时之间，并且更优选为大约4小时；

[0033] ——t2是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中，大约50％DSB修复结束的时间，并且t2有利地在t1的5倍至t1的7倍之间选择，但在这种情况下必须至少为35分钟且至多为90分钟，并优选在45分钟至75分钟之间，并且更优选为大约60分钟；

[0034] ——t1是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中，识别的DSB数量达到最大值后的时间，并且t1有利地在辐照结束后的5分钟至15分钟之间选择，并优选在7.5分钟至12.5分钟之间，并且更优选为10分钟左右。

[0035] 在一个实施方案中，t1在8分钟至12分钟之间选取，t2在50分钟至70分钟之间选取、t3在3.5小时至4.5小时之间选取，并且t4在22小时至26小时之间选取。

[0036] 在一个实施方案中，在所述细胞样品上，测定100个细胞在时间t观察到的微核的平均数[用％表示](该数被称为NMN(t))，时间t至少为t0(未经辐照)和用吸收剂量D辐照后的t4。

[0037] 所述电离辐射是治疗性质的。具体来说，吸收剂量D在0.5Gy至4Gy之间，优选在1Gy至3Gy之间，更优选在1.7Gy至2.3Gy之间，更进一步优选为2Gy。

[0038] 在一个优选的实施方案中，t1是10分钟、t2是60分钟、t3是4小时、t4是24小时,并且D是2Gy。

[0039] 对于本发明，表征患者对电离辐射的细胞反应的一个参数是根据CTCAE分类的严重等级，其表示无量纲的参数，并定义为

[0040] CTCAE＝5-Max[NpATM(t1)；NpATM(t2)]/10。

[0041] 使用根据本发明的这一公式，能够确定根据CTCAE分类的严重等级，得到十进制数字。根据本发明得到的CTCAE最终值是通过算术舍入计算得到的约数对应的整数值。根据本发明确定的并在本申请书中所表示的CTCAE对应于所述数字和所述整数。

[0042] 在实际使用中，该公式特别适用于确定属于II类放射敏感性类别的患者(中等放射敏感性)的严重等级。对于属于III类放射敏感性类别(放射敏感患者)的患者禁止进行放疗。

[0043] 在一个实施方案中，按以下方式确定放射敏感性类别：

[0044] (a)如果NpH2AX(t4)＜2并且NpATM(t1)＞NpATM(t2)，并且NpATM(t1)＞30并且A＜10并且B＜5并且C＜2，条件是：

[0045] C＝NpH2AX(t0)+NMN(t0)；

[0046] B＝t0时大细胞核(大于150μm2)的百分比％；

[0047] A＝NMRE11(t0)+t0时小pH2AX灶数/细胞；

[0048] 则认为样品是抗放射性的；

[0049] (b)如果(NpH2AX(t4)＞8或NMN(t4)＞24)，则认为样品是高放射敏感性的；

[0050] (c)在所有其他情况下，认为样品是中度放射敏感性的。

[0051] 对于一些患者，由于过度重组现象，DNA修复可能会被连续自发产生的DNA单链断裂(SSB)所干扰，通常在易患癌症的患者中观察到该过度重组现象。SSB的自发过度产生可能会有两种非矛盾性的效果：在自发状态下并通过pH2AX标记，可能出现通常观察到的小于pH2AX灶的核灶；其反映出存在大量的DSB(“小灶”现象)。相似地，SSB的过度产生会导致染色质解凝，增加细胞核的尺寸(尺寸通常大于150μm2，对应于“大核”现象)。这两个现象主要反映的是基因组不稳定性。

[0052] 优选的NpH2AX、NpATM和/或NMRE11的确定方法涉及免疫荧光试验。

[0053] 在一个有利的实施方案中，选择取自抗放射性患者的所述对照细胞作为用以显示在利用2Gy吸收剂量辐照后，体外克隆存活率大于55％的细胞。

[0054] 在另一个实施方案中，选择所述取自抗放射性患者的对照细胞作为取自放疗治疗中或治疗后未显示有显著组织反应的患者的细胞。

[0055] 根据本发明的方法使用至少一种健康组织样品，优选由成纤维细胞组成。成纤维细胞优选从患者的结膜组织取样。该取样可通过活检进行。因此，在一个有利的实施方案中，所述取样的细胞为由患者皮肤活检得到的成纤维细胞(根据通常称为“皮肤穿刺活检”的方法取样)。在合适的培养基中培养组织样品。

[0056] 在细胞取样(即，在优选的实施方案中，在成纤维细胞系中进行活检)之后进行的根据本发明方法的第一步骤包括表征DNA的自然状态(t0时的状态)，换言之未经辐照的状态。该步骤尤其可以包括调查细胞核的尺寸，是否存在微核、潜在自发性凋亡小体以及具有多种损伤的细胞：在荧光显微镜下观察细胞。使用染料DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐为CAS No.28718-90-3)确定100个细胞的微核率，这是基因组不稳定性的一个指标。还确定了凋亡小体的数目。也确定了异常大的细胞核的群体，其出现提示染色质解凝。

[0057] 所述电离辐射通过吸收剂量来定义(参数名称为D，并以戈瑞(Gray)表示)。根据本发明，吸收剂量D在0.5Gy至4Gy之间，优选在1Gy至3Gy之间，更优选在1.7Gy至2.3Gy之间，更进一步优选为2Gy。这些区域通常对应于个体放疗疗程，疗程的数目取决于肿瘤的位置、时间和发展状态。

[0058] 对根据本发明的方法来说至关重要的是，在一系列试验开始时限定所有时间值t1、t2、t3、t4(即，为了相对于观测的统计学显著性设置校准方法，至少对给定的患者，优选对多个患者，定义试验开始时间)，并且对所有参数的确定来说，所述时间的间隔都是相同的。

[0059] 在根据本发明的方法中，t1有利地在8分钟至12分钟之间，和/或t2优选在50分钟至70分钟之间，和/或t3有利地在3.5小时至4.5小时之间，和/或t4有利地在22小时至26小时之间；优选满足所有四个条件。

[0060] 在本方法的一个特别令人感兴趣并容易标准化的变体中，t1是10分钟、t2是60分钟、t3是4小时、t4是24小时，并且D是2Gy。

[0061] 取自抗放射性患者的对照细胞可以取自通过临床检查筛选为放疗治疗中或治疗后未显示出明显组织反应的患者。也可以选择在利用2Gy吸收剂量的辐照后显示出体外克隆存活率大于55％的细胞。

[0062] 以下，描述典型的实施方案。

[0063] 在观察时间t和以吸收剂量D辐照后的选自t＝t1、t2、t3和t4的至少一个观察时间，观察具有标记物pH2AX、pATM和/或MRE11的细胞(所述平均数分别称为NpH2AX(t)、NpATM(t)和NMRE11(t))。在一个实施方案中，确定具有标记物pH2AX的灶数和多损伤细胞的存在。标记了蛋白pATM和蛋白MRE11(细胞核或细胞质的)的位置。

[0064] 该第一步骤能够鉴定出自然状态中潜在的基因组不稳定性。

[0065] 根据本发明方法的第二步骤包括用所需吸收剂量D(例如2Gy)辐照并对电离辐射的细胞响应进行评价。

[0066] a)在第一个实施方案中，对通过缝合修复的辐射诱导DSB进行了研究，其中缝合修复是其修复的主要模式。在t4，以及在任选的t1、t2和可能的t3，确定每个细胞pH2AX灶的数目；在t3的确定结果能够将从t1至t4的动力学速率的定义进行整合。在一个有利的实施方案中，在持续时间t4之后还确定了微核率，以便推导出辐射诱导的微核率。这样就使得根据未修复的DSB数估计放射敏感性成为可能。

[0067] b)在第二个实施方案中，通过测量ATM依赖性激酶活性的功能性，对电离辐射的细胞响应进行了更深入的研究。众所周知，在抗放射性对照细胞中，磷酸化形式的ATM蛋白(pATM)在自然状态下是细胞质蛋白。申请人已经发现，在辐照状态下它们倾向于变为核蛋白。一旦他们进入细胞核内，pATM形式通过缝合激活修复机制并抑制MRE11-依赖性错配修复通路。

[0068] 举例来说，如果辐照后(例如用2Gy的吸收剂量辐照)pATM形式表现出细胞质的定位，那么可以断定pATM形式没有或者通常不能从细胞质进入细胞核内。这可能是由ATM的突变或者协助ATM在辐照后进入细胞核的任意其他ATM伴侣蛋白的突变所引起的：在上述任意情况下，这都表示有显著的放射敏感性。

[0069] 对pATM蛋白位置的测定是可选的，该测定至少在t1和t2进行，也可选择性地在t3和t4进行。

[0070] c)第三个实施方案可以结合前述的实施方案，其中扩展了通过MRE11-依赖通路，细胞对电离辐射的细胞响应的研究。缝合通路的能力可以通过pH2AX的免疫荧光进行定量，除了缝合这一主要修复通路以外，申请人已经鉴定出了另一条修复通路，该通路是缝合通路的备选通路，并在缝合通路不足时可以替代缝合通路：其是通过MRE11-依赖性重组进行的修复。该通路的能力可通过MRE11灶的免疫荧光动力学研究定量。这种测量方法至少在t1、t2和t3进行，也可任选地在t4进行。根据申请人的发现，在2Gy剂量高达4小时的辐照之后，在抗放射性对照细胞系中，MRE11是细胞质的，而MRE11灶的数目非常低(通常为7±2个MRE11灶)；该标记在辐照大约24小时后变为细胞质的。

[0071] 在最后步骤中，为了预测患者(特别是患者的CTCAE)的辐射诱导损伤和/或放射敏感性状态，通过计算分数对结果进行评价。

附图说明

[0072] 图1(a)、(b)和(c)分别示出了以根据CTCAE分类的严重等级为横坐标的，源自未经辐照细胞的微核灶(a)、标记物pH2AX(b)和标记物pATM(c)数目变化的函数。源自未经辐照细胞的微核灶、标记物pH2AX和标记物pATM不可预测放射敏感性。

[0073] 组织反应的严重程度有两种不同的标准：CTCAE分类和RTOC分类。

[0074] 称为CTCAE的分类(通用不良事件术语标准，法语称为"Critères d'évaluation de la morbiditéselon la classification du National Cancer Institute")，2006年由美国国家癌症研究所发布，是癌症治疗中的不良事件(特别是副作用)的描述性术语。

[0075] 不良事件是指任何负面的或未预期的体征、症状或疾病，暂时地与医学治疗或医疗程序有关联，但不一定与治疗或医疗程序有关联的事件。不良事件是用于医疗文件和科学分析过程中某一特定事件的独特表示形式。

[0076] 为了澄清不良事件的含义，CTCAE为每种不良事件提供了简明的定义。这种标准，对其他遗传毒性应激(例如由火灾引起的伤害)有效，在放疗中发现了其特定的用途。

[0077] 等级是指不良事件的严重程度。CTCAE报告了5种严重等级(1至5级)，并对每种不良事件的严重程度给出了唯一的临床描述，详见下表1。通过特定的组织反应来定义每个严重等级。

[0078]

[0079] 表1：2010年6月14日由美国国家癌症研究所发布的最新版CTCAE标准

[0080] 在这五个等级的基础上，补充了0级，对应于无组织效果的情况。

[0081] 由美国肿瘤放射治疗协会(RTOC)于1984年提出的称为RTOG的历史分类，涵盖几乎所有类型的放疗后毒性。

[0082] 然而，RTOG分类对某些类型的癌症不适用，而CTCAE分类适用于所有类型的癌症。

[0083] 图2(a)和图2(b)示出了以CTCAE(图2(a))或RTOG(图2(b))严重等级为横坐标，辐照后24小时微核数变化的函数。使用荧光标记物DAPI标记微核，然后通过荧光信号分析进行定量。在图2中用罗马数字表示放射敏感性类别(I、II、III)。

[0084] 辐照后24小时的微核数仅能够用于预测III类放射敏感性。

[0085] 图3(a)、(b)和(c)示出了以CTCAE(图3(b))或RTOG(图3(c))严重等级为横坐标，辐照后24小时pH2AX灶数变化的函数。图3(a)示出了通过使用标记物pH2AX获得的灶平均数随时间变化的动力学。

[0086] 以CTCAE或RTOG严重等级(组织反应的两种不同严重程度衡量标准)作为横坐标，辐照后24小时得到的pH2AX灶数的函数仅能够用于预测I、II或III类辐射敏感性，不能用于预测严重等级。

[0087] 图4(A)示出了患者样品集合中所有细胞系(皮肤成纤维细胞)在用2Gy的剂量辐照后10分钟后，使用标记物pH2AX得到的灶平均数，虚线表示DSB的正常发生率，为40DSB每Gy每细胞。

[0088] 图4(A)示出了在2Gy辐照后，来自II类放射敏感性患者的所有细胞可表征为：比预期的pH2AX灶(DNA双链断裂(DSB))更少。这可以由DSB识别不足的事实来解释。

[0089] 图4(B)示出了用2Gy的剂量辐照后不同时间(0分钟、10分钟和1小时)pATM在细胞质和细胞核中的表达。示出了未经辐照细胞和用2Gy的剂量辐照后10分钟的细胞相应的免疫荧光数据。

[0090] 图4(B)中出现的数据与pATM灶数相关，表明存在ATM的“质-核迁移”。

[0091] 图4(C)示出了细胞集合中所获得的标记物pATM灶平均数随时间变化的动力学。为方便起见，省略了在10分钟、1小时、4小时和24小时进行的测量的误差棒。在图4(A)和4(C)中，每个点表示三个独立重复的平均值，误差棒表示每个类别的标准偏差。

[0092] 图5示出了以CTCAE严重等级为横坐标的，2Gy剂量的辐照后10分钟(图5(A))和1小时(图5(B))的pATM灶数变化的函数。图5(C)示出了先前分别示出于图5(A)和5(B)中的，以CTCAE严重等级为横坐标的，2Gy辐照后10分钟和24小时得到的2个值之间pATM灶数函数的最大值。

[0093] 图5(B)示出了0级，即无组织效果的情况。

[0094] 图5(C)示出了100例患者中，所述放射生物学参数与CTCAE分类严重等级之间的关系。因此，图5(C)代表了相关性的临床验证，该相关性存在于CTCAE严重等级与2Gy辐照后10分钟和1小时得到的2个值之间pATM灶数的最大值之间。

[0095] 在图5中放射敏感性类别(I、II、IIIa和IIIb)用罗马数字表示。图5(A)、5(B)和5(C)中，每个点代表每个类别的三个独立的重复的平均值。

[0096] 使用(2Gy+10分钟)或(2Gy+1小时)之间的pATM灶的最大值可以预测所有的类别，以及反应的严重等级。

[0097] 图6(A)示出了以先前分别示出于图3(B)和5(C)中的pH2AX灶数作为横坐标的，使用标记物pH2AX得到的灶数函数的最大值。

[0098] 图6(B)示出了与图6(A)相同的数据，并证明了代表不同人放射敏感性类别(I类、II类和III类)的明确的置信区。通过对双链断裂的识别和修复确定放射敏感性。

[0099] 图6(C)示出了每种类别类型的类别发生率。由于给定类别的出现概率与其相应的置信区成反比，因而每个类别的归一化频率由图6(C)中的柱状图表示。虚线对应于与数据最拟合的高斯线(r＝0.9)。

具体实施方式

[0100] 本发明的说明

[0101] 一般定义

[0102] 术语“辐射诱导损伤”、“辐射诱导的”、“放射敏感性”、“抗放射性”、“放射毒性”和“放疗”都是指电离辐射，特别是粒子型辐射，例如，由阿尔法(α)或贝塔(β)粒子组成的辐射或高能电磁辐射，尤其是，伽玛(γ)或X射线辐射。

[0103] 术语ATM的质-核迁移是描述尤其是在辐照之后，ATM蛋白通过细胞质向细胞核内移动的运动。

[0104] 发明详述

[0105] 以下将对具有多种变体的实施方案进行说明，该实施方案适合于人类患者。

[0106] 试验准备

[0107] 在对任意细胞取样之前，以及在对取样的细胞进行任意操作之前，(通常由医师)告知各操作员(例如属于某个细胞学分析实验室的)患者的艾滋病毒或丙型肝炎的潜在感染状态，以便操作员在取样、处理和管理培养细胞的过程中能够适当增加生物安全防护措施。

[0108] 然后，操作员从患者处取得细胞样品。优选地，操作员通过活检取得皮肤样品；所述样品有利地通过根据已知的称为“皮肤穿刺活检”的方法取得。将细胞样品置于含20％胎牛血清的灭菌DMEM培养基中。将样品立即转移到特殊的实验室，因为样品不能在室温中超过38个小时。

[0109] 在收到样品后，根据培养实验室公知的辅助程序，例如Elkin等人在Gordon和Breach(1967)的出版物“哺乳动物细胞培养物的放射生物学”中强调的辅助程序，以无病毒或化学转化剂的扩增细胞系形式制备细胞样品(通常为活检组织)。一旦细胞量足够(1-3周)，使用根据本发明的方法进行第一个实验。将细胞接种于培养皿中的载玻片上。将一定数量的所述载玻片置于通过剂量学认证的吸收剂量D(例如2Gy)的医疗辐照器中。另一部分不照射，并呈现自然的状态(吸收剂量0Gy)。

[0110] 可以通过(例如)使用在吸收剂量率为3Gy min-1的条件下发送6MV光子的医用加速器进行辐照。辐照后并且经过下面提到的修复时间，细胞仍在37℃培养箱中。

[0111] 对于辐照的细胞，在几个修复时间(辐射后修复时间)之后，得到对应于辐射诱导状态的特征。优选为至少需要两个时间点，并且进一步优选为至少需要三个时间点，即：t1、t2、t3和t4。所述特征由对应于标记物pH2AX的灶所表示。

[0112] 然后对载玻片上的细胞进行固定、裂解和杂交。可以使用以下已知的程序(参见引用自Bodgi等的出版物)：使用3％多聚甲醛和2％蔗糖在室温下使细胞固定15分钟，并用20mM pH值为7.4的HEPES缓冲液(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、50mM NaCl、3mM MgCl2,
300mM蔗糖、0.5％Triton X-100(式t-Oct C6H4-(OCH2CH2)xOH的非离子表面活性剂，其中x＝
9-10，CAS号为9002-93-1，由Sigma Aldrich供应)渗透3分钟。然后在磷酸盐缓冲液(已知首字母缩写为PBS)中洗涤有免疫染色的盖玻片。在37℃下含有2％牛血清白蛋白(已知首字母缩写为BSA或已知为组分V，由Sigma Aldrich供应)的PBS中孵育40分钟，随后用PBS洗涤。
抗-pH2AX的初级抗体以1:800稀释浓度使用，其他初级抗体以1:100的浓度使用。在2％BSA中，在37℃下用抗鼠次级抗体FITC或抗兔次级抗体TRITC(1:100，由Sigma Aldrich供应)进行孵育20分钟。用含DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)的VectashieldTM处理载玻片以标记细胞核。DAPI染色也可间接用于确定G1期细胞(DAPI染色均匀的细胞)、S期细胞(具有许多pH2AX灶的细胞)、G2期细胞(DAPI染色不均匀的细胞)和中期细胞(染色体可见)的数目。

[0113] 在免疫荧光显微镜(例如奥林巴斯模式)下观察所述盖玻片，得到结果。可以直接读数(通常通过每个时间点计数至少50个G0/G1细胞的灶数)或通过专用的图像分析软件读数，或甚至在自动显微镜上读数；优选对软件或自动显微镜方法进行手动校准。

[0114] 为了获得具有足够统计可靠性的结果作为诊断基础，至少进行3次独立的系列实验(辐照)，并且计算确定的时间点每个灶数的平均值。

[0115] 生物学和临床参数的确定

[0116] 所用的一般信息和标记物

[0117] 除其他外，本发明基于数据的应用，该数据获得自未经辐照细胞(自然状态)和辐照细胞(辐射诱导状态)下的三种标记物pH2AX、pATM和MRE11中的至少两种。该方法基于通过以所述标记物作为修复持续时间的函数进行的标记的动力学研究：从辐照结束开始的确定时间段后，对样品进行标记，并研究了其免疫荧光。可以测量完整的动力学曲线，例如有利地位于t0、t1(优选10分钟)、t2(优选1小时)、t3(优选4小时)和t4(优选24小时)的5个点，已知t0对应于辐照前的状态(自然状态)。

[0118] 然而，申请人发现某些点(对应于某些修复时间点)比其他点更重要，并且某些点是不可预测的。通过对给定时间所测定的参数进行审慎地选择也可以减少测量的次数，并由此降低了诊断的总体成本，而不降低本方法的预测能力。这种简化的方法构成了根据本发明的预测方法的基础。

[0119] 计算每个标记物在每个点和每个剂量下的平均值和平均值的标准误差(SEM)，已知取样n＝3(没有标准误差类型SE的高斯标准偏差)。

[0120] (i)pH2AX指的是组蛋白H2AX变体X的丝氨酸439中的磷酸化形式，根据申请人的发现，其标记了通过可靠的主要修复模式(即缝合)来识别的DNA双链断裂(DSB)的数量。标记物pH2AX主要是细胞核的，唯一的形式是细胞核灶，并且只对灶的数量和尺寸进行了分析。

[0121] (ii)pATM指的是激酶蛋白ATM的丝氨酸1981中的磷酸化的形式。根据申请人的发现，在正常条件(抗放射性状态)下辐照后，ATM从细胞质向细胞核迁移。pATM的形式主要集中在细胞质中，其标记出DSB位点。通过定位可区分标记物pATM，其可能是均匀地存在于细胞质中(无细胞质灶)而没有核灶的形式，唯一的存在于核中的只有核灶形式(无均匀的细胞核定位)，或者为细胞质和细胞核灶。

[0122] (iii)MRE11是核酸内切酶，使DNA断裂。根据申请人的发现，当修复过程完成时，MRE11标记了修复较差的DSB。标记物MRE11可以是无灶的细胞质形式，或无灶的细胞质和细胞核形式，或有灶的细胞质和细胞核形式。

[0123] 为了定位在细胞质内或细胞核内的位置(MRE11和pATM在电离辐射的影响下会改变该修复)，为了定量微核、凋亡小体以及细胞核尺寸这些灶数据的额外的细胞标记物，可以使用DAPI(本领域技术人员熟知的DNA标记物)染色计数来定位细胞核。

[0124] 生物学参数

[0125] 按照如下定义并确定：

[0126] -NpH2AX(t)、NpATM(t)、NMRE11(t)是在观察时间点t0(未经辐照)或辐照后的时间点t1、t2、t3、t4(吸收剂量：2Gy)，通过使用标记物pH2AX、pATM和MRE11获得的核灶平均数，已知在根据本发明的方法中必须确定参数NpH2AX(t)，而其他参数NpATM(t)和NMRE11(t)的确定是任选的，但优选确定这些其他参数；

[0127] -NMN(t)是100个细胞中，在自然状态下(t＝t0，即未经辐照)或在2Gy吸收剂量的辐照之后的时间点t＝t4时，观察到的微核数(用％表示)。

[0128] 预测评估

[0129] 旨在从测得的生物数据中预测临床或放疗参数。提出了两个诊断水平：

[0130] a)直接源自评分的数学值或与评分相关数学公式的定量诊断；考虑以下两个标准进行评分：

[0131] (i)分类为I、II或III类的患者(标准称为类)：

[0132] 放射敏感性类别(类)的定义有助于医生通过根据本发明的评分以及患者的临床观察表来确定其与已知的遗传综合征的相似性。在上文引用的Joubert等人的出版物中定义了这些分类。

[0133] ·根据本发明，据认为：

[0134] 如果NpH2AX(t4)＜2并且

[0135] 如果NpATM(t1)＞NpATM(t2)并且

[0136] 如果NpATM(t1)＞30并且

[0137] 如果A＜10并且

[0138] 如果B＜5并且

[0139] 如果C＜2

[0140] 条件是：

[0141] C＝NpH2AX(t0)+NMN(t0)；

[0142] B＝t0时大细胞核(大于150μm2)的百分比％；

[0143] A＝NMRE11(t0)+小pH2AX灶数/t0时细胞；那么认为放射敏感性类别(类别标准)是“I类”：所述细胞是抗放射性的。

[0144] ——如果(NpH2AX(t4)＞8或NMN(t4)＞24)

[0145] 那么认为放射敏感性类别(类别标准)是“III类”：所述细胞是高放射敏感性的。

[0146] ——认为所有其他情况的类别标准是“II类”：所述细胞表现出中度放射敏感性。

[0147] (ii)根据急性CTCAE分类(标准名为CTCAE)来预期的组织反应的严重等级。

[0148] 称为CTCAE的分类(通用不良事件术语标准，法语称为“Critères d'évaluation de la morbidité selon la classification du National Cancer Institute”)，2006年由美国国家癌症研究所发布，是癌症治疗中的不良事件(特别是副作用)的描述性术语。

[0149] 根据本发明，这种等级根据以下公式测定：

[0150] CTCAE＝5-[最大值(NpATM(t1)；NpATM(t2)]/10

[0151] b)更定性的诊断，其受定量诊断的影响，但会请医生考虑可能的临床因素。

[0152] 分析方法和水平

[0153] 在第一个实施方案中，所有实验测得的参数都在数学上有联系(从某个方面)。在评分之间有冲突的事件中，需要重复或增加某些实验或测定过程。某些参数的水平只足够建立一种评分和一个诊断。

[0154] 第二个实施方案考虑到观察到了某些点不能用于任何评分的预测：例如在点NpH2AX(t3)、NpATM(t3和t4)的情况。这就是可以设想限制性分析的原因，其中只有点t0、t1、t2和t4用于pH2AX，点t0、t1和t2用于pATM，以及点t0、t1、t2和t3用于MRE11。

[0155] 用于确定根据CTCAE分类的严重等级的该预测方法已经应用于健康组织中，所述健康组织中主要是成纤维细胞类型的结缔组织。该方法可以应用于任意类型的癌症。获得pATM与CTCAE之间的相关性，能够根据CTCAE分类以及本申请书中所描述的严重等级确定患者的严重等级(参看图5(C))，所述相关性已在罹患乳腺癌、纵隔癌、所有类型的耳鼻喉癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和直肠癌的患者中得到了验证。

[0156] 根据本发明的用于确定来自患者的样品的辐射敏感性的方法已应用于肿瘤细胞类型的组织以及来自于罹患以下疾病的患者的细胞中：乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌以及所有类型的耳鼻喉癌症、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、骨肉瘤和黑素瘤。

[0157] 通过以下实施例对本发明作出解释，但本发明不以任何方式受实施例的限制。这些实施例聚焦于分析取自患者的细胞系，该分析使得对患者所属的严重等级和放射敏感性类别的确定成为可能。

[0158] 实施例：

[0159] 试验准备

[0160] 通过使用本领域技术人员已知的“皮肤穿刺活检”法从患者处取得皮肤细胞样品。然后将细胞样品置于含+20％胎牛血清的无菌DMEM培养基中。然后，将细胞样品立即转移到特殊的实验室，以保证样品在室温中不超过38个小时。

[0161] 在收到样品后，根据培养实验室和本领域技术人员熟知的程序，以扩增的细胞系形式，由活检组织制备细胞样品：尤其是通过使用胰蛋白酶分散，将细胞再次在新换的培养基中稀释，直到获得所需的细胞数。在获得足量的细胞量后(一般是3周后)，使用根据本发明的方法进行第一个实验。将细胞接种于培养皿中的载玻片上。将一定数量的所述载玻片置于通过剂量学认证的吸收剂量D为2Gy的医疗辐照器中。另一部分不照射，所述数目呈现自然的状态(吸收剂量0Gy)。

[0162] 确定自然状态(t0)下和2Gy吸收剂量的辐照后修复10分钟(t1)、1小时(t2)、4小时(t3)和24小时(t4)后pH2AX、pATM和MRE11的灶数，观察确定100个细胞在自然状态(t0)下和2Gy吸收剂量的辐照后修复24小时后的微核数NMN(t)(用％表示)，确定自然状态下每个细胞中的小pH2AX灶数，以及确定t0时大核(大于150μm2)的百分比。

[0163] 对于受到辐照的细胞，使用在吸收剂量率为3Gy min-1的条件下发送6MV光子的医用加速器进行辐照。

[0164] 在2Gy吸收剂量的辐照之后，将细胞置于37℃的培养箱中。对于辐照后的细胞(辐射诱导状态)，样品在一段特定时间(辐照后修复时间)之后被标记，即：辐照结束时开始算10分钟(t1)、1小时(t2)、4小时(t3)和24小时(t4)，并且所得到的核灶平均数是在所述辐照后修复时间10分钟(t1)、1小时(t2)、4小时(t3)和24小时(t4)通过标记物pH2AX、MRE11和pATM得到的。在2Gy吸收剂量的辐照之后的24小时修复时间后，所观测的100个细胞中的微核NMN(t)数(用％表示)也是通过对所述样品进行免疫荧光分析来确定的。

[0165] 对于未经辐照细胞(自然状态，即在t0时)，通过对所述细胞进行免疫荧光分析，得到了在自然状态下的pH2AX灶平均数、自然状态下每个细胞中小pH2AX灶数、t0时大核(大于150μm2)的百分比以及观测到的自发微核数。

[0166] 然后在载玻片上将未经辐照细胞和接受了辐照的细胞进行固定、裂解和杂交。使用3％多聚甲醛和2％蔗糖在室温下使细胞固定15分钟，并用20mM pH值为7.4的HEPES缓冲液(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、50mM NaCl、3mM MgCl2,300mM蔗糖、0.5％Triton X-100(式t-Oct C6H4-(OCH2CH2)xOH的非离子表面活性剂，其中x＝9-10，CAS号为9002-93-1，由Sigma Aldrich供应)渗透3分钟。然后在磷酸盐缓冲液(已知首字母缩写为PBS)中洗涤有免疫染色的盖玻片。在37℃下含有2％牛血清白蛋白(已知首字母缩写为BSA或已知为组分V，由Sigma Aldrich供应)的PBS中孵育40分钟，随后用PBS洗涤。抗-pH2AX初级抗体以1:800稀释浓度使用，其他初级抗体以1:100的浓度使用。在2％BSA中，在37℃下用抗鼠次级抗体FITC或抗兔次级抗体TRITC(1:100，由Sigma Aldrich供应)进行孵育20分钟。

[0167] 然后用含DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)的VectashieldTM处理载玻片以标记细胞核。DAPI染色也间接地确保能够确定静止期G0/G1细胞(DAPI染色均匀的细胞)、合成期S细胞(具有许多pH2AX灶的细胞)、静止期G2细胞(DAPI染色不均匀的细胞)和有丝分裂期M细胞(染色体可见)的数目。特别地，DAPI染色计数能够用于定位细胞核，从而定位其在细胞质内或细胞核内的位置，因此能够对存在的微核进行定量。

[0168] 在免疫荧光显微镜(奥林巴斯模式)下观察所述盖玻片，得到结果。可以通过每个时间点计数至少50个G0/G1细胞中观测到的不同标记物pH2AX、pATM和MRE11的灶数并通过专用的图像分析软件(imageJ)读数。

[0169] 为了获得具有足够统计可靠性的结果作为诊断基础，进行了3次独立系列的辐照。计算了多个患者皮肤细胞样品在自然状态(t0)下、辐照后修复时间10分钟(t1)、1小时(t2)、4小时(t3)和24小时(t4)后每个灶数的平均值和平均值的标准误差(SEM)，并列于下表中(参见表2)。

[0170]

[0171] 样品的严重等级和放射敏感性的预测评估

[0172] 自上世纪70年代至今，文献中已经描述了辐照后死亡的案例(根据CTCAE分类的严重等级5)，并系统地对应到共济失调毛细血管扩张症或患者连接酶4突变的案例中(参见Joubert等的文章“DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response；At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity？”,发表于lnt.J.Radiat.Biol.,vol.84(2),p.107-125(2008))。基于这些回顾性数据，并且知晓这些放疗期间积累的总剂量，可以得到相应未修复双链断裂(DSB)数的平行结果。实际上，在大量共济失调细胞系和LIG4突变系(细胞系180BR)的独特案例中，测量了未修复双链断裂的数。利用这些细胞系，系统地证明了在一次辐照剂量后，未修复断裂率超过了致死阈值。表2中列出了源自AT和180BR患者的细胞系的值，包含确定阈值高于非修复断裂数的证据，其中非修复断裂数是患者的致死阈值。对于这些特定的情况，相应的CTCAE等级是5(＝死亡)。

[0173] 严重等级2至4涉及组织反应(如皮炎、直肠炎等)。严重等级1涉及可忍受的副作用，经常被从业人员与等级0(无影响)混淆。图6(A)表示以不同患者pATM灶数的最大值为横坐标，辐照后修复24小时后由标记物pH2AX获得的灶数函数的最大值，证明了根据CTCAE分类的严重等级与这些参数之间存在相关性。

[0174] 因此，对不同患者的皮肤细胞样品(参见表2)，应用上文所述公式已经能够确定根据CTCAE分类的严重等级，即：

[0175] CTCAE＝5-Max[NpATM(t1)；NpATM(t2)]/10。

[0176] 这个公式特别适用于确定属于II类放射敏感性类别患者(中等放射敏感性)的严重等级。所有属于III类放射敏感性类型的患者(放射敏感性患者)显示为(并且必须显示为)严重等级5。禁止对所述放射敏感性患者进行放疗。

[0177] 在实践中，为了将患者归入正确的严重等级值，在确定根据CTCAE分类的严重等级之前，先确定患者的放射敏感性类别。目前，只有一个细胞系的案例，还不足以验证上述的根据前述公式确定严重等级的计算公式。该案例是属于III型放射敏感性类别的细胞系(180BR)的案例，而基于前述公式计算出其根据CTCAE的严重等级值为1。然而，优选在确定了患者的放射敏感性类别(I、II或III类)之后使用预测严重等级的公式。因此，根据本发明，患者180BR实际上属于III类(高放射敏感性)，并且因此不应以任何借口使其遭受辐射。另一方面，也利用所有其他细胞系验证了患者的严重等级。

[0178] 按照以下方式，利用上述公式已经测定了样品的放射敏感性类别：

[0179] (a)如果NpH2AX(t4)＜2并且NpATM(t1)＞NpATM(t2)，并且NpATM(t1)＞30并且A＜10并且B＜5并且C＜2；条件是：

[0180] C＝NpH2AX(t0)+NMN(t0)；

[0181] B＝t0时大细胞核(大于150μm2)的百分比％；

[0182] A＝NMRE11(t0)+小pH2AX灶数/t0时细胞；

[0183] 则认为样品是抗放射性的；

[0184] (b)如果(NpH2AX(t4)＞8或NMN(t4)＞24)，则认为样品是高放射敏感性的；

[0185] (c)在所有其他情况下，认为样品为中度放射敏感性的。

[0186] 在表2中示出了根据CTCAE分类的严重等级和样品的放射敏感性的定量值。