一种组合物的生产方法

摘要

本发明提供了一种组合物的生产方法，该方法在水存在下，使聚合物的粒子与蒽环类化合物的溶液接触，藉此将蒽环类化合物吸收入聚合物基质中，其中该组合物包含具有一种遇水可膨胀但不溶于水的聚合物基质和一种吸收在该基质中的水溶性治疗剂的粒子，其特征在于：所述聚合物在pH6－8范围内总体带有负电荷，当所述粒子在水中膨胀达到平衡时，其粒子大小在40－1500μm之间，所述治疗剂为至少带有一个氨基的蒽环类化合物。

权利要求

1.一种组合物的生产方法，该方法在水存在下，使聚合物的粒子与蒽环类化合物的溶液接触，藉此将蒽环类化合物吸收入聚合物基质中，其中该组合物包含具有一种遇水可膨胀但不溶于水的聚合物基质和一种吸收在该基质中的水溶性治疗剂的粒子，其中所述水溶性治疗剂离子键结合所述聚合物基质，其特征在于：在该粒子中，所述聚合物在pH6-8范围内总体带有负电荷，当所述粒子在水中膨胀达到平衡时，其粒子大小在40-1500μm之间，并且其中所述治疗剂为至少带有一个氨基的蒽环类化合物，其中所述聚合物是共价交联的聚乙烯醇(PVA)，该聚合物通过每个分子含有至少两个乙烯侧链基团或丙烯酸侧链基团的聚乙烯醇大分子单体与包括阴离子单体的烯键不饱和单体共聚合形成；并且其中聚乙烯醇大分子单体与其他单体的重量比在50∶1到1∶5范围内；在烯键不饱和单体中，阴离子单体的含量在10-100摩尔％范围；其中在聚合物基质中，阴离子水平在0.1-10meq g-1的范围，并且所述粒子是微球。

2.根据权利要求1的方法，其中所述丙烯酸侧链基团由丙烯酸或甲基丙烯酸与交联的聚乙烯醇通过一个或多个羟基发生反应以生成酯键来形成。

3.根据权利要求1的组合物的生产方法，其中所述聚乙烯醇大分子单体具有1,000-

500,000D范围的平均分子量。

4.根据权利要求3的组合物的生产方法，其中所述聚乙烯醇大分子单体具有10,000-

100,000D范围的平均分子量。

5.根据权利要求1的组合物的生产方法，其中所述烯键不饱和侧链基团通过环状缩醛键与相邻羟基的氧原子连接。

6.根据权利要求5的组合物的生产方法，其中所述烯键不饱和侧链基团通过环状缩醛键与相邻羟基的氧原子连接，所述环状缩醛键通过N-(烷基)丙烯酰胺基取代的醛的反应形成，通常为二烷基缩醛形式。

7.根据权利要求6的组合物的生产方法，其中所述二烷基缩醛为N-丙烯酰胺基乙醛二甲基缩醛。

8.根据权利要求1的组合物的生产方法，其中阴离子单体的含量至少25摩尔％。

9.根据权利要求1或8的组合物的生产方法，其中阴离子单体的含量为100摩尔％。

10.根据权利要求1的组合物的生产方法，聚乙烯醇大分子单体与其他单体的重量比在

20∶1到1∶2范围内。

11.根据权利要求1的组合物的生产方法，其中所述阴离子单体具有通式IY1BQ

其中Y1选自：

其中：

R是氢或者C1-C4烷基；

R1是氢或者C1-C4烷基；

R2是氢或者C1-4烷基或者BQ，其中B和Q定义如下；

A是-O-或者-NR1-；

K1是基团-(CH2)rOC(O)-、-(CH2)rC(O)O-、-(CH2)rOC(O)O-、-(CH2)rNR3-、-(CH2)rNR3C(O)-、-(CH2)rC(O)NR3-、-(CH2)rNR3C(O)O-、-(CH2)rOC(O)NR3-、-(CH2)rNR3C(O)NR3-、-(CH2)rO-、-(CH2)rSO3-、或任选与B结合而形成价键，r为1到12，R3是氢或C1-C4烷基，并且其中，基团R3相同或不同；

B是直链或支链烷二基、氧亚烷基、烷二基氧烷二基或烷二基低聚(氧烷二基)链，该链任选包含一个或多个氟原子，直到形成并且包括全氟取代链；或者，如果Q或Y1包含与B键接的末端碳原子，是价键；

Q是阴离子基团。

12.根据权利要求11的组合物的生产方法，其中Q是羧酸盐、碳酸盐、磺酸盐、硫酸盐、硝酸盐、膦酸盐或磷酸盐基团。

13.根据权利要求12的组合物的生产方法，其中所述阴离子单体具有通式IY1BQ

1

其中Y是CH2＝CRCOA，其中R是H或甲基，且A是NH，B是C1-12烷二基，以及

Q是磺酸盐基团。

14.根据权利要求13的组合物的生产方法，其中在聚合物基质中，阴离子水平至少为-1

1.0meq g 。

15.根据权利要求13的组合物的生产方法，其中所述阴离子单体是2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)。

16.根据权利要求1的组合物的生产方法，所述聚乙烯醇大分子单体包含聚乙烯醇的骨架，该骨架通过环状缩醛键与(烷基)丙烯酰胺烷基部分连接。

17.根据权利要求16的组合物的生产方法，其中所述聚乙烯醇大分子单体为Nelfilcon B。

18.根据权利要求1的组合物的生产方法，其中所述蒽环类化合物是具有通式II的化合物：

19.根据权利要求18的组合物的生产方法，其中所述蒽环类化合物是阿霉素。

20.根据权利要求1的组合物的生产方法，其中所述遇水可膨胀但不溶于水的聚合物的平衡水含量为40-99重量％，所述平衡水含量是通过重量分析测量。

21.根据权利要求20的组合物的生产方法，其中所述遇水可膨胀但不溶于水的聚合物的平衡水含量为75-95重量％，所述平衡水含量是通过重量分析测量。

22.根据权利要求1的组合物的生产方法，其中所述粒子膨胀并悬浮于水性液体中。

23.根据权利要求1的组合物的生产方法，该组合物进一步包含一种成像剂。

24.根据权利要求23的组合物的生产方法，所述成像剂是造影剂。

25.根据权利要求1的组合物的生产方法，该组合物装在一个灭菌储存容器中。

26.根据权利要求25的组合物的生产方法，其中所述储存容器是注射器。

27.根据权利要求1的方法，其中所述接触通过将聚合物粒子悬浮在蒽环类化合物的水溶液中进行。

28.根据权利要求27的方法，其中基质中吸收有蒽环类化合物的聚合物粒子从悬浮液中回收并干燥。

29.根据权利要求28的方法，其中所述粒子通过冷冻干燥法干燥。

30.根据权利要求27的方法，其中将膨胀聚合物的粒子与上清液分离并于仍然被膨胀液膨胀时转移到储存容器中，并在该容器中灭菌和保存。

说明书

一种组合物的生产方法

[0001] 本申请是申请日为2004年2月12日，申请号为201410044028.5，发明名称为“用于实体瘤的化学栓塞治疗的组合物”的发明专利申请的分案申请。

[0002] 本发明涉及含有聚合栓塞物质和一种结合到该聚合物基质中的治疗剂的组合物。这种组合物用于栓塞肿瘤和向肿瘤释放细胞毒剂。

[0003] 栓塞治疗是介入医学中一个正在发展的领域，但是通常它要依赖导管经动脉到达指定位置，从而释放出一种试剂以阻塞特定的血管。这种治疗已经被用于阻断诸如肝细胞肿瘤的某些血管过多的肿瘤的血液供应，而且近来正成为子宫纤维瘤治疗的一个普遍选择。

[0004] 临床应用的栓塞物质具有一定的范围，需要能够经导管释放到栓塞部位，从而被释放到血流中并将其阻断。这可以通过应用小的粒子或小球从物理上阻断血管实现，或者在液体栓塞剂情况下，需要某种相变或反应使流动性物质固化并在血管内形成铸型物(cast)。

[0005] 最普遍的基于微粒的栓塞剂是已经应用了数十年的聚乙烯醇(PVA)泡沫粒子(如埃弗伦)。最近，已经出现了这种物质的微粒而不是薄片形式，因此不需要在释放前由外科医师制成颗粒状。

[0006] 在WO-A-0168720中叙述了基于PVA的栓塞治疗组合物。先将PVA衍生化形成具有丙烯酸侧链基团的大单体。然后任选在共聚单体存在下使这些丙烯酸基团聚合，形成遇水可膨胀但不溶于水的聚合物基质。聚合反应可以在原位发生，藉此PVA在被释放入血管到达栓塞部位后具有了水不溶性。另外，聚合也可在释放前进行，通常形成微球并在以在水性媒介中的悬浮液形式释放。

[0007] 在WO-A-0168720中，建议可以在栓塞组合物中加入生物活性剂，使活性剂可以从所形成的水凝胶中释放。一类活性剂是化学治疗剂。化学治疗剂的实例有顺铂、阿霉素和丝裂霉素。该文献给出了关于将活性剂结合到栓塞组合物中的方法的一些一般性的指导。如果组合物是一种原位固化的液体，只需将活性剂和液体混合。如果该制品是预先形成的，则建议可通过“包封”或者通过涂到表面上来结合活性剂。还没有将治疗剂结合到任何类型的组合物中成功的例子。

[0008] 用醛交联剂如戊二醛使聚甲基丙烯酸羟乙酯、经水解的聚甲基丙烯酸甲酯和PVA交联形成的水凝胶物质的微球也已经用作栓塞剂。甲基丙烯酸羟乙酯可与共聚单体如含有酸性基团的共聚单体共聚。例如，甲基丙烯酸羟乙酯和约1-2摩尔％丙烯酸通过0.3-1.0摩尔％乙二醇二甲基丙烯酸酯交联后形成的交联共聚物，其平衡水分含量范围在55-60％(重量)之间，并已以隐形眼镜形式使用多年。

[0009] 市场上的一种栓塞产品由Biosphere公司出售，该产品含有带有胶原蛋白涂层的三丙烯酰明胶(trisacrylgelatin)微球。胶原蛋白在生理pH下总体上带有正电荷。在Ball，D.S.et al.，J.Vasc.Interv.Radiol.(2003)，14，83-88中，Biosphere公司证明，当微球体与常与栓塞组合物同时给予的一系列药物混合时，微球的机械特性并没有受到不利的影响。对阿霉素、顺铂和米托蒽醌进行了专门的测试。

[0010] 阿霉素和其他蒽环类已经结合到许多以聚合物基质为基础的释放系统中，例如聚丙交酯类或聚乙交酯类微球以及交联纤维蛋白原和白蛋白微球。Juni，K.等人(Chem.Pharm.Bull.(1985)，33(1)，313-318)描述了将阿霉素结合到聚乳酸微球中以及使该组合物动脉内释放至狗的肝脏。该组合物栓塞了肝脏的外周动脉。这些类型的微球比较坚硬，不易存储和释放。已经将阿霉素共价连接到交联聚乙烯醇表面并且检测了它的细胞毒特性(Wingard，L B et al.Cancer Research(1985)45(8)3529-3536)。由于药物被共价结合到聚合物上，在释放之前必须从表面上切下，因此在生理条件下可能无法释放。

[0011] Jones，C.等人(Brit.J.Cancer(1989)59(5))描述了将阿霉素结合到离子交换微球上及用该组合物对大鼠肿瘤模型进行化学栓塞治疗。

[0012] 本发明的一种新的适用于栓塞的组合物包含具有一种遇水可膨胀但不溶于水的聚合物基质和一种吸收在该基质中的水溶性治疗剂的粒子，其特征在于：该聚合物在pH6-8范围内总体带有负电荷，当粒子在水中膨胀达到平衡时，其粒子大小在40-1500μm之间，治疗剂为带有至少一个氨基的蒽环类化合物。

[0013] 本发明中的聚合物必须是遇水可膨胀但不溶于水的。因此，在水性液体存在下，聚合物会形成水凝胶。一般而言该聚合物是共价交联的，但该聚合物至少部分离子交联也是合适的。该聚合物可以通过烯键不饱和单体在双官能或更高官能度的交联单体存在下进行聚合而制成，烯键不饱和单体包括阴离子单体。可以使用甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸和交联单体如乙二醇二甲基丙烯酸酯或亚甲基双丙烯酰胺的共聚物，如用于基于etafilcon A的隐形眼镜的共聚物。

[0014] 另一类可以用于形成遇水可膨胀但不溶于水的基质的聚合物是用醛类交联剂如戊二醛交联的聚乙烯醇。对于这种产物，聚乙烯醇必须是阴离子型的，例如通过使含有酸性官能团的单体与羟基反应提供阴离子侧链基团。合适的试剂的例子有二酸，如二羧酸。

[0015] 如果聚合物基质由每个分子都含有不止一个烯键不饱和侧链基团的聚乙烯醇大分子单体，通过与包括一种酸性单体的烯键不饱和单体共聚合而制成，则本发明具有特殊的价值。PVA大分子单体可以通过例如提供具有合适的分子量如1000-500,000D之间，优选在10,000-100,000D之间，带有乙烯或丙烯酸侧链基团的PVA聚合物来制成。丙烯酸侧链基团可以由例如丙烯酸或甲基丙烯酸与PVA通过某些羟基发生反应生成酯键来形成。能够使乙烯基团聚合到聚乙烯醇上的方法在例如US 4,978,713，优选US 5,508,317和5,583,163中有所叙述。例如，优选的大分子单体包含一个聚乙烯醇的骨架，该骨架通过一个环状缩醛键与一个(烷基)丙烯酰胺烷基部分连接。实施例1描述了这样一种大分子单体的合成。优选每个分子具有约2-20个(例如5-10个)烯基侧链基团的PVA大分子单体，。

[0016] 当PVA大分子单体与包括一种酸性单体的烯键不饱和单体共聚合时，所述酸性单体优选具有通式I

[0017] Y1BQ

[0018] 其中Y1选自：

[0019]

[0020] CH2＝C(R)-CH2-O-，CH2＝C(R)-CH2OC(O)-，CH2＝C(R)OC(O)-，CH2＝C(R)-O-，[0021] CH2＝C(R)CH2OC(O)N(R1)-，R2OOCCR＝CRC(O)-O-，RCH＝CHC(O)O-，

[0022] RCH＝C(COOR2)CH2-C(O)-O-，

[0023]

[0024] 其中：

[0025] R是氢或者C1-C4烷基；

[0026] R1是氢或者C1-C4烷基；

[0027] R2是氢或者C1-4烷基或者BQ，其中B和Q定义如下；

[0028] A是-O-或者-NR1-；

[0029] K1是基团-(CH2)rOC(O)-、-(CH2)rC(O)O-、-(CH2)rOC(O)O-、-(CH2)rNR3-、-(CH2)rNR3C(O)-、-(CH2)rC(O)NR3-、-(CH2)rNR3C(O)O-、-(CH2)rOC(O)NR3-、-(CH2)rNR3C(O)NR3-(其中基团R3相同或不同)、-(CH2)rO-、-(CH2)rSO3-、或任选与B结合而形成一个价键，r为1到12，R3是氢或C1-C4烷基；

[0030] B是直链或支链烷二基、氧亚烷基、烷二基氧烷二基或烷二基低聚(氧烷二基)链，该链任选包含一个或多个氟原子，直到形成并且包括全氟取代链；或者，如果Q或Y1包含一个与B键接的末端碳原子，是一个价键；

[0031] Q是一个阴离子基团。

[0032] 所述阴离子基团可以是诸如羧酸盐、碳酸盐、磺酸盐、硫酸盐、硝酸盐、膦酸盐或磷酸盐基团，优选磺酸盐基团。单体可以以游离酸或者盐的形式聚合。优选共轭酸的pKa值小于5。

[0033] 在通式I的单体中，Y1优选为CH2＝CRCOA-基团，其中R是H或甲基，优选甲基，A优选为NH。B优选为1-12个碳原子，优选2-6个碳原子的烷二基。

[0034] 一种特别优选的单体类型是(烷基)丙烯酰胺基烷基磺酸，如2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)。

[0035] 在烯键不饱和单体中可以包含稀释单体，例如非离子单体。这种单体可能有利于控制酸性基团的pK。，控制产物的亲水性或疏水性，在聚合物中提供疏水区，或者仅起惰性稀释剂的作用。非离子稀释单体的例子有(烷基)丙烯酸烷基酯和(烷基)丙烯酰胺，尤其是含有1-12个碳原子的烷基的这类化合物；羟基和二羟基取代的(烷基)丙烯酸烷基酯和(烷基)丙烯酰胺；乙烯基内酰胺；苯乙烯及其他芳香单体。

[0036] 烯键不饱和单体还可以包括两性离子单体，例如为了增加粒子的亲水性、润滑性、生物相容性和/或血相容性。合适的两性离子单体在我们先前公开的WO-A-9207885、WO-A-9416748、WO-A-9416749和WO-A-9520407中有所叙述。两性离子单体优选为2-甲基丙烯酰氧基-2’-三甲胺乙基磷酸内盐(MPC)。

[0037] 在聚合物基质中，阴离子水平优选在0.1-10meq g-1的范围，优选至少为1.0meq g-1。

[0038] 在PVA大分子单体与其他烯键不饱和单体共聚合时，PVA大分子单体与其他单体的重量比优选在50∶1到1∶5范围内，更优选在20∶1到1∶2范围内。在烯键不饱和单体中，阴离子单体的含量优选在10-100摩尔％范围，优选至少25摩尔％。

[0039] 通过重量分析测定，遇水可膨胀但不溶于水的聚合物优选具有40-99％(重量)的平衡水含量，优选75-95％。

[0040] 聚合物可以通过几种方法形成粒子。例如，交联的聚合物可以制成整块材料如薄片或块状，然后粉碎成所需的尺寸。另外，交联聚合物也可以本身就制成粒子形式，例如在连续的不互溶载体的分散相中以单体的小滴进行聚合。已知的例子如合适的油包水聚合能够产生膨胀时具有预期大小的粒子。例如，US 4,224,427描述了在存在悬浮剂的情况下，通过将水溶性单体分散到连续的溶剂相中，形成最大直径为5mm的大小一致的球状珠的方法。可以加入稳定剂和表面活性剂以控制分散相粒子的大小。聚合后，交联的微球用已知方法回收，清洗并任选消毒。粒子例如微球优选在水性液体中膨胀并根据它们的大小进行分级。

[0041] 本发明所使用的治疗活性物质是一种蒽环类化合物，它包括连接有一个氨基糖的蒽醌基团。据认为，糖上的氨基与聚合物基质中的阴离子基团结合，从而实现高水平的载药量和给药后的受控释放。

[0042] 合适的蒽环类化合物的例子具有通式II

[0043]

[0044] 我们已经发现，对各种肿瘤的有效性已经得到全面测试的阿霉素具有特别有趣的载药和释放特性。该药物似乎对聚乙烯醇-接枝-丙烯酰胺基丙磺酸共聚物有特殊的亲和力，因此高水平的阿霉素能够结合到该聚合物中并在多日内释放。

[0045] 在本发明中，药物非共价结合到聚合物基质上是很重要的。

[0046] 治疗活性物质可以通过多种方法结合到聚合物基质中。在一种方法中，在聚合或交联之前治疗活性物质可以与一种聚合物前体混合，例如一种单体或大分子单体混合物或者一种可交联的聚合物和交联剂的混合物。另外，活性物质也可以在聚合物交联后再加载到其中。例如，微粒状干燥聚合物可以在治疗活性物质的溶液(优选水溶液)中膨胀，随后任选除去未吸收的药物并/或蒸发溶剂。活性物质溶于诸如乙醇等有机溶剂(或更优选的是水)的溶液，可以喷射到粒子的移动床上，藉此药物在除去溶剂的同时被吸收到粒子本体内。最为方便的是，我们已经发现可以仅仅将悬浮于连续液体介质如水中的膨胀粒子与药物溶液长时间接触，由此药物被吸收到粒子本体内。据认为，这类似于阳离子交换型过程。随后可以将膨胀介质除去，或者方便地将膨胀介质和粒子一起作为产物的一部分保留下来，以后用作为栓塞剂。

[0047] 在一个特别优选的实施方案中，膨胀粒子通过简单的凝胶/液体分离技术与未被基质吸收的膨胀介质分离，例如经孔径合适的滤器(方便的是玻璃滤器)过滤。带有很少或没有粒子外液体的膨胀粒子浆可被泵入合适的贮存容器中以消毒和以原样保存。发现该粒子浆足够稳定，因为在这种形式的储存过程中很少有液体渗出，也没有药物损失。

[0048] 另外，粒子的悬浮液也可以通过过滤来除去任何残留的载药溶液，粒子可以通过用于干燥药物产品的任何经典方法来干燥。这包括但不局限于室温或高温、或减压或真空下的空气干燥；经典的冷冻干燥；常压冷冻干燥；超临界流体的溶液强化分散(SEDS)。另外，载药的微球可以用有机溶剂取代水通过一系列步骤而脱水，接着使更易挥发的有机溶剂蒸发。有机溶剂应当选择不能溶解药物的溶剂。

[0049] 简言之，一个典型的经典冷冻干燥过程可以如下进行：将一份样品分装到一些被部分塞住的玻璃小瓶中，将小瓶放置在冷冻干燥器中冷却的控温架上。降低控温架的温度，使样品冻结至均匀的确定温度。冷冻完成以后，降低干燥器中的压力至确定的压力以启动初级干燥。在初级干燥过程中，水蒸气通过升华从冻结块中被逐步除去，同时控温架的温度被控制在恒定的低温。二级干燥通过提高控温架温度并进一步降低室压来启动，因此吸收在半干燥块中的水可以被除去直到残余的水分减少到希望的水平。小瓶可以在原位密封，如果需要可在保护气氛下密封。

[0050] 常压冷冻干燥法是通过在冷冻产物上进行非常干燥的空气的快速循环来完成的。与经典的冷冻干燥方法相比，非真空冷冻干燥具有许多优点。循环的干燥气体改善了热量和物质从冷冻样品的转移，这与洗涤物在有风的天气中干得更快是相同的。这个领域的大多数工作都与食品生产有关，已经观察到挥发性芳香化合物的保留量有所增加，其对生物制品干燥的潜在益处尚不确定。特别引人注意的是，使用常压喷雾干燥方法得到的是自由流动的细粉末而不是块状物。可以获得具有亚微米级直径的粒子，这比通常由磨制得到的粒子小十倍。微粒的本质以及它的大表面积导致产生易于再水合的产物，目前还不可能对可吸入和经皮肤应用所需的粒子大小进行精细的控制，但是这个领域仍存在潜力。

[0051] 对于患有实体瘤如肝细胞肿瘤并需要进行栓塞治疗的患者给予的组合物是含有吸收药物的膨胀粒子的水悬浮液。通常希望悬浮液在释放之前与成像剂如用于凝胶型栓塞组合物的常规造影剂混合。例如，含有吸收药物的膨胀粒子的水悬浮液可以在临给药之前与通常与栓塞剂一起使用的液体造影剂如碘油按体积比2∶1到1∶2的量(优选约1∶1)混合。对于本发明中含有吸收药物但极少或不含有粒子外液体的膨胀粒子浆的实施方案，粒子浆和造影剂可以类似地在临释放前混合在一起，例如按体积比在1∶5到2∶1范围，优选在1∶2到
1∶1范围的量混合。当含有药物的组合物以干燥的形式供给使用时，可将干燥的粒子加入造影剂中，或者优选先在水性介质如生理盐水中膨胀以形成浆液或悬浮液，然后在释放之前与造影剂混合。另外，除蒽环化合物外，粒子还可以预先装载造影剂。给药的组合物也可以与其他治疗剂相混合，或者也可以与其他治疗剂分开联合给药。通常，组合物用常规的释放装置如动脉内导管从注射器针筒中给药。

[0052] 给予需要栓塞治疗的患者的栓塞组合物可以以一次性单剂量释放。栓塞过程采用常规技术通过跟踪造影剂来监控。可能会发现，最好在第一次剂量给予一段时间后，如在第一次用含有阿霉素的组合物治疗4-10周后，释放二次剂量的栓塞组合物，以栓塞新形成的向肿瘤供血的血管，优选二次剂量的栓塞组合物，优选可用于本发明的化学栓塞组合物。组合物以每次治疗25-100mg/m2范围的药物剂量给药，但也可以在经过充分的安全性评估后使用更高的剂量。阿霉素每次治疗的优选剂量可大于50mg/m2，例如达到100mg/m2或更高。通常认为每个患者每次治疗给予高于150mg的剂量是不可取的。

[0053] 作为本发明的第二方面，提供了一种蒽环化合物在制备用于对实体瘤进行栓塞治疗的组合物中的用途，在此治疗中，蒽环化合物从一种聚合物基质中释放，所述聚合物基质是由每个分子带有至少两个烯键不饱和侧链基团的聚乙烯醇大分子单体和烯键不饱和阴离子单体共聚合形成的。

[0054] 在本发明的这个方面，聚合物基质可以在原位形成。这样，含有大分子单体、阴离子单体和蒽环化合物的液体组合物可以被释放到患者的血液循环中并被置于能够在靶部位引发聚合的条件下，由此形成栓塞凝胶。另外，聚合物基质也可以在给药前预先形成，如本发明的第一方面所述。

[0055] PVA大分子单体和阴离子单体优选如以上第一方面所述。其他单体也可以如本发明第一方面所述进行共聚合。附图说明：

[0056] 图1示出了低AMPS和高AMPS微球对阿霉素的载药量。

[0057] 图2示出了阿霉素的浓度对高AMPS微球载药过程的影响。

[0058] 图3示出了微球大小范围对阿霉素载药过程的影响。

[0059] 图4示出了阿霉素加载到高AMPS微球中的重现性。

[0060] 图5示出了阿霉素从高AMPS微球中的体外洗脱。

[0061] 图6示出了高AMPS微球对阿霉素的吸收。

[0062] 图7示出了目标剂量和实际剂量的图。

[0063] 图8示出了不同阿霉素溶液的载药量。

[0064] 图9示出了不同蒽环类在微球中的载药量。

[0065] 图10示出了蒽环类在2小时内的洗脱。

[0066] 图11示出了蒽环类在72小时内的洗脱。

[0067] 图12示出了蒽环类对微球大小的影响。

[0068] 图13示出了阿霉素在不同微球(900-1200微米)中的载药量。

[0069] 图14示出了载药对大小分布的影响(100-300μm微球)。

[0070] 图15示出了微球大小对阿霉素洗脱的影响。

[0071] 图16示出了阿霉素从血浆中和PBS中的微球中的洗脱。

[0072] 图17示出了不同药物剂量和微球大小的失重。

[0073] 图18示出了阿霉素在100小时内的洗脱。

[0074] 图19示出了处理过程对微球大小范围的影响。

[0075] 图20示出了从阿霉素洗脱微球(DEB)中释放的阿霉素与动脉内注射阿霉素(IA)在肿瘤中以及外周肝组织中阿霉素水平的药物代谢动力学比较。

[0076] 图21示出了动脉注射阿霉素与阿霉素载药微球的血浆阿霉素和阿霉素醇水平的药物代谢动力学比较。

[0077] 图22示出了使用阿霉素洗脱微球(DEB)进行栓塞后肿瘤组织随时间坏死。

[0078] 本发明由以下实施例具体说明，其结果如下图所示：

[0079] 图1显示实施例2的结果；

[0080] 图2显示实施例3的结果；

[0081] 图3显示实施例4的结果；

[0082] 图4显示实施例5的结果；

[0083] 图5显示实施例6的结果；

[0084] 图6a和b显示实施例7的结果。

[0085] 实施例1：微球制备方法概述

[0086] Nelfilcon B大分子单体合成：

[0087] 微球合成的第一个阶段包括制备Nelfilcon B，它是一种来自广泛使用的水溶性聚合物PVA的可聚合性大分子单体。将Mowiol 8-88聚乙烯醇(PVA)粉末(88％水解，含12％醋酸盐，平均分子量约67,000D)(150g)(Clariant，Charlotte，NC USA)加入到一个2升的玻璃反应容器内。轻轻地搅拌下加入1000ml水并将搅拌速度提高到400rpm。为了确保PVA完全溶解，将温度提高到99±9℃保持2-3小时。在冷却到室温后，将N-丙烯酰胺基乙醛(NAAADA)(Ciba Vision，德国)(2.49g或0.104mmol/g的PVA)混合到PVA溶液中，随后加入浓盐酸(100ml)，以催化NAAADA通过酯交换作用与PVA的加成。反应在室温进行6-7小时，然后使用2.5M的氢氧化钠溶液中和至pH7.4来终止反应。所生成的氯化钠和所有未反应的NAAADA用透析过滤法除去(步骤2)。

[0088] 大分子单体的透析过滤：

[0089] 透析过滤(切向流过滤)的原理是使需要纯化的进料溶液(在本例中为Nelfilcon B溶液)跨过滤膜表面连续循环，滤膜能使不需要的物质(NaCl、NAAADA)透过成为废弃物，同时具有足够小的孔径可以阻止保留液通过而使其留在循环中。

[0090] Nelfilcon B透析过滤使用不锈钢Pellicon 2小型支架进行，该支架上堆放有若干其孔径的截留分子量为3000的0.1m2纤维素滤膜(Millipore Corporation，Bedford，MA美国)。Mowiol 8-88的重均分子量为67000，因此透过滤膜的能力有限。

[0091] 向装有大分子单体的烧瓶中放入磁性搅拌棒并将烧瓶放置在搅拌板上。使用LS24 VI型导管，经安装有Easy Load II泵头的Masterflex LS蠕动泵将溶液加入到透析过滤组件中。Nelfilcon以大约50磅/平方英寸在滤膜上循环以加速渗透。当溶液被浓缩到约1000ml时，以与废弃的滤出液收集速度相同的速度加入水以保持体积恒定，直到额外加入
6000ml水。完成后立即在25℃下将溶液浓缩至20-23％固体，粘度为1700-3400厘泊。
Nelfilcon通过GFC、NMR和粘度来定性鉴定。

[0092] 微球合成：

[0093] 用悬浮聚合法合成微球，其中将水相(Nelfilcon B)加入到与其不互溶的有机相(乙酸丁酯)中。采用快速混合能够使水相分散形成液滴，液滴的大小和稳定性受诸如搅拌速度、粘度、水相和有机相的比例以及影响两相之间界面能的稳定剂和表面活性剂的使用等因素的控制。制造了两个系列的微球，即较低AMPS系列和较高AMPS系列，它们的组成如下所示。

[0094] A高AMPS：

[0095] 水相：约21％w/w Nelfilcon B溶液(约400±50g)

[0096] 约50％w/w 2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸钠盐(140±10g)

[0097] 纯化水(137±30g)

[0098] 过硫酸钾(5.22±0.1g)

[0099] 四甲基乙二胺TMEDA(6.4±0.1ml)

[0100] 有机相：乙酸正丁酯(2.7±0.3L)

[0101] 乙酸乙酯中的10％w/w乙酸丁酸纤维素(46±0.5g)(稳定剂)

[0102] 纯化水(19.0±0.5ml)

[0103] B低AMPS：

[0104] 水相：约21％w/w Nelfilcon B溶液(约900±100g)

[0105] 约50％w/w 2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸钠盐(30.6±6g)

[0106] 纯化水(426±80g)

[0107] 过硫酸钾(20.88±0.2g)

[0108] TMEDA(25.6±0.5ml)

[0109] 有机相：乙酸正丁酯(2.2±0.3L)

[0110] 乙酸乙酯中的10％w/w乙酸丁酸纤维素(CAB)(92±1.0g)

[0111] 纯化水(16.7±0.5ml)

[0112] 用计算机控制的具有连续检测反应温度的反馈传感器的热浴(Julabo PN 9-300-650)加热带夹层的4000ml反应器。

[0113] 25℃下将乙酸丁酯加入反应器中，然后加入CAB溶液和水。系统用氮气吹扫15分钟，然后加入PVA大分子单体。加入TMEDA并在氮气下将温度升至55℃保持3小时，引发分散的PVA溶液的交联。交联反应通过氧化还原引发的聚合反应来进行，即，TMEDA的氨基与过硫酸钾中的过氧化基团反应生成自由基。然后这些自由基引发PVA和AMPS上的双键的聚合和交联，从而将分散的PVA-AMPS小滴转化成不溶性的聚合物微球。冷却到25℃后，产物被转移到过滤反应器上进行纯化，其中过滤除去乙酸丁酯，然后进行以下步骤：

[0114] ·用2×300ml乙酸乙酯清洗以除去乙酸丁酯和CAB

[0115] ·在乙酸乙酯中平衡30分钟，然后过滤

[0116] ·用2×300ml乙酸乙酯在真空过滤下清洗

[0117] ·在丙酮中平衡30分钟并过滤除去乙酸乙酯、CAB和水

[0118] ·用2×300ml丙酮在真空过滤下清洗

[0119] ·在丙酮中平衡过夜

[0120] ·用2×300ml丙酮在真空下清洗

[0121] ·55℃下真空干燥2小时以除去残余溶剂

[0122] 染色：

[0123] 这一步是任选的，但是通常当药物与有色活性物一起加载时这一步是不必要的(因为该有色活性物本身就可提供颜色)。当水合时，微球含有约90％(w/w)的水，很难观察。为了便于在临床环境中进行观察，微球用活性蓝4号染料(RB4)染成蓝色。RB4是一种水溶性氯三嗪染料，它在碱性条件下能与PVA骨架上的羟基侧链基团反应生成共价醚键。反应在pH12(NaOH)下进行，因此所生成的HCl会被中和而生成NaCl。

[0124] 在染色之前，微球被完全重新水合并以35g为一份分成多份(分别处理)。染色液如下制备：将0.8g RB4溶于2.5M NaOH溶液(25ml)和水(15ml)中，然后将其加入到2升80g/l盐溶液中的微球中。混合20分钟后，用32μm筛收集产物并漂洗除去未反应的染料块。

[0125] 提取：

[0126] 采用一种粗提取方法来除去所有未结合的或非特异性吸附的RB4。所用的方案如下所示：

[0127] ·在2升水中平衡5分钟。在筛上收集并漂洗。重复5次。

[0128] ·在2升80mM磷酸氢二钠在0.29％(w/w)盐溶液中的溶液中平衡。加热至沸腾30分钟。冷却，在筛上收集并用1升盐溶液洗涤。再重复2次。

[0129] ·收集，在筛上洗涤，并在2升水中平衡10分钟。

[0130] ·收集并于1升丙酮中脱水30分钟。

[0131] ·合并所有各份微球并在2升丙酮中平衡过夜。

[0132] 筛分：

[0133] 所制得的微球产品大小范围在100-1200微米，必须使用一定范围筛孔大小进行筛分从而使其分级，获得下列的额定分布。

[0134] 1.100-300μm

[0135] 2.300-500μm

[0136] 3.500-700μm

[0137] 4.700-900μm

[0138] 5.900-1200μm

[0139] 在筛分之前，将微球真空干燥以除尽溶剂，然后于60℃在水中平衡以完全重新水合。使用带有15英寸不锈钢筛分盘、筛孔大小在32-1000μm范围的316升不锈钢涡旋筛装置(vortisieve unit)(MM Industries，Salem Ohio)对微球进行筛分。使过滤后的盐溶液通过该装置再循环以帮助分级。弃去32微米筛中收集的微球。

[0140] 实施例2：阿霉素的加载

[0141] 本实验使用如实施例1制备的低AMPS微球。对所使用的每一种大小的微球，取0.5ml转移至2个1ml注射器中，一个用于吸收药物，另一个用作对照。实验所选用的大小为
106-300μm、300-500μm、500-710μm和850-1000μm。为了验证操作的可靠性，再另外准备3个装500-710μm微球的注射器。将11个10ml小玻璃瓶用箔包好，以防止在实验过程中阿霉素被光降解。绘制标准曲线。用80ml浓度为20mg/ml的药物溶液制备下列浓度并测定其光吸收(483nm)：100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml和3.125μg/ml。将所得到的光吸收绘制成曲线图，用曲线方程计算实验中被微球吸收的药物浓度。在加入微球时在4个小玻璃瓶中装入5ml蒸馏水(ROMIL)用作对照。剩下的7个小玻璃瓶中加入5ml所需浓度的药物溶液。起始光吸收及其对应的溶液浓度在制作标准曲线时就已经得知。(为了测定20mg/ml溶液的光吸收，必须将其稀释200倍而使用100μg/ml的浓度。这种1∶200的稀释液在测定微球对溶液的吸收的整个过程中都一直采用。)从第一批微球加入到第一个装有药物的小玻璃瓶中时就立即开始用计时表计时，微球按从最小到最大的顺序加入其余6个小玻璃瓶的每个瓶中。小玻璃瓶用盖子密封后，立即将其放到旋转混合器上。对照组样品重复同样的操作。以和设立小玻璃瓶相同的顺序在0.167小时(10分钟)、0.5小时、1小时、2小时、24小时和
96小时的时间间隔测定光吸收。从这些数据可以计算出每1ml微球的药物量(mg数)和每1ml微球的药物吸收百分率。结果如图1所示。

[0142] 实施例3：药物浓度对加载的影响

[0143] 依照实施例2所概述的方法，可以将一定范围不同浓度的阿霉素加载到高AMPS微球制品上。据观察，大部分药物在几小时内加载到微球(500-710μm大小范围)上(见图2)。可以观察到加载量按重量计远高于低AMPS制品。

[0144] 实施例4：微球大小对加载的影响

[0145] 在几个不同大小范围的微球上进行阿霉素的加载以便比较药物吸收量。尽管观察到较小的微球加载药物较快，24小时内连续加载的结果表明，等重的微球达到平衡后的载药量也大致相同。较快的吸收是由于较小微球的表面积增大(见图3)。

[0146] 实施例5：加载的重现性

[0147] 为了测定阿霉素加载的重现性，将实施例2中概述的加载实验重复多次。500-710μm大小范围的高AMPS微球用20mg/ml药物水溶液加载药物，并监测药物随时间的吸收(图4)。

[0148] 实施例6：阿霉素从微球中的洗脱

[0149] 高AMPS微球用不同浓度的阿霉素加载并将微球洗脱至250ml蒸馏水中(图5)。

[0150] 从133.2μg/ml和2mg/ml载药微球上洗脱的药物在3小时时仍低于检测限。对于较高的载药量，在最初的几分钟内有明显的突释效应(burst effect)，随后是较缓慢的延时释放。据推测，突释反映了从微球内携带的水中洗脱出的游离药物，而延时洗脱是由主要通过带电基团间的离子相互作用“结合”到微球上的药物造成的。就最高载药量(来自20mg/ml加载溶液)而言，突释效应代表了微球总载药量的约45％，其余部分从载体上完全洗脱需要数天。研究表明，最终100％的药物都能从微球上洗脱。

[0151] 实施例7：高AMPS微球对阿霉素吸收作用的观察

[0152] 将1ml阿霉素在磷酸盐缓冲液PBS中的溶液(66.6μg/ml)和3ml PBS加入装有约0.5g大小在850-1000μm范围(手工筛分)的高AMPS微球的小瓶中。将微球放在CCD照相机下，每隔2分钟拍照一次，持续2.5小时。在此时间段内样品未出现搅动，但观察到由于光源的局部加热所致的小量运动。因此最初和最后的微球是相同的，在整个时间段中都是可比的。借助微球中红色的增强和周围溶液的减少而观察到药物的吸收(图6)。

[0153] 实施例8：干燥的载药微球的制备

[0154] 微球可以按照实施例2所述的方法加载阿霉素。微球使用如下方法脱水：将待脱水的微球放在塑料容器内，并用在PBS(Inverclyde Biologicals)中制备的10％丙酮(ROMIL)溶液覆盖。微球在溶液中放置10分钟，在这个过程中搅拌几次，每次30秒。然后将溶液倾倒出来，将这个过程再重复两次。增加丙酮浓度至25％、50％、75％和最终100％，重复该步骤。在最终100％脱水步骤后，倒出丙酮并将微球放在50℃烤箱中干燥至恒重。

[0155] 得到的干燥产物在栓塞操作前可以重新悬浮/重新水合于盐水/造影剂中。水合速度很快，膨胀至＞80％完全水合时的体积只需几分钟。

[0156] 实施例9：微球浆的制备

[0157] 使按上面实施例1生产的高AMPS微球在20mg/ml阿霉素水溶液中膨胀30分钟。在此之后观察到粒子外液体已基本脱色，颜色(红色)已基本被局限在微球内。悬浮液经烧结的玻璃漏斗过滤除去上清液。微球在轻微的负压下，在过滤器上用两倍体积的蒸馏水洗涤。然后将微球转移到广口瓶中，并用蠕动泵将其从广口瓶泵入玻璃注射器中。移走泵后用注射器塞将注射器封闭并用伽马射线灭菌。

[0158] 实施例10：加载-目标载药剂量和实际载药剂量

[0159] 在水中制备浓度为22-80mg/ml的一系列阿霉素溶液。取1ml这些溶液加入1ml高AMPS微球中，紫外检测药物吸收。样品在滚动混匀器上搅动。取10、20、30、60分钟时间点，其后是2小时，再后是24小时。由溶液中剩余的阿霉素计算吸收量。微球可以用最高至每ml水合微球80mg的不同剂量加载，在不到30分钟内，99％的药物溶液都已处于微球内。

[0160] 实施例11：高剂量阿霉素

[0161] 在实施例10中制备了80mg/ml的阿霉素溶液。这是一种粘稠的胶状混合物，不适于日常使用。重复该高剂量，但使用4ml 20mg/ml的阿霉素溶液。紫外检测药物吸收，又获得了1ml水合的高AMPS微球中载有80mg药物的最终载药量。

[0162] 实施例12：加载-药物来源

[0163] 使用三种来源的阿霉素制备本发明中25mg/ml载药量的微球。

[0164] ·AdriamycinTMPFS是一种市售(Pharmacia and Upjohn)的浓度为2mg/ml的溶液。

[0165] ·AdriamycinTMRDF是一种市售(Pharmacia and Upjohn)的加入了乳糖以助溶的粉剂。

[0166] ·阿霉素EP。

[0167] 对Adriamycin RDF和阿霉素EP溶液，取2ml加入2ml微球中，紫外检测药物吸收。对Adriamycin PPS溶液，取50ml 2mg/ml的溶液加入2ml微球中，检测药物吸收。30分钟后两个25mg/ml的溶液均已全部加载，而2mg/ml的溶液被跟踪了24小时才显示完全吸收(图8)。

[0168] 实施例13：其他蒽环类的加载

[0169] 制备4个1ml水合的高AMPS微球(900-1200μm)装入一个8ml玻璃容器的样品。用10ml玻璃量筒量取1ml磷酸盐缓冲液(PBS)中的微球，并将其转移到一个玻璃容器内。然后，用巴斯德玻璃吸管移出每个样品中的所有PBS。加载溶液如下制备：将1个小瓶中的20mg柔红霉素(Beacon Pharmaceuticals)用1ml水(ROMIL)复原，达到终浓度20mg/ml。将1个小瓶中的50mg表柔比星速溶液(Pharmacia)用2.5ml水复原，达到终浓度20mg/ml。如前面实施例所述，制备20mg/ml阿霉素(Dabur Oncology)溶液用于比较。制备后立即测定溶液在483nm处的紫外吸收，并制备稀释液以制作每种药物溶液的标准曲线。

[0170] 取1ml每种加载溶液和1ml水(作为对照)加入每个装有1ml如上所述制备的微球的小瓶中，并开始计时。整个实验中小瓶都放置在滚动混匀器上。在预定的时间点(0、10、20、30、45和60分钟)取出50μl，按需要进行稀释并在483nm处读数。由这些读数，根据每种情况下的相应标准曲线来计算每个时间点的溶液浓度。加载到微球中的药物量通过用该装置提取时溶液中药物的减少来测定。由这些数据计算每1ml水合微球载药的mg数并做图(图9)。
这表明被测试的蒽环类均以相同的方式加载。

[0171] 实施例14：其他蒽环类的洗脱

[0172] 用如实施例13所述载药的微球确定药物释放形式。每种类型的载药微球取1ml转移到装有100ml PBS的棕色玻璃容器中并开始计时。在整个实验中容器置于37℃水浴中。在预定的时间点(0、0.16、0.5、1、2和72小时)取出1ml溶液，读数后放回容器中，这样使体积保持恒定。样品在483nm处读数，并由实施例12所确定的各个蒽环类的标准曲线的方程式计算浓度。由这些数据计算每1ml微球中洗脱出的药物的mg数并做图(图10+11)。这表明所研究的蒽环类从微球上洗脱时具有相同的洗脱形式。

[0173] 实施例15：蒽环类对微球大小的影响

[0174] 使用实施例13所述的微球，用CCD照相机和显微镜所拍摄的微球图像确定大小分布，然后用Image Pro Plus 4.05辨别其直径。将加载了不同蒽环类的微球转移到小细胞培养瓶中，每张图像拍摄50-1500个微球。Image Pro Plus 4.05根据大小范围辨别100-1500个微球的直径。将直径列表并转换成大小范围对出现频率的柱形图，将其标准化并用Excel做图(图12)。这表明蒽环类对微球大小具有相同的影响。

[0175] 实施例16：其他市售微球的载药

[0176] 按照前面实施例中概述的步骤，将阿霉素加载到本发明的微球和另一种市售栓塞微球(Embosphere，包覆有胶原包衣的三丙烯酰微球)中，并对其进行比较。显然，由图15可见，本发明的微球具有吸收药物的能力，而标准的市售产品则没有。

[0177] 实施例17：载药-物理效应

[0178] 通过测定药物加载和洗脱后的大小和压缩及阿霉素载药微球的释放能力，评估阿霉素的加载和洗脱对高AMPS微球的影响。当药物有效地从水合微球上取代水时，药物的加载使整体大小范围少许下降(图14)，这同时伴随着可压缩性的少许下降。洗脱后观察到大小和可压缩性都未受到持久的影响(如通过用Instron拉伸试验仪测定杨氏模量所确定的)。微球通过标准导管释放的能力在载药过程中保持不变。

[0179] 实施例18：洗脱-微球大小的影响

[0180] 用70mg/ml阿霉素溶液加载本发明的各种大小的微球。然后将微球放入500ml磷酸盐缓冲液中，紫外测定释放量。体外洗脱图显示高至40％加载的阿霉素在洗脱的最初2小时以突释的形式释放，然后剩余的药物在至少12天时间内洗脱。所有大小范围的释放均具有相似的特征，相差在±5％以内(图15)。

[0181] 实施例19：洗脱-介质的影响

[0182] 将本发明的载有25mg/ml阿霉素的微球放置于不同的介质中并在60分钟内监测洗脱。在血浆和PBS中显示在最初的60分钟内释放缓慢。水中的释放低于紫外检测限。这说明药物的释放取决于离子的存在，因为这样才能从带有阴离子电荷的聚合物基质上置换出离子键结合的药物(图16)。

[0183] 实施例20：阿霉素的稳定性

[0184] 测定加载和释放过程对药物稳定性的影响。测定了阿霉素溶液在不同条件下保存时的稳定性。用USP方法通过HPLC跟踪本发明的微球中阿霉素的加载和释放，以确定阿霉素是否受到该过程的影响。产生的色谱图均在相似的保留时间出现单峰，显示微球加载和释放的过程对阿霉素没有任何不利的影响。

[0185] 实施例21：阿霉素加载的微球-材料相容性

[0186] 本发明的微球用25mg/ml阿霉素加载。然后将微球悬浮于造影剂和盐水中，然后在释放导管(ProgreatTM，Terumo)和注射器(Merit)中放置24小时。在不同的时间点，测定阿霉素和各组分的稳定性(阿霉素用紫外/HPLC法，组分用肉眼观察/SEM法)。在室温下24小时内未观察到组分或药物的降解。

[0187] 实施例22：预载产品-加载剂量

[0188] 在本发明微球的大小范围内制备系列剂量为5、10、20、45mg/ml的样品。每个样品的载药量由紫外检测法测定。25个独立试验的数据列于下表：

[0189] 表1：加载溶液紫外检测测得的实际剂量

[0190]

[0191] 测得的剂量范围是：

[0192] 45mg/ml：44.37-45.77mg/ml(3.11％范围)

[0193] 20mg/ml：21.11-21.32mg/ml(1.05％范围)

[0194] 10mg/ml：9.93-9.98mg/ml(0.5％范围)

[0195] 5mg/ml：4.98-5.14mg/ml(3.2％范围)

[0196] 这些数据表明，在不同试验之间几乎没有差异，可以达到精确而准确的载药量。

[0197] 实施例23：预载产品-冻干失重

[0198] 对本发明中的阿霉素加载的微球用一种专用循环进行冻干。所有大小范围的微球以25个独立试验测定剂量为5、10、20、45mg/ml时的失重百分数(以载药微球的百分数表示，表2)。得到了一致的失重量，表明冻干前载药微球的任何重量变化对冻干后的产品都没有影响。图17的数据显示冻干时由于失水总是导致大于82％的失重。

[0199] 表2：阿霉素载药微球在冻干时的失重

[0200]

[0201] 实施例24：预载产品-残留水分

[0202] 制备用5、10、20、45mg/ml的阿霉素加载的所有大小范围的本发明微球，冻干，然后用伽马射线灭菌。然后用重量法测定样品中残留的水分，包括在70℃加热微球至达到恒重。测得所有样品中残留的水分少于5％。

[0203] 表3

[0204]

[0205] 实施例25：预载产品-重新水合后释放

[0206] 制备用5、20、45mg/ml的阿霉素加载的所有大小范围的本发明微球，冻干，然后用伽马射线处理。然后使样品在水中重新水合，紫外跟踪药物在PBS中的释放100小时(图18)。

[0207] 实施例26：重新水合的阿霉素载药微球的大小

[0208] 制备用20mg/ml阿霉素加载的本发明微球(300-500μm)，冻干，然后对部分样品进行伽马射线处理。样品在水中重新水合，然后用校准的图像分析仪(Image Pro-Plus，图19)测定大小。

[0209] 未载药的样品也同样进行处理和测定大小。图20的数据显示进行不同的处理后大小略有变化，但是均未使产品超出250-500μm的合格范围。

[0210] 实施例27：兔肝癌模型(Vx-2)中经导管动脉化学栓塞后阿霉素从阿霉素载药微球中持续释放

[0211] 本研究的目的是为了评估在兔肝癌模型中通过经导管动脉化学栓塞(TACE)释放的本发明的阿霉素载药微球的性能。该研究在美国巴尔的摩的约翰·霍普金斯医院(The John Hopkins Hospital)进行。

[0212] 27.1材料与方法

[0213] 将动物分成6组(第1、2、3、4、5、6组)，每组5只(实验动物4只，对照动物1只)。所有组的对照动物都动脉内注射阿霉素(与实验动物浓度相同)，而实验动物按照经修改的化学栓塞方案用含有阿霉素的药物洗脱微球处理。不同组的动物在以下时间点处死：

[0214] 第1组：化学栓塞操作后1小时

[0215] 第2组：化学栓塞操作后12小时

[0216] 第3组：化学栓塞操作后24小时

[0217] 第4组：化学栓塞操作后3天

[0218] 第5组：化学栓塞操作后7天

[0219] 第6组：化学栓塞操作后14天

[0220] 27.2动物的准备

[0221] 将VX2肿瘤细胞系注射到载体兔(新西兰白兔)的后腿并培养14天。从每一只载体兔体内收集产生的肿瘤，并通过对每只兔解剖活体肿瘤组织、无菌切碎和通过不锈钢筛，从每只兔来制备肿瘤浆。兔子预先肌内给予乙酰丙嗪(1mg/kg)和盐酸氯胺酮(20mg/kg)的混合物将兔预麻醉。大约15分钟后，经耳缘静脉做静脉入口，并静脉给予动物硫喷妥钠(40mg/kg)，以在手术过程中保持麻醉状态。刮去腹部的毛，用联苯胺备皮并做一个中线切口。通过中间正中剖腹暴露每只兔的肝脏，然后用21G静脉血管穿刺针(angiocath)直接注射一份肿瘤浆液(0.2ml)至暴露的肝脏的左叶以形成周围有足够肝实质的唯一的孤立损伤。每两只实验兔用一份肿瘤浆。使肿瘤在兔肝中生长14天，使其达到根据以前的实验所预期的直径在2.5-3.5cm范围的大小。用电灼烧控制出血。然后将腹部用连续缝线缝合关闭，皮肤用缝线缝合并用绷带包扎。整个操作中均采用适当的无菌技术。手术后，将动物放入笼子中，用毛毯保暖并进行呼气末CO2浓度监测，直至动物从麻醉中苏醒。如果动物明显出现疼痛或身体上的痛苦，皮下给予0.02-0.05mg/kg止痛剂似普罗啡，每12小时一次，连续3天。

[0222] 27.3阿霉素洗脱微球的制备：

[0223] 按实施例22制备本发明的大小范围在100-300微米并用45mg/ml阿霉素加载的微球，按实施例23冻干并用伽马射线灭菌。在临使用前将微球用1ml无菌水水合，并加入2ml欧乃派克和1ml盐水。溶液在要注射前至少10分钟准备好，每只兔动脉注射总溶液中的1ml(如下所述)。

[0224] 27.4化学栓塞操作：

[0225] 肿瘤移植入兔肝脏两周后，将动物取回做“化学栓塞”。按上述进行预麻醉、做静脉入口、用硫喷妥钠麻醉。做进入股总动脉的入口，然后将一个导管插入肝总动脉。注射造影剂证实肿瘤所在的位置后，插入一个2F JB1导管使其尽可能接近肿瘤。如果需要，用Transsend导丝将导管引导至靶动脉。一旦导管被适当定位，立即如上所述将阿霉素洗脱微球注射到肿瘤床内。对照组只注射相同浓度的阿霉素，而不进行栓塞操作。完成“化学栓塞”后，移出导管，动脉用可被重吸收的缝合材料结扎来止血。整个操作及后续操作中均采用适当的无菌技术。尽所有可能尽量减小不适和痛苦，包括限制肿瘤移植的手术切口，皮下注射似普罗啡以尽量减轻疼痛，在需要评估动物的身体状况及疼痛和不适水平时随时临床呼叫。然后将动物放回笼子。所有动物依照上述时间点处死。

[0226] 按照兽医管理规则处死动物。各组中的所有动物在处理后按照其时间点在通过静脉注射100mg/kg戊硫代巴比妥IV所致的深度麻醉状态下处死。

[0227] 27.5病理学和组织学评价

[0228] 剖出兔的肝脏，小心摘除并放置在装有5％甲醛的容器中。将肝脏以5mm的间距切片以用于肉眼检查。每一个切片都用石蜡完全包埋，然后切成4μ厚的切片并用苏木精和伊红染色处理。通过肉眼观察估计肿瘤存活率，并以每张切片上活肿瘤面积的百分率表示。用HPLC测定肿瘤中和无肿瘤肝组织中阿霉素的浓度。

[0229] 27.6采集血液以进行阿霉素分析

[0230] 通过在耳中插入动脉导管，从注射药物洗脱微球时开始，分别在20分、40分、60分、120分和180分时采集3ml全血，然后转移到肝素化真空采血试管中，并在室温下2000g离心
10分钟。分离出血浆并将其移到标记的聚丙烯带盖管中。使其在甲醇/冰中迅速冻结，于-20℃保存以供进行分析。

[0231] 27.7对组织进行处理以确定肿瘤中和无肿瘤肝组织中阿霉素的浓度

[0232] 切下肿瘤和无肿瘤肝组织(约100mg)并除去上面的表皮和死细胞。使用预先称重的试管准确称量组织的重量并记录，然后立即将其放到干冰上，而后于-80℃保存以供进行分析。

[0233] 27.8结果：

[0234] 药物分布总结：

[0235] 1.阿霉素在肿瘤中的浓度在治疗后7天达到最高，其次是3天组(图20)。

[0236] 2.阿霉素在肿瘤中的浓度甚至在14天组中仍然很高，表明阿霉素是从微球中连续洗脱的(图20)。

[0237] 3.所有时间点阿霉素及其降解产物阿霉素醇(doxorubicinol)在血浆中的浓度很低。这在给药后20分钟特别显著，而且阿霉素在血浆中的浓度在20-180分钟几乎以线性持续下降。当动脉注射无微球的阿霉素时，血浆中阿霉素的浓度高10-17倍(图21)。

[0238] 组织学观察：

[0239] 1.在7-14天肿瘤坏死最大(图22)。

[0240] 2.注意1小时组和12小时组可视为对照组，因为化学治疗剂还未开始杀灭细胞。

[0241] 3.最后，在3天和7天组中分别有50％和37％的肿瘤细胞既不是完全死亡也不是完全存活。这些细胞可能“受损”，甚至可能凋亡。

[0242] 4.关于微球的分布，和预期的一样，对照动物中均未发现任何微球。在实验动物中，发现所有的微球都保留在具有预期的血管直径即100-300微米的小动脉中。没有任何微球逃离血管内空间。

[0243] 5.在14天组中，肿瘤植入位置即肝组织左侧似乎大部分已坏死。坏死的肿瘤和正常细胞的差别很难确定。因此，我们可以推测药物洗脱微球的效力在14天后已达到最大。这些结果是一致的。

[0244] 6.组织学分析也证实了药物洗脱微球杀灭肿瘤细胞的效力。我们从前面的多组实验了解到，动脉内注射阿霉素或卡铂(浓度相同)仅导致30％的肿瘤坏死，这与未治疗(即对照)动物大致相等。相反，用药物洗脱微球对兔进行治疗导致50-100％的坏死，坏死在14天最为完全，显著高于单独动脉内注射(图22)。

[0245] 实施例28：临床试验

[0246] 用根据实施例9制备的微球浆进行临床试验，以评价其在用于对不能切除的肝细胞肿瘤(HCC)患者进行治疗的安全性、药物动力学形式和效力。适合本研究的患者年龄在18-75岁，患有不宜进行根除治疗如切除术、肝移植、经皮治疗的HCC，具有良好的肝功能(Child-Pugh A型)，没有任何肝失代偿。排除以下患者：

[0247] a)以前曾经用任何抗癌疗法治疗HCC的患者；

[0248] b)患有另一种原发性肿瘤的患者；

[0249] c)患有重度肝脏疾病的患者：Child-Pugh B-C型或活动性胃肠出血、脑病或腹水。胆红素水平＞3mg/dL；

[0250] d)患有癌性疾病的患者：C型BCLC(血管侵袭，包括节段性门静脉阻塞；肝外扩散或癌症相关症状＝PST为1-4)或D型BCLC(WHO体能状况3或4，Okuda III期)；

[0251] e)患有任何肝脏栓塞手术禁忌症的患者：门体分流、离肝血流、凝血实验异常(血小板计数＜50.000/mm3或凝血酶原活性＜50％)、肾衰、严重动脉粥样硬化；

[0252] f)患有阿霉素给药禁忌症的患者(血清胆红素≥5mg/dL，白细胞计数≤3.000细胞/mm3，心脏射血分数＜50％)。

[0253] 化学栓塞在0时和第2月进行。治疗将由于任何排除标准的形成或由患者决定而中止。通过注射在临给药前与造影剂混合的阿霉素载药微球进行栓塞，直至达到流动停滞。PVA微球的直径由外科医师来选择，其大小可能为500μm左右。不使用抗生素预防。

[0254] 为了分析阿霉素微球的药物代谢动力学形式，对胆红素水平＜1.5mg/dL的患者，以以下剂量开始给予按比例增大的剂量：每次治疗25mg/m2(2个患者)、50mg/m2(2个患者)、75mg/m2(2个患者)、100mg/m2(2个患者)。对胆红素水平在1.5-3mg/dL的患者以以下剂量开始：25mg/m2(2个患者)、50mg/m2(2个患者)、75mg/m2(2个患者)、100mg/m2(2个患者)。如果在某个剂量水平没有观察到任何剂量限制性毒性，则在下一组按比例增加剂量，单次治疗中阿霉素的最大总剂量是150mg。

[0255] 药物代谢动力学评价：在操作之后的1小时、6小时、24小时、48小时和7天，在患者住院期间或在门诊部，从外周血中采集样本进行阿霉素水平分析。

[0256] 安全性：在6个月的整个研究过程中记录并分析与治疗相关的并发症。在第0月和第2月的住院期(4天)记录不良反应事件。在第7天、第14天和第1、3和6月，在门诊部对患者进行回访，对其进行临床检查并测定实验室参数。开始治疗后所有回访中都会发现不良反应事件，其中包括骨髓抑制和其他与阿霉素相关的毒性的出现、肝功能衰竭、肾功能衰竭、感染(胆囊炎、肝肿大、自发性细菌性腹膜炎、菌血症、缺血性肝炎或胆道狭窄)、胃肠道出血。

[0257] 疗效：在第3和6月通过造影剂强化的螺旋断层摄影术评价客观反应。其幅度根据欧洲肝脏研究协会统一标准定义：完全反应：无癌性疾病迹象；部分反应：肿瘤总量下降＞50％；无变化：下降＜50％或增加＜25％；进行性疾病：增加＞25％。因此，客观反应反映了完全反应和部分反应。