利用生产谷氨酸的菌渣分离胞壁酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用生产谷氨酸的菌渣剥离胞壁酸的方法，步骤如下：(1)取谷氨酸湿菌渣，向菌渣中加入水进行超声提取，过滤，得滤液；(2)滤液浓缩，向浓缩后的滤液中加入8‑12倍体积(ml/ml)的乙醇溶液，搅拌提取，过滤，得白色粉末；(3)向白色粉末中加水混匀，再加入盐酸溶液在15‑30℃条件下水解3‑5小时；(4)向水解液中加入乙醚，分液，溶液分为三层，分离取上层和中层液体，浓缩至干，即得胞壁酸粉末。采用本发明的方法制备胞壁酸，所需的试剂的种类少，数量小，降低了制备成本，减小了对环境的污染；而且无需脱色、柱层析分离等步骤，简化了制备步骤；胞壁酸的提取率高。

权利要求

1.一种利用生产谷氨酸的菌渣分离胞壁酸的方法，其特征在于，步骤如下：(1)取谷氨酸湿菌渣，向菌渣中加入水进行超声提取，过滤，得滤液；

(2)滤液浓缩，向浓缩后的滤液中加入8-12倍体积的乙醇溶液，搅拌提取，过滤，得白色粉末；

(3)向白色粉末中加水混匀，再加入盐酸溶液在15-30℃条件下水解3-5小时；

(4)向水解液中加入乙醚，分液，溶液分为三层，分离取上层和中层液体，浓缩至干，即得胞壁酸粉末。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述谷氨酸湿菌渣的含水量为

40-60％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，超声提取的条件为：20kHz、超声功率700～900W、超声2秒间隙2秒，超声4-6次，每次0.5-1h。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，水的加入量为谷氨酸菌渣干重的

8-12倍体积。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将滤液浓缩至谷氨酸菌渣干重的

45-55％。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将滤液浓缩至谷氨酸菌渣干重的50％。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乙醇溶液的体积百分数为

90-100％。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，搅拌提取的时间为0.5-1小时。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，白色粉末加水混匀后的质量为谷氨酸菌渣干重的45-55％，

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，白色粉末加水混匀后的质量为谷氨酸菌渣干重的50％。

11.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，盐酸溶液的体积分数为50％。

12.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，乙醚的加入量与水解液的体积比为1：1。

说明书

利用生产谷氨酸的菌渣分离胞壁酸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用生产谷氨酸的菌渣分离胞壁酸的方法，属食品和化工领域。

背景技术

[0002] 胞壁酸是细菌细胞壁粘肽结构的重要组成部分，是原核微生物细胞的生物标志化合物。胞壁酸最常用的用处是作为推测不同环境中微生物总量的标记物；另外，胞壁酸在凝集素、潜在细菌酶抑制剂，以及抗肿瘤作用中有很大研究应用前景。

[0003] 目前，市场上的胞壁酸价格昂贵，市场需求潜力大。对于胞壁酸的制备，可以通过化学合成的方法制备，但化学合成的成本昂贵，容易造成环境的污染。因此有必要开发新的胞壁酸的剥离方法。

[0004] 谷氨酸菌渣是味精工业的主要副产品，我国每年生产的谷氨酸菌渣达百万吨，对于谷氨酸菌渣的再利用，目前多作为饲料和肥料使用，所产生的利用价值相对较低。

[0005] 蒋新英等对利用生产谷氨酸的菌渣制备胞壁酸进行了研究，在胞壁酸的制备和检测方法上取得了较大进步，但其提取胞壁酸的步骤包括：洗涤、搅拌裂解、除脂、酸解、萃取、脱色、浓缩提取、HPTLC检测、柱层析分离和纯度检测，整个提取过程步骤多，耗费大量的有机试剂，如氯仿、三氯乙酸等，不仅增加了提取的经济成本，若排放这些试剂还会污染环境。蒋新英等进一步对胞壁酸的提取工艺进行了改进，改进后的提取工艺包括适合工厂大规模提取和适合小批量胞壁酸的生产两种提取工艺。其中，适合工厂大规模提取的工艺流程为：
酸解、脱色、甲醇/乙醇提取、HPTLC检测、柱层析分离和纯度检测；但该工艺流程是将生产谷氨酸的菌渣直接进行酸解，若进行工业生产，所需加入的酸液的量太大，生产成本仍较高。
适合小批量胞壁酸提取的工艺流程为：超声波裂解、离心、酸解、脱色、甲醇/乙醇提取、HPTLC检测、柱层析分离和纯度检测；但该工艺直接将生产谷氨酸的菌渣采用超声波法裂解，会产生脂类等杂质，需通过脱色、柱层析分离等操作进行纯化，制备步骤仍比较繁琐。

发明内容

[0006] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种利用生产谷氨酸的菌渣制备胞壁酸的方法。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

[0008] 一种利用生产谷氨酸的菌渣分离胞壁酸的方法，步骤如下：

[0009] (1)取谷氨酸湿菌渣，向菌渣中加入水进行超声提取，过滤，得滤液；

[0010] (2)滤液浓缩，向浓缩后的滤液中加入8-12倍体积(ml/ml)的乙醇溶液，搅拌提取，过滤，得白色粉末；

[0011] (3)向白色粉末中加水混匀，再加入盐酸溶液在15-30℃条件下水解3-5小时；

[0012] (4)向水解液中加入乙醚，分液，溶液分为三层，分离取上层和中层液体，浓缩至干，即得胞壁酸粉末。

[0013] 步骤(1)中，所述谷氨酸湿菌渣的含水量为40-60％(质量百分数)。

[0014] 步骤(1)中，超声提取的条件为：20kHz、超声功率700～900W、超声2秒间隙2秒，超声4-6次，每次0.5-1h。超声提取的目的是进行破壁处理；超声提取的功率、提取次数和超声时间是影响破壁处理效果的主要因素，本发明通过对超声工艺条件的优化，使其在保证较好破壁效果的前提下，又降低了能耗。

[0015] 步骤(1)中，水的加入量为谷氨酸菌渣干重的8-12倍体积(g/ml)(即每克干菌渣中加入水8-12ml)。

[0016] 步骤(2)中，将滤液浓缩至谷氨酸菌渣干重的45-55％，优选为50％。

[0017] 步骤(2)中，所述乙醇溶液的体积百分数为90-100％。采用乙醇溶液对其提取的目的是除脂。

[0018] 步骤(2)中，搅拌提取的时间为0.5-1小时。

[0019] 步骤(3)中，白色粉末加水混匀后的质量为谷氨酸菌渣干重的45-55％，优选为50％。

[0020] 步骤(3)中，盐酸溶液的体积分数为50％(v/v，即浓盐酸与水按1：1配比)。

[0021] 步骤(4)中，乙醚的加入量与水解液的体积比为1：1。本发明首次发现利用乙醚对酸水解后的水解液进行分液处理，可以将目标物胞壁酸与其他物质分离开来，极大的简化了胞壁酸的分离纯化步骤。

[0022] 采用薄层层析扫描检测的方法对本发明制备的胞壁酸进行检测，将制备的胞壁酸结晶0.3毫克溶解于1毫升甲醇溶液中作为样品液。配制胞壁酸的标准液分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6毫克/毫升。将样品液(1μl/点)和标准液(1μl/点)点在同一块GF254高效薄层硅胶板(10cm*10cm)上，展开剂为甲醇-丙酮-乙酸-水-异丙醇(5：3：1：1：1，体积/体积)混合液。在室温下饱和25分钟后开始展开，展程8厘米，将硅胶板取出晾干。用质量浓度为
1％茚三酮乙醇溶液喷板染色，板放在110度烤5分钟。样品液点和标准品液点均染成红色，Rf值为0.84，用CAMAG3薄层扫描仪在492nm扫描。用该仪器的WINCATS1.4.1软件统计峰面积积分值、据标准液质量的回归方程计算。检测和计算得胞壁酸的含量。

[0023] 本发明的有益效果：

[0024] (1)采用本发明的方法制备胞壁酸，所需的试剂的种类少，数量小，降低了制备成本，减小了对环境的污染；而且无需脱色、柱层析分离等步骤，简化了制备步骤；胞壁酸的提取率高，采用本发明方法提取得到的胞壁酸为谷氨酸干菌渣质量的1.2％以上，而且制备的胞壁酸的纯度高。

[0025] (2)本发明的利用生产谷氨酸的菌渣制备胞壁酸的方法，首先对谷氨酸的菌渣进行超声破壁处理，破壁处理后先将滤液浓缩，再加入乙醇溶液进行除脂处理，除脂后过滤得到的白色粉末再加酸进行酸解，大大减少了酸解过程酸液的用量，酸解后利用乙醚对水解液进行分液处理，可以将目标物胞壁酸与其他物质分离开来，极大的简化了胞壁酸的分离纯化步骤。上述各工艺步骤是一个有机的整体，互为条件，有效简化了从生产谷氨酸的菌渣中制备胞壁酸的工艺流程，并且提高了胞壁酸的提取率。

具体实施方式

[0026] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述实施例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

[0027] 实施例1：利用生产谷氨酸的菌渣分离胞壁酸

[0028] 具体步骤如下：

[0029] (1)生产谷氨酸的湿菌渣120g(菌渣干重为48g)。加水搅拌分散好后使总体积为500ml。在20kHz，700w、超声2秒间隙2秒条件下超声0.5h，过滤得滤液。滤渣再加水重复以上过程4次，共超声过滤5次，合并5次滤液共约1000ml。

[0030] (2)将合并的滤液真空浓缩至20ml，加95％乙醇200ml搅拌提取0.5h，静止，分离出上清。剩余部分再加200ml 95％乙醇搅拌提取0.5h，过滤得5g白色干粉。

[0031] (3)向5g白色干粉中加水，混匀使总体积为20ml，再向其中加入20ml 50％(体积分数，v/v)HCl，磁力搅拌下常温水解4h。

[0032] (4)向水解液中加入40ml乙醚。倒入分液漏斗中，摇匀，静置分为三层，上层透明微黄，中层为白色粘液，下层棕红色。经鉴定上层和中层为胞壁酸，分离取出上层和中层液体，经真空旋转蒸发至干，得白色胞壁酸粉末0.62g。

[0033] 采用薄层层析扫描检测的方法对本实施例制备的胞壁酸进行检测，将制备的胞壁酸结晶0.3毫克溶解于1毫升甲醇溶液中作为样品液。配制胞壁酸的标准液分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6毫克/毫升。将样品液(1μl/点)和标准液(1μl/点)点在同一块GF254高效薄层硅胶板(10cm*10cm)上，展开剂为甲醇-丙酮-乙酸-水-异丙醇(5：3：1：1：1，体积/体积)混合液。在室温下饱和25分钟后开始展开，展程8厘米，将硅胶板取出晾干。用质量浓度为
1％茚三酮乙醇溶液喷板染色，板放在110度烤5分钟。样品液点和标准品液点均染成红色，Rf值为0.84，说明本实施例制备的白色粉末即为胞壁酸。

[0034] 用CAMAG3薄层扫描仪在492nm扫描。用该仪器的WINCATS1.4.1软件统计峰面积积分值、据标准液质量的回归方程计算。检测和计算得胞壁酸的含量。经计算，本实施例制备的胞壁酸的纯度为98.2％，所得胞壁酸为干菌渣重得1.27％。

[0035] 实施例2：利用生产谷氨酸的菌渣分离胞壁酸

[0036] 具体步骤如下：

[0037] (1)取生产谷氨酸的湿菌渣150g(菌渣干重为60g)，加水搅拌分散好后使总体积为600ml，在20kHz、900w、超声2秒间隙2秒条件下超声0.5h，过滤得滤液。滤渣再加水重复以上过程4次，共超声过滤5次，合并滤液共1200ml。

[0038] (2)将合并的滤液真空浓缩至30ml，加无水乙醇300ml，搅拌提取0.5h，静置，倒出上清，剩余部分再加300ml乙醇搅拌提取0.5h，过滤得5.5g白色干粉。

[0039] (3)向白色干粉中加水，混匀使总体积为30ml，再向其中加入30ml 50％(体积分数，v/v)HCl，磁力搅拌下常温水解4h。

[0040] (4)向水解液中加入60ml乙醚，倒入分液漏斗中，摇匀，静置分三层，分离取出上层和中层液体。经真空旋转蒸发至干，得白色胞壁酸粉末0.74g。

[0041] 采用薄层层析扫描检测的方法对本实施例制备的胞壁酸进行检测，结果表明本实施例制备的胞壁酸的纯度为97.4％，所得胞壁酸为干菌渣重的1.20％。

[0042] 实施例3：利用生产谷氨酸的菌渣分离胞壁酸

[0043] 将超声所用功率调整为800w，其余操作同实施例1，得白色胞壁酸粉末0.65g。

[0044] 采用薄层层析扫描检测的方法对本实施例制备的胞壁酸进行检测，结果表明本实施例制备的胞壁酸的纯度为97.8％，所得胞壁酸为干菌渣重的1.32％。

[0045] 对比例1：

[0046] 将超声所用功率调整为450w，其余操作同实施例1，制备得到的胞壁酸粉末，称重。所得胞壁酸为0.53g。

[0047] 采用薄层层析扫描检测的方法对本实施例制备的胞壁酸进行检测，结果表明本实施例制备的胞壁酸的纯度为96.8％，所得胞壁酸为干菌渣重的1.07％。

[0048] 对比例2：

[0049] 将实施例1步骤(4)中的乙醚替换为二氯甲烷，其余操作同实施例1，经薄层层析检测，未分离得到胞壁酸。

[0050] 对比例3：

[0051] 将实施例1步骤(4)中的乙醚替换为甲苯，其余操作同实施例1，经薄层层析检测，未分离得到胞壁酸。

[0052] 对比例4：

[0053] 采用专利CN103954726A中实施例2的方法进行胞壁酸的提取，取新鲜谷氨酸棒状杆菌菌渣120克(含水量为60％，菌渣干重48克)，按实施例2的方法进行胞壁酸的提取和检测(反应试剂的量按相应的质量比进行倍增)，经检测和计算，所提取得到的胞壁酸为谷氨酸棒状杆菌菌渣干重的1.09％。

[0054] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。