本发明涉及一种优化的猪去氧胆酸结晶工艺方法，该工艺以低含量的猪去氧胆酸粗品为原料，加入酯类溶液萃取，浓缩，加入有机酸，静置析晶，过滤，即得高纯度的猪去氧胆酸。本发明在重结晶的过程中加入有机酸，不仅抑制酯类溶液的分解，而且将溶液体系的酸度调低，更有利于属于弱酸的猪去氧胆酸析晶，相比于不加有机酸的结晶工艺，猪去氧胆酸收率可以至少提高10％以上，转移率至少提高15％以上。
1.一种优化的猪去氧胆酸结晶工艺方法，它主要包括下列步骤：
a）猪去氧胆酸粗品，加入酯类溶液和无机酸溶液，保温搅拌；
b）待猪去氧胆酸粗品完全溶解后，保温静置，然后弃去下层液体，收集酯类溶液；
c）将步骤b）所述酯类溶液浓缩，加入有机酸溶液，静置、析晶，过滤，即得猪去氧胆酸晶体，其中所述浓缩是将酯类溶液浓缩至原体积的3/8～3/4，所述有机酸为乙酸，所述有机酸溶液的浓度为40%～100%。
2.根据权利要求1所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤c)所述有机酸溶液的浓度优选70%～80%。
3.根据权利要求1所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤a）所述猪去氧胆酸粗品中的猪去氧胆酸的含量范围为40%～80%，所述猪去氧胆酸可以是猪去氧胆酸与金属离子结合形成的盐，也可以是游离的酸。
4.根据权利要求3所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于所述猪去氧胆酸与金属离子结合形成的盐选自猪去氧胆酸钠盐、猪去氧胆酸钙盐、猪去氧胆酸镁盐。
5.根据权利要求1-4任一所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤a）中所述酯类溶液选自乙酸类酯。
6.根据权利要求5所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤a）中所述酯类溶液选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯中任意一种或它们任意的混合物。
7.根据权利要求6所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤a）中所述酯类溶液为乙酸乙酯。
8.根据权利要求1-4任一所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤a）中所述的酯类溶液的加入体积为猪去氧胆酸粗品折纯后重量的4～12倍，其中所述的体积单位为“毫升”、重量单位为“克”。
9.根据权利要求8所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤a）中所述的酯类溶液的加入体积为猪去氧胆酸粗品折纯后重量的8～9倍，其中所述的体积单位为“毫升”、重量单位为“克”。
10.根据权利要求1-4任一所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤a）中所述无机酸为稀硫酸或盐酸，加入体积为猪去氧胆酸粗品折纯后重量的1～4倍，其中所述的体积单位为“毫升”、重量单位为“克”。
11.根据权利要求10所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤a）中所述无机酸为稀硫酸或盐酸，加入体积为猪去氧胆酸粗品折纯后重量的2倍，其中所述的体积单位为“毫升”、重量单位为“克”。
12.根据权利要求1-4任一所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤a）和b）中所述保温温度为50～90℃。
13.根据权利要求12所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤a）和b）中所述保温温度为优选60～70℃。
14.根据权利要求1-4任一所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤c）中所述浓缩是将酯类溶液浓缩至原体积的1/2。
15.根据权利要求1-4任一所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤c）中所述有机酸加入的体积为猪去氧胆酸粗品折纯后重量的0.5～2倍，其中所述的体积单位为“毫升”、重量单位为“克”。
16.根据权利要求15所述的猪去氧胆酸结晶工艺方法，其特征在于：步骤c）中所述有机酸加入的体积为猪去氧胆酸粗品折纯后重量的1倍，其中所述的体积单位为“毫升”、重量单位为“克”。
一种优化的猪去氧胆酸结晶工艺方法
技术领域
[0001] 本发明涉及采用结晶工艺精制猪去氧胆酸的方法，属于生物医药领域。
背景技术
[0002] 猪去氧胆酸(3α,6α-二羟基胆烷酸，HDCA)由猪胆汁经提取、加工制成，具有降血脂、镇痉、袪痰作用，临床上用于治疗高血脂症、动脉粥样硬化症、气管炎、小儿病毒性上呼吸道炎症，以及由肝胆疾病引起的消化不良；不仅用于制备人工牛黄，而且也是清开灵注射液中的有效成分，经临床研究证明对急性白血病有显著疗效，体外实验证明可以诱导细胞凋亡、抑止细胞的增殖。
[0003] 目前有很多关于猪去氧胆酸结晶的方法：中国专利公开号CN102617689A(公开日2012-08-01)将HDCA粗品用氨水溶解过滤去除不溶性杂质，乙酸乙酯除去脂溶性物质，酸化，析晶，过滤，水洗，干燥，得HDCA纯品(纯度≥99.8％，熔点＞197.5℃)；CN102775459A(公开日2012-11-14)将HDCA粗品经甲酯化、柱层析分离、碱水解后，加入无水乙醇或乙酸中，在机械搅拌条件下加热至有机溶剂水溶液完全沸腾，待HDCA溶解后，分次加入水，继续搅拌，待温度降至10～20℃，再机械搅拌30～60min，进行抽滤，得晶体，真空干燥，得HDCA纯品(纯度＞99％)。上述两种方法均需要将HDCA进行化学预处理，工艺步骤繁琐、不易操作、生产周期长。
[0004] CN105175472A(公开日2015-12-23)取粗品猪去氧胆酸，加5～8倍量的水、加氢氧化钠调pH 8.5～10.5，加热至完全溶解，再加0.5％～1.0％的澄清剂，80～90℃保温反应2～4h，降至常温，过滤，向滤液加入5％～10％的稀盐酸进行酸化，过滤，收集滤饼，向滤饼中加入乙酸乙酯，加热回流，过滤，浓缩，降温结晶，离心得精品猪去氧胆酸(纯度95％-99％，熔点198～202℃)。该方法不仅需要将粗品进行前期除杂，延长了生产周期，而且要求粗品纯度不低于70％，限制了粗品的来源。
[0005] 针对目前的猪去氧胆酸结晶工艺中存在的问题，有必要进一步开发一种工艺简单，适用范围广，生产成本低，操作简单的方法。
发明内容
[0006] 本发明的目的是为了解决上述猪去氧胆酸结晶工艺中的不足，提供一种不限制粗品来源与含量，在重结晶的过程中向酯类溶液中加入有机酸溶液，并依据粗品含量确定有机酸的加入量，最终使猪去氧胆酸以高纯度晶体形式从酯类溶液中析出的方法。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取的技术方案如下：一种优化的猪去氧胆酸结晶工艺方法，它主要包括下列步骤：
[0008] a)猪去氧胆酸粗品，加入酯类溶液和无机酸溶液，保温搅拌；
[0009] b)待猪去氧胆酸粗品完全溶解后，保温静置，然后弃去下层液体，收集酯类溶液；
[0010] c)将步骤b)所述酯类溶液浓缩，加入有机酸溶液，静置、析晶，过滤，即得猪去氧胆酸晶体。
[0011] 在一些实施方案中，步骤a)中猪去氧胆酸粗品中的猪去氧胆酸的含量范围为40％～80％，所述猪去氧胆酸可以是猪去氧胆酸与金属离子结合形成的盐，也可以是游离的酸。另外，在一些实施方案中，猪去氧胆酸与金属离子结合形成的盐选自猪去氧胆酸钠盐、猪去氧胆酸钙盐、猪去氧胆酸镁盐。
[0012] 在一些实施方案中，步骤a)中所述酯类溶液选自乙酸类酯，优选乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯中任意一种或它们任意的混合物，优选乙酸乙酯。
[0013] 在一些实施方案中，步骤a)所述的酯类溶液的加入体积为猪去氧胆酸粗品折纯后重量的4～12倍，更优选8～9倍，其中所述的体积单位为“毫升”、重量单位为“克”，或者体积单位为“升”、重量单位为“千克”，以此类推。
[0014] 在一些实施方案中，步骤a)中所述无机酸为硫酸或盐酸，优选稀硫酸。其中，在一些实施方案中所述无机酸加入体积为猪去氧胆酸粗品折纯后重量的1～4倍，优选2倍，其中所述的体积单位为“毫升”、重量单位为“克”，或者体积单位为“升”、重量单位为“千克”，以此类推。
[0015] 在一些实施方案中，酯类溶液萃取猪去氧胆酸的过程中需要在一定温度的条件下进行，步骤a)和步骤b)保温温度范围控制在50～90℃，优选60～70℃。
[0016] 在一些实施方案中，步骤c)中所述浓缩是将步骤b)中酯类溶液浓缩至原体积的3/8～3/4，优选1/2。
[0017] 在一些实施方案中，步骤c)中所述有机酸为乙酸，所述有机酸溶液的浓度为40％～100％，优选70％～80％。
[0018] 在一些实施方案中，步骤c)中所述有机酸加入的体积为猪去氧胆酸粗品折纯后重量的0.5～2倍，优选1倍，其中所述的体积单位为“毫升”、重量单位为“克”，或者体积单位为“升”、重量单位为“千克”，以此类推。
[0019] 本发明有益效果为：
[0020] (1)本发明对猪去氧胆酸粗品的来源限制少，猪去氧胆酸粗品的含量最低可以为40％，可以为盐的形式，也可以是游离的酸。
[0021] (2)本发明通过加入有机酸，不仅抑制酯类溶液的分解，而且将溶液体系的酸度调低，更有利于属于弱酸的猪去氧胆酸析晶，相比于不加有机酸的结晶工艺，猪去氧胆酸收率可以至少提高10％以上，转移率至少提高15％以上。
[0022] (3)本发明的操作简单，原料来源广泛，有机溶剂用量少，对设备的要求相对较低、利于车间工人操作、产品的纯度高等特点，可以用于工业化的大规模生产。具体实施方案
[0023] 下述是结合具体实施例和实验例，进一步阐述本发明。但这些实施例和实验例仅限于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
[0024] 实施例1
[0025] 称取猪去氧胆酸镁盐100g，以猪去氧胆酸计含量55％，加入乙酸乙酯450ml，另加入50％稀硫酸溶液110ml，于60℃水浴中搅拌，直至无固体猪去氧胆酸镁盐存在，将下层液体弃去，收集上层液体并过滤，浓缩至200ml，加入55ml 80％的乙酸溶液，搅匀，静置析晶，过滤收集晶体，用适量乙酸乙酯洗涤，干燥，粉碎，得猪去氧胆酸精品31.64g，纯度95％，收率31.64％，转移率54.65％。
[0026] 其中，收率＝猪去氧胆酸精品重量/猪去氧胆酸粗品重量×100％；转移率＝(猪去氧胆酸精品重量×猪去氧胆酸精品含量)/(猪去氧胆酸粗品重量×猪去氧胆酸粗品含量)×100％，以下同。
[0027] 实施例2
[0028] 称取猪去氧胆酸粗品(游离的酸)200g，以猪去氧胆酸计含量73％，加入乙酸乙酯1200ml，另加入稀硫酸300ml，于60℃水浴中搅拌，直至无固体猪去氧胆酸粗品存在，将下层液体弃去，收集上层液体并过滤，浓缩至600ml，加入150ml 70％的乙酸溶液，搅匀，静置析晶，过滤收集晶体，用适量乙酸乙酯洗涤，干燥，粉碎，得猪去氧胆酸精品124.23g，纯度
96％，收率62.12％，转移率81.69％。
[0029] 实施例3
[0030] 称取猪去氧胆酸钙盐200g，以猪去氧胆酸计含量64％，加入乙酸乙酯1000ml，另加入稀硫酸260ml，于70℃水浴中搅拌，直至无固体猪去氧胆酸钙盐存在，将下层液体弃去，收集上层液体并过滤，浓缩至500ml，加入130ml 99％的乙酸溶液，搅匀，静置析晶，过滤收集晶体，用适量乙酸乙酯洗涤，干燥，粉碎，得猪去氧胆酸精品95.41g，纯度96％，收率47.70％，转移率71.55％。
[0031] 实施例4
[0032] 称取猪去氧胆酸镁盐200g，以猪去氧胆酸计含量57％，加入乙酸乙酯1000ml，另加入稀硫酸230ml，于70℃水浴中搅拌，直至无固体猪去氧胆酸镁盐存在，将下层液体弃去，收集上层液体并过滤，浓缩至500ml，加入120ml 80％的乙酸溶液，搅匀，静置析晶，过滤收集晶体，用适量乙酸乙酯洗涤，干燥，粉碎，得猪去氧胆酸精品65.32g，纯度96％，收率32.66％，转移率55.00％。
[0033] 实施例5
[0034] 称取猪去氧胆酸粗品(游离的酸)100g，以猪去氧胆酸计含量75％，加入乙酸丙酯600ml，另加入稀硫酸150ml，于65℃水浴中搅拌，直至无固体猪去氧胆酸粗品存在，将下层液体弃去，收集上层液体并过滤，浓缩至300ml，加入75ml 70％的乙酸溶液，搅匀，静置析晶，过滤收集晶体，用适量乙酸乙酯洗涤，干燥，粉碎，得猪去氧胆酸精品53.85g，纯度98％，收率53.85％，转移率70.36％。
[0035] 实施例6
[0036] 称取猪去氧胆酸镁盐100g，以猪去氧胆酸计含量40％，加入乙酸乙酯480ml，另加入浓盐酸溶液160ml，于50℃水浴中搅拌，直至无固体猪去氧胆酸镁盐存在，将下层液体弃去，收集上层液体并过滤，浓缩至180ml，加入20ml 40％的乙酸溶液，搅匀，静置析晶，过滤收集晶体，用适量乙酸乙酯洗涤，干燥，粉碎，得猪去氧胆酸精品20.04g，纯度93％，收率20.04％，转移率46.59％。
[0037] 实施例7
[0038] 称取猪去氧胆酸粗品(游离的酸)100g，以猪去氧胆酸计含量44％，加入乙酸乙酯176ml，另加入稀硫酸44ml，于80℃水浴中搅拌，直至无固体猪去氧胆酸粗品存在，将下层液体弃去，收集上层液体并过滤，浓缩至130ml，加入88ml 60％的乙酸溶液，搅匀，静置析晶，过滤收集晶体，用适量乙酸乙酯洗涤，干燥，粉碎，得猪去氧胆酸精品24.13g，纯度94％，收率24.13％，转移率51.55％。
[0039] 实施例8
[0040] 称取猪去氧胆酸钙盐100g，以猪去氧胆酸计含量78％，加入乙酸乙酯700ml，另加入稀盐酸235ml，于90℃水浴中搅拌，直至无固体猪去氧胆酸钙盐存在，将下层液体弃去，收集上层液体并过滤，浓缩至400ml，加入65ml 99％的乙酸溶液，搅匀，静置析晶，过滤收集晶体，用适量乙酸乙酯洗涤，干燥，粉碎，得猪去氧胆酸精品33.26g，纯度95％，收率36.26％，转移率44.16％。
[0041] 实施例9
[0042] 称取猪去氧胆酸镁盐100g，以猪去氧胆酸计含量80％，加入乙酸丁酯960ml，另加入稀硫酸320ml，于50℃水浴中搅拌，直至无固体猪去氧胆酸镁盐存在，将下层液体弃去，收集上层液体并过滤，浓缩至500ml，加入40ml 80％的乙酸溶液，搅匀，静置析晶，过滤收集晶体，用适量乙酸乙酯洗涤，干燥，粉碎，得猪去氧胆酸精品45.62g，纯度96％，收率45.62％，转移率54.74％。
[0043] 实施例10
[0044] 称取猪去氧胆酸粗品(游离的酸)100g，以猪去氧胆酸计含量75％，加入乙酸丙酯750ml，另加入稀硫酸150ml，于65℃水浴中搅拌，直至无固体猪去氧胆酸粗品存在，将下层液体弃去，收集上层液体并过滤，浓缩至400ml，加入75ml 70％的乙酸溶液，搅匀，静置析晶，过滤收集晶体，用适量乙酸乙酯洗涤，干燥，粉碎，得猪去氧胆酸精品45.37g，纯度98％，收率45.37％，转移率59.28％。
[0045] 实施例11
[0046] 称取猪去氧胆酸镁盐200g，猪去氧胆酸含量57％，加入乙酸乙酯1000ml，另加入稀硫酸230ml，于70℃水浴中搅拌，直至无固体猪去氧胆酸镁盐存在，将下层液体弃去，收集上层液体并过滤，浓缩至500ml，均分成两份，其中一份加入乙酸60ml 80％的乙酸溶液，搅匀，静置析晶。另一份加入60ml乙酸乙酯溶液，搅匀，静置析晶。分别放置24小时后，过滤收集晶体，用适量乙酸乙酯洗涤，干燥，粉碎，称重，检测猪去氧胆酸精品含量。
[0047] 按照上述方法进行3次试验，试验数据见下表：
[0048]
[0049] 通过上表可得，加入乙酸收率提高了10％以上，转移率提高了15％以上，充分证明了加入乙酸可以促进猪去氧胆酸的析晶。
[0050] 应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
