Slit2D2-HSA融合蛋白及其在抗肿瘤中的应用

摘要

本发明提供了一种Slit2D2‑HSA融合蛋白及其在抗肿瘤中的应用。实验结果表明，所述融合蛋白能够显著的抑制肿瘤细胞的迁移。本发明还提供了包含该融合蛋白的药物组合物，和制备该融合蛋白的方法。

权利要求

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所述结构：C‑A‑B           (Ia)，或C‑B‑A           (Ib)其中，

A为包括Slit2的第二个结构域D2的蛋白元件，并且元件A的长度为200‑300个氨基酸；

B为HSA蛋白元件；

C为任选的信号肽序列；

“‑”表示连接上述各元件的肽键或肽接头；

并且所述元件A具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列并且长度为207‑250个氨基酸；

所述融合蛋白具有选自下组的一个或多个特性：a) 具有抑制肿瘤细胞迁移的活性；

c) 具有抑制肿瘤细胞侵袭的活性和；

d) 抑制肿瘤生长的活性；

并且所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。

3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种产生蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤：在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的融合蛋白；和分离所述融合蛋白。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含：权利要求1所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。

7.权利要求1所述的融合蛋白的用途，用于制备治疗或预防肿瘤的药物，所述肿瘤选自：乳腺癌，肺癌，胰腺癌，肝癌和黑色素瘤。

说明书

Slit2D2‑HSA融合蛋白及其在抗肿瘤中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及重组蛋白质Slit2D2‑HSA的制备及其作为抗肿瘤药物在抗肿瘤中的应用。

背景技术

[0002] 肿瘤是机体细胞异常生长造成的疾病，肿瘤细胞增殖不可调控，并转移侵润周围或通过血液循环侵润远端组织，导致机体的恶变，危及生命。此类疾病极大地危害人类生命
健康，但对其治疗方法仍然十分有限。对于癌症的治疗，虽然过去20年有一定进展，但有效
药物仍然有限，目前急需要创新性思维开发新的药物。肿瘤疾病的发生发展其关键步骤涉
及细胞迁移、侵润和远处转移，基于这一特性可用于开发新一代抗癌药物。过去20多年神经
导向因子的研究发现了许多重要蛋白因子和揭示新的细胞生理机制。代表因子Slit是神经
轴突导向和神经元迁移趋势因子。近年来发现Slit及其受体Robo调节肿瘤细胞的迁移、炎
症细胞的迁移、血管内皮细胞的迁移，与肿瘤细胞及炎症疾病的发展密切相关。

[0003] 虽然Slit/Robo信号通路具有肿瘤药物开发的潜力。但将slit2蛋白直接用于药物开发存在四个问题，第一，slit2的分子量接近200kd，分子量较大，在体内药物吸收会受到
影响；第二、Slit2本身在体内的半衰期比较短。第三，关于Slit2对肿瘤的迁移也有相反的
结论，认为Slit2可以促进肿瘤转移(Wang,Xiao et al.2003,Wang,Zhao et al.2008)。第
四，Slit2会影响体内血管生成，Slit2本身可以促进血管内皮细胞转移和血管生成，但在
VEGF细胞因子作用下，其可以抑制VEGF引起的血管内皮细胞转移和血管生成,Slit2用于药
物开发，会影响体内心血管系统，产生不良反应。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种融合蛋白及其在抗肿瘤中的应用。

[0005] 本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所述结构：

[0006] C‑A‑B      (Ia)，或

[0007] C‑B‑A      (Ib)

[0008] 其中，

[0009] A为包括Slit2的第二个结构域D2的蛋白元件，并且元件A的长度为200‑300个氨基酸；

[0010] B为HSA蛋白元件；

[0011] C为任选的信号肽序列；

[0012] “‑”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。

[0013] 在另一优选例中，所述元件A具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列并且长度为207‑250个氨基酸。

[0014] 在另一优选例中，所述元件A序列如SEQ ID NO.:1所示。

[0015] 在另一优选例中，所述元件B序列如SEQ ID NO.:2所示。

[0016] 在另一优选例中，所述D2具有侧翼序列，所述侧翼序列包括：

[0017] 位于D2氨基端的第一侧翼序列；和/或

[0018] 位于D2羧基端的第二侧翼序列。

[0019] 在另一优选例中，所述第一侧翼序列由1‑5个氨基酸残基组成。

[0020] 在另一优选例中，所述第二侧翼序列由1‑2个氨基酸残基组成。

[0021] 在另一优选例中，所述的第一和第二侧翼序列分别来自天然Slit2蛋白的第二结构域D2(SEQ ID NO.:1)两侧的氨基酸序列。

[0022] 在另一优选例中，所述元件A衍生自哺乳动物(如人)的Slit2蛋白。

[0023] 在另一优选例中，所述元件B衍生自哺乳动物(如人)的HSA蛋白。

[0024] 在另一优选例中，所述的肽接头的长度为0‑10氨基酸，较佳地为1‑5个氨基酸。

[0025] 在另一优选例中，所述融合蛋白还包括信号肽元件C。

[0026] 在另一优选例中，所述融合蛋白不含信号肽，并且结构式为

[0027] A‑B      (IIa)，或

[0028] B‑A      (IIb)

[0029] 式中，A、B和“‑”的定义如上所述。

[0030] 在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：

[0031] (A)具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽；

[0032] (B)具有与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的 同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)的多肽，
且所述多肽具有肿瘤抑制活性；

[0033] (C)将SEQ ID NO:3中任一所示氨基酸序列经过1‑5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留肿瘤抑制活性的衍生多肽。

[0034] 在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

[0035] 在另一优选例中，所述融合蛋白具有选自下组的一个或多个特性：

[0036] a)具有抑制肿瘤细胞迁移的活性；

[0037] b)具有抑制HUVEC迁移的活性；

[0038] c)具有抑制肿瘤细胞侵袭的活性和；

[0039] d)抑制肿瘤生长的活性。

[0040] 本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

[0041] 本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

[0042] 本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

[0043] 在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞(如CHO细胞、NS0细胞、或293细胞)。

[0044] 本发明的第五方面，提供了一种产生蛋白的方法，它包括步骤：

[0045] 在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明第一方面所述的融合蛋白；和

[0046] 分离所述融合蛋白。

[0047] 本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含：

[0048] 本发明第一方面所述的融合蛋白，以及

[0049] 药学上可接受的载体。

[0050] 本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的融合蛋白的用途，用于制备治疗或预防肿瘤的药物。

[0051] 在另一优选例中，所述肿瘤选自：乳腺癌，肺癌，大肠癌，胰腺癌，卵巢癌，前列腺癌，肾癌，肝癌，脑癌，黑色素瘤，多发性骨髓瘤，慢性粒细胞性白血病，血液肿瘤，和淋巴肿
瘤。

[0052] 本发明的第十方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的融合蛋白。

[0053] 在另一优选例中，所述的融合蛋白以单体和/或二聚体形式施用。

[0054] 在另一优选例中，所述的对象是人。

[0055] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。

附图说明

[0056] 图1显示了SlitD2‑HSA融合蛋白电泳鉴定结果。

[0057] 图2显示了SlitD2‑HSA融合蛋白纯化后的HPLC检测结果。

[0058] 图3显示了肺癌A549的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下肺癌A549细胞的迁移，在浓度为0.1uM条件下其抑制率为82％，P<0.001；在浓度为1uM条件下其抑制率
为：98％P<0.001；Slit2N在浓度为0.1uM条件下对A549无明显抑制效果。

[0059] 图4显示了肝癌HepG2的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下肝癌细胞HepG2的迁移，在浓度为0.1uM条件下其抑制率为67％，P<0.001：在浓度为1uM条件下其抑制
率为：71％P<0.001；Slit2N在浓度为0.1uM条件下对HepG2无明显抑制效果。

[0060] 图5显示了黑色素瘤的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下黑色素瘤MDA‑MB‑435S细胞的迁移，在浓度为0.1uM条件下其抑制率为63％(P<0.001)：在浓度为1uM
条件下其抑制率为：84％(P<0.001)；Slit2N在浓度为0.1uM条件下对MDA‑MB‑435S细胞迁移
抑制率为77％(P<0.001)。

[0061] 图6显示了胰腺癌ASPC‑1的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下胰腺癌ASPC‑1细胞的迁移，在浓度为0.1uM条件下其抑制率为79％(P<0.001)：在浓度为1uM条件下
其抑制率为：95％(P<0.001)；Slit2N在浓度为0.1uM条件下对胰腺癌ASPC‑1细胞的迁移的
抑制率为83％(P<0.001)。

[0062] 图7显示了乳腺癌MDA‑MB‑231(HGF诱导转移)的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制HGF诱导下乳腺癌MDA‑MB‑231细胞的迁移，在浓度为1uM条件下其抑制率为：41％(P<0.01)。

[0063] 图8显示了乳腺癌MDA‑MB‑231(SDF‑1诱导转移)的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下乳腺癌MDA‑MB‑231细胞的迁移，在浓度为0.1uM条件下其抑制率为69％(P<
0.001)；在浓度为1uM条件下其抑制率为：92％(P<0.001)。

[0064] 图9显示了黑色素瘤A375的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下黑色素瘤A375细胞的迁移，在浓度为0.1uM条件下其抑制率为54％，P<0.001；在浓度为1uM条件下
其抑制率为：66％P<0.001；SlitN在浓度为0.1uM条件下对黑色素瘤A375细胞的迁移无明显
抑制效果。

[0065] 图10显示了乳腺癌MCF‑7/ADR的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下乳腺癌MCF‑7/ADR细胞的迁移，在浓度为0.1uM条件下其抑制率为58％(P<0.001)；在浓度为
1uM条件下其抑制率为：71％(P<0.001)；SlitN在浓度为0.1uM条件下对MCF‑7/ADR细胞的迁
移具有明显的促进效果，与Slit2D2‑HSA效果相反。

[0066] 图11显示了肝癌SMMC7721的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下肝癌SMMC7721细胞的迁移，在浓度为0.1uM条件下其抑制率为68％(P<0.001)；在浓度为1uM条件
下其抑制率为：99％(P<0.001)；Slit2N在浓度为0.1uM条件下对SMMC7721细胞的迁移具有
明显的促进效果效果，与Slit2D2‑HSA效果相反。

[0067] 图12显示了血管内皮细胞迁移实验结果。Slit2D2‑HSA能够抑制VEGF诱导下血管内皮细胞的迁移。

[0068] 图13显示了人乳腺癌MDA‑MB‑231‑Luc尾静脉注射转移模型的药效学研究，结果显示，Slit2D2‑HSA蛋白能够显著抑制MDA‑MB‑231细胞在小鼠体内的肺部转移。

[0069] 图14显示了药物在MDA‑MB‑231人乳腺癌原位移植BALB/c裸小鼠动物模型中的抗肿瘤转移作用和安全性评价。图14A显示了不同实验组中小鼠的肿瘤体积，显示融合蛋白实
验组的肿瘤体积明显小于溶媒对照组；图14B显示了肿瘤的生长曲线，融合蛋白实验组中肿
瘤生长速度显著低于溶媒对照组；图14C显示各实验组中接种肿瘤后，小鼠体重的变化情
况，对照组和实验组无显著差别，表明本发明的融合蛋白无明显的毒副作用。图14D显示各
实验组接种肿瘤细胞并长到一定阶段后，通过手术切除肿瘤方法建立转移评价模型，评价
药物对肿瘤细胞转移抑制效果。结果显示，本发明的融合蛋白对MDA‑MB‑231细胞在小鼠体
内的肺转移和淋巴结转移具有明显的抑制作用。图14E显示了肿瘤肺转移H&E染色，图14F(A
为对照，B为1mg/kg Slit2D2‑HSA,C为5mg/kg Slit2D2‑HSA,D为10mg/kg Slit2D2‑HSA)显
示了肿瘤淋巴结转移H&E染色。

具体实施方式

[0070] 本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种SlitD2‑HSA融合蛋白，实验结果表明，所述融合蛋白能够显著的抑制肿瘤细胞的迁移。而且，现有的文献表明Slit2对不同的肿瘤
具有促进和抑制的双重作用，但是本发明人意外地发现，本发明的融合蛋白对不同肿瘤均
显示抑制效果，在此基础上完成了本发明。

[0071] 在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并
且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

[0072] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语
“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和
101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

[0073] 虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

[0074] Slit蛋白

[0075] Slit是一类分泌性糖蛋白，分子量约为200kD，哺乳类动物中克隆到的Slit基因有三个，分别命名为Slit1,Slit2和Slit3。它的结构由N‑端的信号肽，4个富含亮氨酸的重复
序列(LRRs)以及多个EGF样的重复序列(在果蝇中是 7个，在脊椎动物中是9个)组成；研究
表明，其中的LRRs是Slit蛋白和受体Robo的结合区域。Slit蛋白通过结合受体Robo发挥功
能。Robo是一次跨膜的受体蛋白,在哺乳动物中，已经克隆到4个Robo基因。从物种进化的角
度看，Robo1,2,3的胞外部分非常的保守，从果蝇到人类都是由5个Ig样功能区和3个
FibronectinIII型重复序列组成。Robos有很短的跨膜区域和一个较长的胞内区；按照序列
的保守性，胞内区被划分为4个更小的区域，分别命名为：CC0,CC1,CC2,CC3。Robo4的结构与
其它三个家族成员有很大的不同，它的胞外只有2个Ig样功能区和3个Fibronectin III型
重复序列；胞内也只有CC0和CC2两个区域。Robos胞外的IgG结构域被认为是与配体Slit结
合所必需的，较长的胞内区域则和一些重要的信号分子相互作用，参与Slit/Robo下游的信
号转导，从而完成刺激信号由细胞外部到内部骨架的传递。slit2与Robo相互作用区域蛋白
质的机构解析发现slit2的第二个结构域D2与Robo1的Ig1结合，启动信号传导(Morlot,
Hemrika et al.2007,Hohenester 2008,Seiradake,von Philipsborn et al.2009)。

[0076] 近年来，趋化因子受体(CXC chemokinereceptor‑4，CXCR4)及其配体基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor‑I,SDF‑I)相互作用形成的反应轴SDF‑1/CXCR4在
肿瘤侵袭和转移中的作用越来越受到人们的关注，趋化因子CXCL12和CXCR4结合后，能够导
致肌动蛋白聚合和细胞伪足形成，使癌细胞突破基底膜发生侵袭，同时促使癌细胞的运动
和远处转移，从而产生趋化运动和侵袭反应。这一系列作用与SDF‑1剂量正相关，并已被证
明SDF‑1参与乳腺癌、前列腺癌、肝癌、非小细胞肺癌、纤维素肉瘤、卵巢癌、髓母细胞瘤、胰
腺癌、结肠癌、黑色素瘤等癌症的局部侵袭和器官特异性转移。

[0077] 也有研究发现：45％的乳腺癌DU4475细胞中表达ROBO1，20％的乳腺癌DU4475细胞中表达ROBO2；35％MDA‑MB‑231细胞表达ROBO1，21％MDA‑MB‑231细胞表达ROBO4。SDF‑1可以
通过CXCR4/CXCL12信号通路诱导乳腺癌细胞迁移、侵袭，但该过程可以被slit2所抑制，同
时也可抑制其细胞粘附行为。；其它研究也证明，Slit2(30pM或100pM)能够有效抑制SDF‑1
(10nM)诱导下的肿瘤迁移。

[0078] 融合蛋白及其制备

[0079] 在本发明中，“融合蛋白”、“重组蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明 融合蛋白”可互换使用，指具有式Ia或Ib所述结构，即含有包括Slit2D2的蛋白元件和HSA蛋白元件的融合蛋
白。一个代表性的例子是Slit2D2‑HSA。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如
二聚体)。此外，应理解，所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。

[0080] 如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，
但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

[0081] 如本文所用，“分离的融合蛋白”是指融合蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化融合蛋白。
基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

[0082] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

[0083] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然
发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所
知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或
插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

[0084] 如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以
是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”
(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分
互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互
补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有
足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物‑模板复合
物，从而进行扩增。

[0085] 本发明融合蛋白或其元件(如Slit2D2)的核苷酸全长序列或其片段通常可 以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序
列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常
规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或
多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

[0086] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

[0087] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

[0088] 应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法
如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

[0089] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。

[0090] 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：

[0091] (1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

[0092] (2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

[0093] (3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

[0094] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组
技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达
载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

[0095] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋
白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

[0096] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于 转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

[0097] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如
酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。

[0098] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所
用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方
法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如
显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

[0099] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下
进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)
诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

[0100] 在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是
本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀
剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离
子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

[0101] 在本发明的一个优选地实施方式中，Slit2D2蛋白元件的氨基酸序列如下：

[0102] LHCPAACTCSNNIVDCRGKGLTEIPTNLPETITEIRLEQNTIKVIPPGAFSPYKKLRRIDLSNNQISELAPDAFQGLRSLNSLVLYGNKITELPKSLFEGLFSLQLLLLNANKINCLRVDAFQDLHNLNLLSLYDNKLQTIAKG
TFSPLRAIQTMHLAQNPFICDCHLKWLADYLHTNPIETSGARCTSPRRLANKRIGQIKSKKFRCS(SEQ ID NO.:
1)

[0103] 在本发明的一个优选地实施方式中，HSA蛋白元件的氨基酸序列如下：

[0104] DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIAR
RHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS
QRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVEND
EMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAK
VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPC
AEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIK
KQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO.:2)

[0105] 优选地，本发明的SlitD2‑HSA融合蛋白的氨基酸序列如下：

[0106] LHCPAACTCSNNIVDCRGKGLTEIPTNLPETITEIRLEQNTIKVIPPGAFSPYKKLRRIDLSNNQISELAPDAFQGLRSLNSLVLYGNKITELPKSLFEGLFSLQLLLLNANKINCLRVDAFQDLHNLNLLSLYDNKLQTIAKG
TFSPLRAIQTMHLAQNPFICDCHLKWLADYLHTNPIETSGARCTSPRRLANKRIGQIKSKKFRCSDAHKSEVAHRF
KDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEM
ADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKA
AFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLT
KVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDV
CKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPH ECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ
NCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKT
PVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQL
KAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

[0107] (SEQ ID NO.:3)

[0108] 其编码DNA序列包括：

[0109] CTCTGGCTCCCCGGGGCgcgcTGTTTGCACTGCCCTGCCGCCTGTACCTGTAGCAACAATATCGTAGACTGTCGTGGGAAAGGTCTCACTGAGATCCCCACAAATCTTCCAGAGACCATCACAGAAATACGTTTGGAACAGAAC
ACAATCAAAGTCATCCCTCCTGGAGCTTTCTCACCATATAAAAAGCTTAGACGAATTGACCTGAGCAATAAAGATC
TCTGAACTTGCACCAGATGCTTTCCAAGGACTACGCTCTCTGAATTCACTTGTCCTCTATGGAAATAAAATCACAG
AACTCCCCAAAAGTTTATTTGAAGGACTGTTTTCCTTACAGCTCCATATTGAATGCCAACAAGATAAACTGCCTTC
GGGTAGATGCTTTTCAGGATCTCCACAACTTGAACCTTCTCTCCCTATATGACAACAAGCTTCAGACCATCGCCAA
GGGGACCTTTTCACCTCTTGGCCATTCAAACTATGCATTTGGCCCAGAACCCCTTTATTTGTGACTGCCATCTCAA
GTGGCTAGCGGATTATCTCCATACCAACCCGATTGAGACCAGTGGTGCCCGTTGCACCAGCCCCCGCCGCTGCAAA
CAAAAGAATTGGACAGATCAAAAGCAAGAAATTCCGTTGTTCAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTT
AAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCTTTGCTCAGTATCTTAGCAGTGTCCATTTGAA
GATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTG
ACAAATCACTTCATACCTTTTTGGAGACAAATTAGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTG
ACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACTCCCCCGA
TTGGTGAGACAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATA
TGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACCCTTTTCTTTGCTAAAAGGATAAAGCTGCTTTTAC
AGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCT
TCGTCTGCCAAACAGGACTCAAGTGTGCCAGTCTCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCT
CGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACAAAGTCCACAC
GGAATGCTGCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAG
ATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCTTGCCGAAGTGGAAA
ATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGC
TGAGGCAAAGGATTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCT
GCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCAGAATGCTATGCCA
AAGTGTTCGATAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAG
CTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGCAACTCCAACTCTT
GTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTG
CAGAAGACTATTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCA
AATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAACATACGTTCCCAAA
GAGTTTAATGCTAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACA
AACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTTGGATGATTTCGC
AGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCT
GCAAGTCAACTGCCTTAGGCTTATAAGAATTCATTGATCATTAATCAGCCA(SEQ ID NO.:4)

[0110] 应理解，所述术语还包括本发明融合蛋白的衍生物，指本发明融合蛋白在经过1‑3个氨基酸添加或替换、1‑2个氨基酸缺失并仍具有肿瘤抑制活性的多肽。这些保守性变异多
肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

[0111] 表1

[0112] 最初的残基 代表性的取代 优选的取代Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu

[0113]Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

[0114] 一旦鉴定获得了相关的肽序列，就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到
相关肽(融合蛋白)。

[0115] 此外，还可用化学方法直接合成相关肽序列。

[0116] 肽接头

[0117] 本发明提供了一种融合蛋白，它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在
空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白
的稳定性的影响。

[0118] 连接肽的长度一般为0‑10个氨基酸，较佳地1‑5个氨基酸。

[0119] 药物组合物及施用方法

[0120] 本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将本发明的融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载
体介质中，其中pH通常约为5‑8，较佳地，pH约为6‑8。

[0121] 如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量，如0.001‑99wt％；较佳的0.01‑95wt％；更佳的，0.1‑
90wt％。

[0122] 如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接
受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

[0123] 本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白以及药学上可 接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药
物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水
或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条
件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

[0124] 本发明融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试
验)。所述的因素包括但不限于：本发明融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、
半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
针对肿瘤患者，通常，当本发明的融合蛋白每天以约0.5mg‑5mg/kg动物体重(较佳的2mg‑
4mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每
天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

[0125] 本发明的主要优点在于：

[0126] (1)本发明的slit2D2‑HSA融合蛋白具备广谱抗肿瘤作用，包括对肺癌(A549),乳腺癌(MDA‑MB‑231)，胰腺癌(ASPC‑1),黑色素瘤(A435，MDA‑MB‑435S)和肝癌(HepG2)具有肿
瘤转移抑制作用，体现了其广谱抗肿瘤作用；

[0127] (2)slit2在不同肿瘤细胞中表现出不同的作用(促进或抑制)，但本发明开发的融合蛋白分子所针对的肿瘤细胞，均为抑制作用；

[0128] (3)本发明的slit2D2‑HSA融合蛋白对血管内皮细胞迁移有显著地抑制作用，进而抑制肿瘤营养供应，在动物体内表现出抑制肿瘤生长作用；

[0129] (4)本发明的slit2D2‑HSA融合蛋白安全性强，对动物体没有明显的毒副作用，而且半衰期长。

[0130] 下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条
件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory 
Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和
份数按重量计算。以下实施例中所用 的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获
得。

[0131] 实施例1：SlitD2‑HSA融合蛋白的制备

[0132] 1.1SlitD2‑HSA融合蛋白制备

[0133] 依据slit2序列[GenBank:EAW92793.1]分析设计构建Slit2的第二个结构域Slit2D2(Hohenester 2008)和人血清白蛋白HSA的融合表达载体。通过全基因合成得到
slit2D2和HSA基因片段，以其为模板通过引物T62F和T62R PCR扩增Slit2D2基因序列，通过
引物T60F3和T59R PCR扩增HSA基因序列,用胶回收试剂盒纯化上述674bp和1783bp PCR产
物。含CMV启动子pCDNA3.1载体(Invitrogen)用BssH II和EcoR I酶切，将2个PCR产物和酶
切载体设置无缝连接反应，之后转换TOP10菌株(购自上海索莱宝生物科技有限公司)，氨苄
青霉素筛选并挑取阳性克隆，通过测序确认载体构建成功。用无内毒素DNA提取试剂盒提取
质粒DNA，用于转染EXPI293细胞使用。培养EXPI293细胞(购自Life Technologies公司)，当
6
密度达到2.5x 10 细胞/毫升时转染，转染5天后收集上清。高速离心EXPI293培养液取上
清，通过离子交换层析纯化SlitD2‑HSA融合蛋白。通过SDS‑PAGE检测目的蛋白分子量，通过
HPLC检测蛋白纯度。

[0134] 本实施例中引物序列如下：

[0135] >T62F

[0136] CTCTGGCTCCCCGGGGCgcgcTGTTTGCACTGCCCTGCCGCCTGTACC(SEQ ID NO.:5)

[0137] >T62R

[0138] GCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTGAACAACGGAATTTCTTGCTT(SEQ ID NO.:6)

[0139] >T60F3

[0140] GATGCACACAAGAGTGAGGTTGC(SEQ ID NO.:7)

[0141] >T59R

[0142] TGGCTGATTAATGATCAATGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG(SEQ ID NO.:8)

[0143] 图1显示了SlitD2‑HSA重组蛋白表达鉴定结果，电泳图谱为12％SDS‑PAGE电泳图谱，泳道1‑3分别为分子量标记、还原条件下的电泳情况和非还原条件下的电泳情况。图2为
HPLC检测(SEC‑HPLC；G3000swxl；0.5ml/min；40min；UV280)结果，表明本实施例中制备了极
高纯度的融合蛋白。上述结果表明，所构建的融合蛋白分子量与预期相符，本实施例中成功
构建并制备了了SlitD2‑HSA融合蛋白。

[0144] 实施例2：SlitD2‑HSA蛋白体外广谱抗肿瘤转移活性检测

[0145] 2.1体外活性测试

[0146] A.Transwell肿瘤体外转移模型建立

[0147] 将肿瘤细胞消化打散，取15,000个细胞加入transwell小室上层，总体积为100ul，不含血清，各组含有不同浓度的药物，每组三个平行。小室下层中加入600ul含有10％血清
的培养基，并加入终浓度为10Nm的SDF1，除了NC组下层不加SDF1，其余各组都加。24小时后
将小室用4％多聚甲醛固定，然后将上层膜的细胞轻轻擦除，下层膜的细胞用DAPI染色。将
染色后的下层膜的细胞置于荧光显微镜下拍照，每个小室随机选取5个视野，20X物镜。对每
张照片中的细胞数进行统计，试验中所用slit2N蛋白为slit2全长蛋白N段，作为对照蛋白。
购自sigma公司，货号SRP3155)。

[0148] 对以下细胞系进行体外检测，确定药物抗瘤谱。

[0149] 肺癌：A549；乳腺癌：MCF‑7/ADR、MDA‑MB‑231；黑色素瘤：MDA‑MB‑435S,A431；肝癌:HepG2，SMMC7721；胰腺癌：ASPC‑1。上述细胞株均可通过市售渠道获得。

[0150] B.人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移实验：

[0151] 1.HUVEC饥饿处理12小时。

[0152] 2.在transwell小室下方加入600μL含VEGF(50ng/Ml)及不同蛋白的basic培养基(不含血清及其他生长因子)，小室上方加入用100μL basic培养基重悬的经过饥饿处理的
细胞(4×104)以及不同蛋白，每组均设3个复孔。

[0153] 3.于37℃5％CO2培养箱中进行孵育，孵育6小时后固定，结晶紫染色，用棉棒轻轻擦去小室上方细胞，拍照(拍照倍数为10×1.6倍)并进行统计学分析。

[0154] 抑制率计算公式

[0155] 抑制率＝(HSA组细胞迁移数目‑给药组细胞迁移数目)/(HSA组细胞迁移数目‑PBS组细胞迁移数目)*100％

[0156] 图3显示了肺癌A549的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下肺癌A549细胞的迁移，在浓度为0.1Um条件下其抑制率为82％，P<0.001；在浓度为1Um条件下其抑制率
为：98％P<0.001；Slit2N(Slit2N为slit2蛋白的N端，约为140kd，包含了slit2的D1—D4的
结构域和多个EGF重复序列，购自Sigma公司)在浓度为0.1Um条件下对A549无明显抑制效
果。

[0157] 图4显示了肝癌HepG2的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下肝癌细胞HepG2的迁移，在浓度为0.1Um条件下其抑制率为67％，P<0.001； 在浓度为1Um条件下其抑
制率为：71％P<0.001；Slit2N在浓度为0.1Um条件下对HepG2无明显抑制效果。

[0158] 图5显示了黑色素瘤的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下黑色素瘤MDA‑MB‑435S细胞的迁移，在浓度为0.1Um条件下其抑制率为63％(P<0.001)；在浓度为1Um
条件下其抑制率为：84％(P<0.001)；Slit2N在浓度为0.1Um条件下对MDA‑MB‑435S细胞迁移
抑制率为77％(P<0.001)。

[0159] 图6显示了胰腺癌ASPC‑1，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下胰腺癌ASPC‑1细胞的迁移，在浓度为0.1Um条件下其抑制率为79％(P<0.001)；在浓度为1Um条件下其抑制率
为：95％(P<0.001)；Slit2N在浓度为0.1Um条件下对胰腺癌ASPC‑1细胞的迁移的抑制率为
83％(P<0.001)。

[0160] 图7显示了乳腺癌MDA‑MB‑231(HGF诱导转移)的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制HGF诱导下乳腺癌MDA‑MB‑231细胞的迁移，在浓度为1Um条件下其抑制率为：41％(P<0.01)。

[0161] 图8显示了乳腺癌MDA‑MB‑231(SDF‑1诱导转移)的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下乳腺癌MDA‑MB‑231细胞的迁移，在浓度为0.1Um条件下其抑制率为69％(P<
0.001)；在浓度为1Um条件下其抑制率为：92％(P<0.001)。

[0162] 图9显示了黑色素瘤A375的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下黑色素瘤A375细胞的迁移，在浓度为0.1Um条件下其抑制率为54％，P<0.001；在浓度为1Um条件下
其抑制率为：66％P<0.001；SlitN在浓度为0.1Um条件下对黑色素瘤A375细胞的迁移无明显
抑制效果。

[0163] 图10显示了乳腺癌MCF‑7/ADR的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下乳腺癌MCF‑7/ADR细胞的迁移，在浓度为0.1Um条件下其抑制率为58％(P<0.001)；在浓度为
1Um条件下其抑制率为：71％(P<0.001)；SlitN在浓度为0.1Um条件下对MCF‑7/ADR细胞的迁
移具有明显的促进效果效果，与Slit2D2‑HSA效果相反。

[0164] 图11显示了肝癌SMMC7721的抑制活性，Slit2D2‑HSA能够抑制SDF‑1诱导下肝癌SMMC7721细胞的迁移，在浓度为0.1Um条件下其抑制率为68％(P<0.001)；在浓度为1Um条件
下其抑制率为：99％(P<0.001)；SlitN在浓度为0.1Um条件下对SMMC7721细胞的迁移具有明
显的促进效果效果，与Slit2D2‑HSA效果相反。

[0165] 图12显示了血管内皮细胞迁移实验结果。Slit2D2‑HSA能够抑制VEGF诱导下血管内皮细胞的迁移。

[0166] 实施例3.人乳腺癌MDA‑MB‑231‑Luc尾静脉注射转移模型的药效学研究

[0167] 3.1细胞株及细胞准备

[0168] MDA‑MB‑231‑Luc细胞株：购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

[0169] RPMI1640+10％胎牛血清+1％青/链霉素培养液中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。

[0170] 3.2实验动物

[0171] 种系与数量：SCID‑Beige小鼠，32只

[0172] 年龄与性别：6‑8周龄，♀，18‑22g

[0173] 供应商：上海灵畅生物科技有限公司

[0174] 饲养环境：SPF级动物房

[0175] 3.3试剂

[0176] RPMI1640培养液:Hyclone,Cat.No.:SH30809.01B；胎牛血清:Biological Industries,Cat.No.:04‑001‑1a；青/链霉素:Gibco,Cat.No.:15070‑063；0.25％胰酶‑
EDTA:Invitrogen,Cat.No.:25200‑072；HBSS‑/‑:Invitrogen,Cat.No.:14175；受试药物：
Slit2D2‑HSA，浓度：1mg/ml，规格：500ul/支*20，性状：液体，储存条件：‑80℃；Plerixafor，
规格：5mg，性状：白色粉末，储存条件：‑20℃，药物配制：各组受试药物均采用PBS稀释至相
应浓度后进行给药，稀释后溶液保存于4℃待用。阳性对照药物Plerixafor采用PBS溶解至
相应浓度并进行给药，溶液保存于4℃待用。

[0177] 3.4实验步骤

[0178] 动物接种

[0179] 扩增MDA‑MB‑231‑Luc细胞，按1.5×106细胞量/只小鼠，分别进行32只SCID小鼠的尾静脉注射，后进行后续的药效学研究。

[0180] 分组与给药

[0181] 建模当天将小鼠随机分为4组，每组8只小鼠，并于造模当天开始给药治疗。具体分组及给药见表1：

[0182] 表1:动物分组与给药

[0183]

[0184] 观察和检测

[0185] 接种后至实验结束前，每天观察动物状态，若发现动物生病或异常死亡，则由兽医进行处理或解剖。

[0186] 给药过程中，若动物体重下降超过20％，动物需要停药。

[0187] 若实验过程中，有荷瘤鼠死亡，及时估计并记录死亡时间、解剖以进行尸检。如果不能及时解剖，则先放入‑20℃冰箱以减少组织自溶；若荷瘤鼠状态很差或濒临死亡，根据
动物福利，应实行安乐死；体重下降超过基础体重的30％，也应实行安乐死。

[0188] 动物体重：每周两次进行动物体重称量，并记录。

[0189] 肿瘤生长情况的测量：细胞接种当天记为Day 0,分别为Day 0、Day 3、Day 8、Day 13、D17、D21共6个时间点进行动物生物发光活体成像的检测

[0190] 肿瘤转移速率＝(第21天荧光值‑第8天荧光值)/第8天荧光值；

[0191] 肿瘤转移速率越小，表明药物抑制肿瘤转移能力越强。

[0192] (肿瘤前7d在体内处于平稳期，从第8d开始表现出生长和转移趋势)

[0193] 图13显示了人乳腺癌MDA‑MB‑231‑Luc尾静脉注射转移模型的药效学研究，结果显示，Slit2D2‑HSA蛋白能够显著抑制MDA‑MB‑231细胞在小鼠体内的肺部转移。

[0194] 实施例4.测试药物在MDA‑MB‑231人乳腺癌原位移植BALB/c裸小鼠动物模型中的抗肿瘤转移作用和安全性评价

[0195] 细胞培养：MDA‑MB‑231细胞培养在含10％胎牛血清的L‑15培养液中。收集指数生长期的MDA‑MB‑231细胞至适合浓度用于裸鼠原位肿瘤接种。

[0196] 动物造模及分组：BALB/c nude裸鼠，雌性，4‑5周，14‑18g，购自上海西普尔‑必凯实验动物有限公司。分组后共2组，每组10只。所有实验小鼠均饲养在SPF级动物房中，并且
7
提前适应环境至少7天。实验小鼠右侧乳腺脂肪垫下接种1×10MDA‑MB‑231细胞，细胞重悬
在1：1的L‑15培养液与基质胶中(0.1ml/只)，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均～
3
150mm时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药。给药两周后，手术切除肿瘤组织，继续给
药六周。详细的给药方法、给药剂量和给药途径见表1。

[0197] 表2 MDA‑MB‑231动物模型中的给药途径、剂量及方案

[0198]

[0199] 注：n：动物只数；给药体积为10ul/g；i.p.：腹腔注射给药。

[0200] 各组受试药物均采用PBS稀释至相应浓度后进行给药，稀释后溶液保存于4℃待用。

[0201] 药物为蛋白类，避免反复冻融。

[0202] 实验动物饲养室的环境条件：实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度20‑26℃，湿度30‑70％，10‑20次/小时换气，昼夜明暗交替时间12h/12h；持续供给钴
60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取，饮用自来水(高压蒸汽灭菌后使用)，饮水瓶
不间断供水，自由摄取。饲养鼠盒是聚砜鼠盒，无病原微生物；垫料是玉米芯，每盒5只动物，
笼卡上标明IACUC批准号、实验编号、实验开始时间、课题负责人、实验人员、动物来源、组别
和动物号等；实验动物打耳号进行标记。

[0203] 无菌操作：化合物溶液的配制、给药、肿瘤测量及体重称量等全部过程都 在生物安全柜或超净工作台中进行。

[0204] 随机分组：在给药开始前，称量所有动物的体重，并用游标卡尺测量肿瘤体积。鉴于肿瘤体积会影响治疗的有效性，所以用随机分组设计的方法，根据鼠的肿瘤体积对其分
组，以保证不同组别间的肿瘤体积相似。

[0205] 实验观察和数据收集：试验过程中，动物实验操作均根据AAALAC的要求。肿瘤接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动
性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。试验过程中观察到
的临床症状均记录在原始数据中。整个实验过程中，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大
3
小。肿瘤大小计算公式：肿瘤体积(mm)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)。实验终结时,采集
肺组织和淋巴组织，对收集的肺组织和淋巴组织进行H.E.染色,计数肺组织和淋巴组织中
的转移灶，统计发生转移的动物数量。

[0206] 实验观察指标及计算：

[0207] 1.相对肿瘤抑制率TGI(％)：TGI％＝(1‑T/C)×100％。T/C％为相对肿瘤增值率，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。T和C分别为治疗组和
对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(RTV)或瘤重(TW)。

[0208] 计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组平均RTV；CRTV：溶媒对照组平均RTV；RTV＝Vt/V0，V0为分组时该动物的瘤体积，Vt为治疗后该动物的瘤体积)。或

[0209] T/C％＝TTW/CTW×100％(TTW：治疗组实验终结时平均瘤重；CTW：溶媒对照组实验终结时平均瘤重)。

[0210] 2.肿瘤转移率T/C(％)：T/C％＝T/C×100％。T/C％为肿瘤转移率，即在实验结束时，治疗组和对照组相对肿瘤转移率的百分比值。T和C分别为治疗组和对照组在实验终结
时肺和淋巴组织中肿瘤转移的数目。

[0211] 结束实验标准：在实验过程中，会密切观察老鼠的进食、进水及体重状态。达到以下标准时将对老鼠进行安乐死：

[0212] 当一组动物平均瘤体积超过3000mm3，或者在动物在濒临死亡前将或整组动物安乐死。

[0213] 当小鼠体重下降>20％超过72小时，将对其实施安乐死。

[0214] 若小鼠有其他健康问题，如：持续稀便，呼吸困难，弓背或者不能够正常 采食与饮水时，将其安乐死。

[0215] 当对照组小鼠瘤体积均值超过2000mm3时或最后一次给药后一星期将终止实验。

[0216] 统计学处理：所有实验结果以平均瘤体积±SE(标准误差)表示。用单因素方差分析(one way ANOVA)检验方法比较治疗组肿瘤体积，瘤重和肺肿瘤转移率与对照组相比有
无显著性差异。所有的数据均用SPSS 18.0进行分析。p<0.05为具有显著性差异。

[0217] 图14显示了药物在MDA‑MB‑231人乳腺癌原位移植BALB/c裸小鼠动物模型中的抗肿瘤转移作用和安全性评价。图14A显示了不同实验组中小鼠的肿瘤体积，显示融合蛋白实
验组的肿瘤体积明显小于溶媒对照组；图14B显示了肿瘤的生长曲线，融合蛋白实验组中肿
瘤生长速度显著低于溶媒对照组；图14C显示各实验组中接种肿瘤后，小鼠体重的变化情
况，对照组和实验组无显著差别，表明本发明的融合蛋白无明显的毒副作用。图14D显示各
实验组接种肿瘤细胞并长到一定阶段后，通过手术切除肿瘤方法建立转移评价模型，评价
药物对肿瘤细胞转移抑制效果,图14E显示了肿瘤肺转移H&E染色，图14F(A为对照，B为1mg/
kg Slit2D2‑HSA,C为5mg/kg Slit2D2‑HSA,D为10mg/kg Slit2D2‑HSA)显示了肿瘤淋巴结
转移H&E染色。上述结果显示Slit2D2‑HSA蛋白在10mg/kg给药剂量下能够一定程度抑制
MDA‑MB‑231细胞的生长，抑瘤率达到33.4％；另外，本发明的融合蛋白对MDA‑MB‑231细胞在
小鼠体内的肺转移和淋巴结转移具有抑制作用，其中5mg/kg给药效果优于10mg/kg。5mg/kg
给药剂量下阳性转移率为66.7％,而对照组为90％，其中淋巴结转移程度>10％的比率只有
22％，而对照组达到50％。显示该药物具有较好的抑制肿瘤转移活性，给药组与对照组动物
体重无显著差别，显示药物无明显毒副作用。

[0218] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可
以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范
围。

[0219] 引用文献

[0220] Wang,B.,Y.Xiao,B.B.Ding,N.Zhang,X.Yuan,L.Gui,K.X.Qian,S.Duan,Z.Chen,Y.Rao and J.G.Geng(2003)."Induction of tumor angiogenesis by Slit‐Robo 
signaling and inhibition of cancer growth by blocking Robo activity." Cancer 
Cell 4(1):19‐29.

[0221] Wang,L.J.,Y.Zhao,B.Han,Y.G.Ma,J.Zhang,D.M.Yang,J.W.Mao,F.T.Tang,W.D.Li,Y.Yang,R.Wang and J.G.Geng(2008)."Targeting Slit‐Roundabout signaling 
inhibits  tumor angiogenesis  in  chemical‐induced  squamous  cell 
carcinogenesis."Cancer Sci 99(3):510‐517.

[0222] Hohenester,E.(2008)."Structural insight into Slit‐Robo signalling."Biochem Soc Trans 36(Pt 2):251‐256.

[0223] Morlot,C.,W.Hemrika,R.A.Romijn,P.Gros,S.Cusack and A.A.McCarthy(2007)."Production of Slit2 LRR domains in mammalian cells for structural 
studies and the structure of human Slit2 domain 3."Acta Crystallogr D Biol 
Crystallogr 63(Pt 9):961‐968.

[0224] Seiradake,E.,A.C.von Philipsborn,M.Henry,M.Fritz,H.Lortat‐Jacob,M.Jamin,W.Hemrika,M.Bastmeyer,S.Cusack and A.A.McCarthy(2009)."Structure and 
functional relevance of the Slit2homodimerization domain." EMBO Rep 10(7):
736‐741.