一株抗多菌灵的哈茨木霉菌株Th-N5及其应用转让专利
申请号 : CN201610652251.7
文献号 : CN106282029B
文献日 : 2019-07-19
发明人 : 黄振
申请人 : 华南农业大学
摘要 :
本发明公开了一株抗多菌灵的哈茨木霉菌株Th‑N5及其应用。所述哈茨木霉菌株Th‑N5于2016年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016251。经侵染生物学研究和室内生物测定，该菌株对桑葚白果病具有很好的防效，而且该菌株对化学农药多菌灵有较强的抗药性，其与低剂量的多菌灵混合使用可彻底控制桑葚白果病，大大减少化学农药的使用量，解决桑果中的农药残留问题。该菌株为中国本土的菌株，并非从国外引进，能适应本地的自然环境。另外，哈茨木霉菌是一种生防真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理、对环境无污染、无残留的特征，可适应有机食品生产的要求。
权利要求 :
1.一株防治桑葚白果病且具有多菌灵抗性的哈茨木霉菌株Th-N5，其特征在于，该菌株于2016年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2016251。
2.根据权利要求1所述的哈茨木霉菌株Th-N5，其特征在于，该菌株的rDNA-ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述的哈茨木霉菌株Th-N5在防治桑葚白果病中的应用。
4.权利要求1所述哈茨木霉菌株Th-N5与多菌灵混合使用在防治桑葚白果病中的应用，其特征在于，为50 mg/L的多菌灵+1×107孢子/ml的哈茨木霉孢子悬浮液。
5.一种防治桑葚白果病的生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的哈茨木霉菌株Th-N5。
6.根据权利要求5所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中还含有0～50 mg/L的多菌灵。
7.根据权利要求5所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中含有1～50 mg/L的多菌灵和1×105～1×108孢子/ml的哈茨木霉菌株Th-N5孢子悬浮液。
8.权利要求5～7任一所述的生物制剂在防治桑葚白果病中的应用。
说明书 :
一株抗多菌灵的哈茨木霉菌株Th-N5及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物防治技术领域，具体地，涉及一株抗多菌灵的哈茨木霉菌株Th-N5及其与低剂量的多菌灵混合防治桑葚白果病的应用。
背景技术
[0002] 桑葚白果病是菌核病的俗称，又称桑白果病，属真菌类病害，是桑果上的主要病害，其对应的病原菌有核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）、桑实杯盘菌（Ciboria shiraiana）、肉阜状杯盘菌（Ciboria carunculoides）和核地杖菌（Scleromitulashiraiana）。桑葚白果病传染性强、传播快，病情轻则影响桑葚的产量与品质，重则致使桑椹无法正常成熟、收获，导致桑葚大面积减产、颗粒无收，对果桑产业造成毁灭性灾害，带病菌的桑叶严重威胁蚕茧的生产，直接影响桑葚加工产业与蚕业生产所需的原料来源，威胁到桑果产业的持续发展。
[0003] 目前，桑葚白果病的防治主要采用农业综合防治和化学防治技术措施，农业综合防治主要以减少初侵染源的病原物基数、切断病原物的传播途径为主，因而防治效果有限。化学防治主要采用50%多菌灵、70%甲基托布津、40%菌核净等化学农药喷雾，但是，长期、大量地使用多菌灵等化学农药引起病原菌抗药性增强，导致桑果产品和生态环境中化学农药残留严重超标。
[0004] 哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）是一种重要的植物病害生防治真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新作用机理、对环境无污染、无残留，可以作为对化学农药产生抗药性的桑葚白果病的替代防治药物。但是，目前已有的哈茨木霉菌菌株对桑葚白果病的防效仍然不是十分理想，而且多数菌株对其他化学农药，如多菌灵，不具有抗药性，阻碍了其与化学农药混用从而达到显著提高桑葚白果病防效的目的，限制了其应用。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有桑葚白果病防治技术的缺陷和不足，提供一株抗多菌灵的哈茨木霉菌株Th-N5及其应用，所述茨木霉菌株Th-N5对防治桑葚白果病有显著的效果，而且该哈茨木霉菌株Th-N5对多菌灵有较强的抗药性，与低剂量的多菌灵混合使用、可彻底控制桑葚白果病，大大减少化学农药的使用量，解决桑果中的农药残留问题，同时不污染环境与农田生态环境。
[0006] 本发明的目的是提供一株哈茨木霉菌Th-N5菌株及其在防治桑葚白果病中的应用。
[0007] 本发明的另一目的是提供所述菌株Th-N5与低剂量的多菌灵混合防治桑葚白果病的应用。
[0008] 本发明的在再一目的是提供一种防治桑葚白果病的生物制剂，所述制剂包含哈茨木霉菌Th-N5菌株。
[0009] 本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的。
[0010] 一株抗多菌灵的哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）Th-N5菌株，所述Th-N5菌株于2016年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No:M2016251，分类命名号为：Trichoderma harzianum Th-N5；保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0011] 所述哈茨木霉菌Th-N5分离自广州地区被自然侵染的桑葚白果，然后经筛选获得纯化菌株，经过鉴定属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科。
[0012] 本发明的哈茨木霉菌Th-N5的形态特性如下：
[0013] 在PDA培养基上菌落深厚、致密，初期为白色絮状，后为暗绿色或绿色，背面呈黄色或浅绿色。分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，有2～3次分枝，着生分生孢子的小梗呈瓶形或锥形。菌丝纤细无色，具分隔，多分枝；分生孢子多为球形、2～2.9×1.9～2.6μm，单孢，在小梗上聚集成球状。
[0014] 进一步地，所述哈茨木霉菌Th-N5的rDNA-ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
[0015] 本发明所述哈茨木霉菌Th-N5菌株在防治桑葚白果病方面有特效，而且对多菌灵有抗药性，可与低剂量的多菌灵混合使用，彻底控制桑葚白果病，大大减少化学农药的使用量，解决桑果中的农药残留问题，不污染环境与农田生态环境。同时可用于防治核盘菌等病原引起的多种植物病害。
[0016] 因此，所述哈茨木霉菌Th-N5菌株在防治桑葚白果病中的应用，以及在防治核盘菌引起的多种植物病害方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。
[0017] 同时，所述哈茨木霉菌株Th-N5与多菌灵混合使用在防治桑葚白果病中的应用，以及在防治核盘菌引起的多种植物病害方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。
[0018] 另外，本发明还提供了一种从哈茨木霉菌株Th-N5中提取得到的粗毒素。
[0019] 具体地，所述粗毒素的提取方法如下：取哈茨木霉菌Th-N5菌株的孢子，用含有吐温-80的无菌水配制成孢子悬液，将孢子悬液加入Czapek培养液中培养；然后向培养液中加入乙酸乙酯进行抽提（抽提其中的真菌毒素），得到的有机相浓缩即得到哈茨木霉毒素。
[0020] 更具体地，所述粗毒素的提取方法如下：取哈茨木霉菌Th-N5菌株的孢子用0.05%的吐温-80无菌水配制成浓度为1×108分生孢子/mL的孢子悬液，然后取2ml加入200ml的Czapek培养液中，在26±1℃、200rpm条件下振荡培养5d，将等体积的乙酸乙酯加入带有菌丝的培养液中抽提其中的真菌毒素，2天后取有机相浓缩获得哈茨木霉毒素，将连续3次抽提浓缩的毒素合并后放入-20℃冷冻备用。
[0021] 另外，一种包含上述的哈茨木霉菌株Th-N5或包含有从该菌株中提取的毒素的防治桑葚白果病的生物制剂也在本发明的保护范围之内。
[0022] 优选地，所述防治桑葚白果病的生物制剂还包含有0～50 mg/L的多菌灵。
[0023] 更优选地，所述防治桑葚白果病的生物制剂中含有1～50 mg/L的多菌灵和1×105～1×108孢子/ml的哈茨木霉Th-N5孢子悬浮液。
[0024] 更优选地，所述生物制剂中含有25～50mg/L的多菌灵和1×107孢子/ml的哈茨木霉菌株Th-N5孢子悬浮液。
[0025] 更优选地，所述生物制剂中含有50mg/L的多菌灵和1×107孢子/ml的哈茨木霉菌株Th-N5孢子悬浮液。
[0026] 上述生物制剂在防治桑葚白果病和/或核盘菌引起的其他多种植物病害中的应用，也应在本发明的保护范围之内。本发明具有以下有益效果：
[0027] 本发明公开的哈茨木霉菌Th-N5是从广东省广州地区被自然侵染的桑葚白果上分离获得，可有效地防治桑葚白果病。
[0028] 同时，该菌株对多菌灵有较强的抗药性，与低浓度的多菌灵混合使用可彻底控制桑葚白果病，可大大减少多菌灵等化学农药的使用量，解决桑果中的农药残留问题。
[0029] 另外，该菌株为中国本土的菌株，并非从国外引进，能适应本地的自然环境。该哈茨木霉菌是一种生防真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理、对环境无污染、无残留的特征，适应了有机食品生产的要求。
附图说明
[0030] 图1为哈茨木霉菌Th-N5的菌落形态（10 d）；A：菌落正面；B：菌落背面。
[0031] 图2为哈茨木霉菌Th-N5的菌丝和分生孢子形态。
具体实施方式
[0032] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0033] 实施例1哈茨木霉菌Th-N5菌株的分离与鉴定
[0034] 1. 菌株的分离
[0035] （1）材料：目标菌株分离自广州地区桑葚园中被自然侵染的桑葚白果。
[0036] （2）实验条件
[0037] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：将200g马铃薯+20g葡萄糖+17～20g琼脂粉倒入烧杯中并加入水使总体积为1000ml。经高压灭菌（121℃，30min）。
[0038] 无菌操作条件：所有器皿和用具须经高压灭菌（121℃，30min），接种等操作均在超净工作台内进行。
[0039] 培养条件：置于26±1℃光照（14L：10D）恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4℃冰箱贮存。
[0040] （3）菌株的分离
[0041] 利用5%的次氯酸钠溶液对桑葚白果样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中洗涤3次后放入PDA平板中，置于26±1℃恒温箱中培养，将新产生的菌落或菌丝转移到新的PDA平板上，培养观察4-7天待形成菌落并产孢后，将初步根据菌落形态判断为哈茨木霉菌的菌落编号为A、B、C、D、E、F共6个菌株，再转入4℃冰箱贮存。
[0042] 2. 菌株的形态学鉴定
[0043] 形态学方面的鉴定：观察菌株的培养性状、菌丝、分生孢子和产孢器等特征。
[0044] 哈茨木霉菌在PDA培养基上菌落深厚、致密，初期为白絮状，后为暗绿色或绿色，背面呈黄色或浅绿色。分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，有2～3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形。菌丝纤细无色，具分隔，多分枝；分生孢子多为球形、2～2.9×1.9～2.6μm，单孢，在小梗上聚集成球状。
[0045] 3、菌株的筛选
[0046] 哈茨木霉菌在遗传、生态及生物学等方面具有多样性，同种真菌的不同菌株对防治目标的致病力差异显著，菌株不同，其LD50、LT50可相差数倍至数十倍。高产优质菌株的筛选与获得是取得较好防治效果的首要前提。以常用的致病力、产孢量、孢子萌发率等3个指标为筛选菌株的依据，筛选优良的哈茨木霉菌菌株。
[0047] （1）供试菌株的处理
[0048] 经纯化后获得的哈茨木霉菌A、B、C、D、E、F共6个分离株，在PDA平板于26 ± 1 ℃的恒温箱（14L：10D）中培养。
[0049] （2）供试病原菌
[0050] 将核盘菌接入PDA平板中，放置于26 ± 1 ℃恒温箱中培养，待产生菌丝后用直径为5 mm的打孔器取新鲜菌丝块备用。
[0051] （3）产孢量的测定
[0052] 将6个分离株分别配制成1×106孢子/ml的分生孢子悬液，分别取1ml悬液滴入PDA培养基后涂匀，待1～2d长出菌丝后用直径为5mm的打孔器取新鲜菌丝块，接种于PDA平板上，然后置于培养箱中培养（L:D=14:10）。每个菌株5次重复。第8～10d加入 0.1%吐温－80无菌水并收集孢子，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，使孢子充分分散，制成孢子悬浮液，用血球记数板记数测定产孢量。
[0053] 6个分离株的产孢量见表1，生长8 10d后，分离株A、E的产孢量与B、C、D分离株之间~的产孢量差异显著，其中E分离株的产孢量最高。
[0054] 表1 哈茨木霉菌6个分离株的产孢量（8 10d） ~
分离株 产孢量（分生孢子/mL）
A 4.51 ± 0.07×109 a
B 4.07 ± 0.09×109bc
C 4.16 ± 0.09×109 b
D 3.69 ± 0.11×109 c
E 4.75 ± 0.16×109 a
F 4.27 ± 0.20×109 ab
分离株 产孢量（分生孢子/mL）
A 4.51 ± 0.07×109 a
B 4.07 ± 0.09×109bc
C 4.16 ± 0.09×109 b
D 3.69 ± 0.11×109 c
E 4.75 ± 0.16×109 a
F 4.27 ± 0.20×109 ab
[0055] 注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著（DMRT法）。
[0056] （4）孢子萌发率的测定
[0057] 将6个分离株分别培养5d后，用无菌水收集孢子并制成悬液，用载玻片萌发法试验。将孢子悬液滴在无菌载玻片上，置于底部铺有滤纸的培养皿内，在皿内滴加3～4滴无菌水保湿（100，RH），培养24h后镜检，计算孢子萌发率（孢子萌发率%=萌发的孢子数/总孢子数×100%）。每个处理3次重复。
[0058] 6个分离株中，E分离株与其它分离株之间的分生孢子萌发率差异显著（见表2）。其中E分离株的孢子平均萌发率最高，A分离株的孢子萌发率最低。
[0059] 表2 哈茨木霉菌6个分离株分生孢子萌发率（24h） 分离株 孢子数量 萌发率(%)M±SE
A 512 61.1 ± 0.2 c
B 523 81.9 ± 2.2 ab
C 611 84.7 ± 1.8 b
D 540 71.6 ± 1.8 b
E 613 89.7 ± 1.0 a
F 791 77.0 ± 0.9 b
A 512 61.1 ± 0.2 c
B 523 81.9 ± 2.2 ab
C 611 84.7 ± 1.8 b
D 540 71.6 ± 1.8 b
E 613 89.7 ± 1.0 a
F 791 77.0 ± 0.9 b
[0060] 注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著（DMRT法）。
[0061] （5）哈茨木霉菌分离株的粗毒素对核盘菌的抑菌率测定
[0062] 将6个分离株的孢子用0.05%的吐温-80无菌水配制成浓度为1×108孢子/mL的孢子悬液，然后取2 ml加入200 ml的Czapek培养液中，在26 ± 1℃、200 rpm条件下振荡培养5d；将等体积的乙酸乙酯加入带有菌丝的培养液中抽提其中的真菌毒素，2天后取有机相浓缩获得哈茨木霉毒素，将连续3次抽提浓缩的毒素合并后放入-20℃冷冻备用。将8个分离株的粗毒素分别稀释后加入PDA培养基中配制成浓度为0、5 mg/L的PDA平板。将核盘菌接种到PDA平板上，待菌丝长满平板后取核盘菌的菌丝块（）放入带有毒素的PDA平板中央，放置于
26 ± 1℃恒温箱中培养，第24、48 h测菌丝生长直径，计算抑菌率。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。
26 ± 1℃恒温箱中培养，第24、48 h测菌丝生长直径，计算抑菌率。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。
[0063] 结果如表3所示，所有E分离株的抑菌率与其它分离株相比差异显著，其抑菌率明显高于其它分离株。在第24、48 h时E分离株对核盘菌的抑菌率最强，平均分别为67.8 %和64.5 %，B分离株的抑菌率较低，为51.6 % / 49.9 %（24 / 48 h）。
[0064] 表3 哈茨木霉菌6个分离株的粗毒素对核盘菌的抑菌率
[0065]
[0066] 注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著（DMRT法）。
[0067] （6）哈茨木霉菌对多菌灵的抗药性测定
[0068] 将6个分离株分别培养5 d后，用浓度为5 mg/L多菌灵的无菌水收集孢子并制成悬液，用载玻片萌发法试验。将孢子悬液滴在无菌载玻片上，置于底部铺有滤纸的培养皿内，在皿内滴加3～4滴无菌水保湿（100，RH），培养24h后镜检，计算孢子萌发率（孢子萌发率 % = 萌发的孢子数/总孢子数×100 %）。每个处理3次重复。将多菌灵加入PDA培养基中配制成浓度为5 mg/L的PDA平板。将哈茨木霉菌的孢子涂布到PDA平板上，待菌丝长满平板后取哈茨木霉菌的菌丝块（）放入带有浓度为0、5 mg/L多菌灵的PDA平板中央，放置于26 ± 1℃恒温箱中培养，第24、48h测菌落生长直径，计算菌丝生长抑制率，抑制率（%）=（（对照区菌落生长直径－处理区菌落生长直径）/对照区菌落生长直径）×100 %。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。
[0069] 结果如表4所示，多菌灵对E菌株的孢子萌发率无影响（表2中没有加入多菌灵时的孢子萌发率为89.7 %），多菌灵对B、C、E分离株菌丝生长抑制率与其它分离株相比差异显著，多菌灵对B、C、E分离株菌丝生长抑制率明显低于其它分离株。在第24h时多菌灵对E分离株菌丝生长抑制率最低、为4.6 %，多菌灵对A分离株菌丝生长抑制率较高，为13.0%（24 h）。
[0070] 表4哈茨木霉菌对多菌灵的抗药性测定 分离株 孢子萌发率（%）M±SE（24h） 菌丝生长抑制率（%）M±SE（24h）
A 57.9 ± 1.5 c 13.0 ± 0.3 a
B 72.8 ± 0.2 b 7.8 ± 0.1 b
C 79.8 ± 1.3 ab 6.8 ± 0.1 b
D 66.5 ± 3.5 bc 11.5 ± 0.7 a
E 85.6 ± 0.4 a 4.6 ± 0.2 c
F 65.0 ± 1.1 bc 9.8 ± 0.2 ab
A 57.9 ± 1.5 c 13.0 ± 0.3 a
B 72.8 ± 0.2 b 7.8 ± 0.1 b
C 79.8 ± 1.3 ab 6.8 ± 0.1 b
D 66.5 ± 3.5 bc 11.5 ± 0.7 a
E 85.6 ± 0.4 a 4.6 ± 0.2 c
F 65.0 ± 1.1 bc 9.8 ± 0.2 ab
[0071] 注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著（DMRT法）。
[0072] （7）哈茨木霉菌分离株的筛选结果
[0073] 在筛选优良分离株时，抗多菌灵、致病性和产孢量的高低是重要的参考指标，孢子萌发率次之。
[0074] 综上研究结果显示， E分离株与其它分离株之间在抗多菌灵、孢子萌发率、产孢量和致病性等方面差异显著。综合比较各方面的因素，E分离株为最佳分离菌株。
[0075] 4、最佳分离菌株的分子鉴定，以ITS1和ITS4为引物，扩增菌株基因组中的rDNA-ITS序列，然后在GENBANK中进行BLAST比对分析。
[0076] 将分离株接种于Czapek培养液中，于26±1℃、200rpm条件下培养，2～3天后收获菌丝，采用CTAB法抽提菌丝的基因组DNA，以菌株的基因组DNA为模板，以ITS1 （序列如SEQ ID NO:2所示）和ITS4 （序列如SEQ ID NO:3所示）为引物扩增rDNA-ITS区的序列片段，并测序后进行BLAST比对分析。
[0077] 其中，PCR反应体系（25 ul）：Taq酶0.25 ul、10 x buffer 2.5 ul、dNTP 0.2 ul、10 umol/L的Primer各1 ul、ddH2O 19.05 ul、DNA模板25 ng。PCR扩增程序：94℃预变性
1min、55℃退火1 min、72℃延伸1 min、共30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，回收目标DNA片段后连接到pMD18-T载体后送样测序。
1min、55℃退火1 min、72℃延伸1 min、共30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，回收目标DNA片段后连接到pMD18-T载体后送样测序。
[0078] 对所测序列进行BLAST比对，分析表明，所检测的序列与GENBANK中哈茨木霉Trichoderma harzianum（Hypocrealixii）的GU934533序列的相似性为99.8%，说明所检测序列为哈茨木霉菌的序列，该菌株为哈茨木霉菌，序列如SEQ ID NO.1所示。
[0079] 经过分子鉴定，确定该菌株为哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum），属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科。
[0080] 将该菌株命名为Th-N5菌株，并于2016年5月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌种保藏号为CCTCC No:M2016251，分类命名号为：Trichoderma harzianum Th-N5；保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0081] 实施例2 哈茨木霉菌Th-N5的粗毒素对核盘菌的致病力测定
[0082] 1、生物测定是检测生防真菌对目标病原菌的致死程度和致死速率的有效手段之一，能为综合评价该真菌的生物防治潜力提供重要的参考依据。本发明就所述的哈茨木霉菌Th-N5的粗毒素对核盘菌的致病力进行测定，以筛选在防治时所用的最佳浓度。
[0083] 供试菌株：哈茨木霉菌Th-N5菌株，核盘菌。
[0084] （1）供试菌株粗毒素和核盘菌菌丝块的制备
[0085] 取纯化后的哈茨木霉菌Th-N5菌株的孢子用0.05%的吐温-80无菌水配制成浓度为1×108分生孢子/mL的孢子悬液，然后取2ml加入200ml的Czapek培养液中，在26±1℃、
200rpm条件下振荡培养5d，将等体积的乙酸乙酯加入带有菌丝的培养液中抽提其中的真菌毒素，2天后取有机相浓缩获得哈茨木霉毒素，将连续3次抽提浓缩的毒素合并后放入-20℃冷冻备用。
200rpm条件下振荡培养5d，将等体积的乙酸乙酯加入带有菌丝的培养液中抽提其中的真菌毒素，2天后取有机相浓缩获得哈茨木霉毒素，将连续3次抽提浓缩的毒素合并后放入-20℃冷冻备用。
[0086] 将核盘菌接入PDA平板中，放置于26 ± 1 ℃恒温箱中培养，待菌丝长满平板后用直径为5 mm的打孔器取新鲜菌丝块备用。
[0087] （2）粗毒素对核盘菌抑菌率的测定
[0088] 将粗毒素稀释后加入培养基中配制成浓度为0、2、4、8、16、32ppm的PDA平板。将核盘菌的菌丝块（）放入带有毒素的PDA平板中央，放置于26±1℃恒温箱中培养，第24、48h后测菌丝生长直径，计算抑菌率。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。
[0089] 2、结果
[0090] 表5为各处理区粗毒素的抑菌率，结果表明，随着粗毒素浓度的增加对核盘菌的抑菌率增加，同一浓度下随着时间的增加，其对核盘菌的抑菌率减弱。
[0091] 表5 不同浓度的Th-N5菌株粗毒素对核盘菌的抑菌率测定 浓度（ppm） 抑菌率(%)M±SE（24h） 抑菌率(%)M±SE（48h）
1 19.1 ± 0.5 e 17.4 ± 0.9 e
2 33.3 ± 2.6 d 31.6 ± 2.2 d
4 53.7 ± 2.6 c 51.9 ± 1.7 c
8 85.2 ± 2.3 b 82.5 ± 2.6 b
16 100.0 ± 0.0 a 96.9 ± 0.4 a
1 19.1 ± 0.5 e 17.4 ± 0.9 e
2 33.3 ± 2.6 d 31.6 ± 2.2 d
4 53.7 ± 2.6 c 51.9 ± 1.7 c
8 85.2 ± 2.3 b 82.5 ± 2.6 b
16 100.0 ± 0.0 a 96.9 ± 0.4 a
[0092] 注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著（DMRT法）。
[0093] 另外，经过测定，哈茨木霉菌Th-N5菌株对桑实杯盘菌（Ciboria shiraiana）、肉阜状杯盘菌（Ciboria carunculoides）和核地杖菌（Scleromitula shiraiana）都有较好的抑菌效果。
[0094] 实施例3 哈茨木霉菌Th-N5菌株与低浓度多菌灵混合防治桑葚白果病
[0095] 1、方法
[0096] 供试菌株与多菌灵：哈茨木霉菌Th-N5菌株，多菌灵购自广东省农科院植保研究所。
[0097] （1）供试菌株孢子悬浮液与多菌灵混合液的制备
[0098] 经纯化后获得的哈茨木霉菌Th-N5菌株，在PDA平板上放入25±1℃的恒温箱（14L：10D）中培养5天，加入0.3%吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌
20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后配成1×107孢子/ml的孢子液备用。将多菌灵加入配成1×107孢子/ml的孢子液中配制成浓度为0、25、50和100 mg/L的混合液备用（多菌灵折算为原药的含量）。
20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后配成1×107孢子/ml的孢子液备用。将多菌灵加入配成1×107孢子/ml的孢子液中配制成浓度为0、25、50和100 mg/L的混合液备用（多菌灵折算为原药的含量）。
[0099] （2）哈茨木霉菌Th-N5与低浓度多菌灵混合对桑葚白果病的防治
[0100] 选择生长和管理水平一致的2年生盆栽桑树为实验对象，桑树品种为大十，将36颗桑树随机分成12个小区，每个小区3颗树、小区四周有4m的保护地带。
[0101] 试验共设7个处理：
[0102] 1）分别为0（清水）、；
[0103] 2）25 mg/L / 50 mg/L / 100 mg/L的多菌灵；
[0104] 3）1×107孢子/ml的哈茨木霉孢子悬浮液；
[0105] 4）25 mg/L的多菌灵+1×107孢子/ml的哈茨木霉孢子悬浮液；
[0106] 5）50 mg/L的多菌灵+1×107孢子/ml的哈茨木霉孢子悬浮液。
[0107] 每个处理2次重复，共12个小区。每个小区在桑树的花期按常规方法喷雾施药，统一于2016年3月1日、3月8日、3月15日、3月22日、3月29日、4月5日、4月12日按方案将药物喷到桑树的花及附近的枝条上。防治用药期间气温为8～22℃，喷药当天无雨，如喷药后下雨则雨停后重新喷药。在5月10日进行桑葚白果病的调查，每棵树随机调查3根枝条，记录每根枝条的总果数和病果数，计算防治效果。防治效果（%）=（（对照组发病率－处理组的发病率）/对照组的发病率）×100%。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。
[0108] 2、结果
[0109] 如表6所示，哈茨木霉菌Th-N5菌株与低浓度多菌灵混合使用，对桑葚白果病的防效可达到100%，实现病害的彻底控制，而且大大降低了化学农药多菌灵的用量。
[0110] 表6 不同处理区桑葚白果病的防治效果比较 处理 平均发病率（%） 防治效果（%）
0（水） 42.2 ± 1.6 a
25 mg/L 28.6 ± 1.8 b 32.2 ± 1.8 c
50 mg/L 14.5 ± 0.7 c 65.6 ± 0.7 b
100 mg/L 0.0±0.0 d 100.0±0.0 d
1×107 7.0 ± 1.6 d 83.3 ± 1.5 ab
25+(1×107) 2.0 ± 0.3 d 95.3 ± 1.4 a
50+(1×107) 0.0±0.0 d 100.0±0.0 d
0（水） 42.2 ± 1.6 a
25 mg/L 28.6 ± 1.8 b 32.2 ± 1.8 c
50 mg/L 14.5 ± 0.7 c 65.6 ± 0.7 b
100 mg/L 0.0±0.0 d 100.0±0.0 d
1×107 7.0 ± 1.6 d 83.3 ± 1.5 ab
25+(1×107) 2.0 ± 0.3 d 95.3 ± 1.4 a
50+(1×107) 0.0±0.0 d 100.0±0.0 d
[0111] 注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著（DMRT法）。
[0112] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。