撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体T145S

摘要

本发明涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及一种撒丁岛梭菌7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体T145S，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的7α‑羟基类固醇脱氢酶的第145位氨基酸由Thr变为Ser所得。该突变体对底物TCDCA和NADP+的催化效率是野生型的4.85倍，在生物转化CDCA/TCDCA获取UDCA/TUDCA的过程中具有巨大的应用潜力。

权利要求

1.一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的7α-羟基类固醇脱氢酶的第145位氨基酸由Thr变为Ser所得。

2.编码权利要求1所述的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.一种表达盒，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。

5.一种载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因或权利要求4所述的表达盒。

6.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求2所述的基因或权利要求4所述的表达盒或权利要求5所述的载体。

7.一种制备权利要求1所述的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的方法，其特征在于，在能够成功诱导蛋白表达的条件下培养权利要求6所述的重组细胞并分离得到撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体。

8.一种催化剂，其特征在于，其有效成分包含权利要求1所述的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体。

9.根据权利要求8所述的催化剂，其特征在于，还包括与权利要求1所述的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体同时使用时能够提高酶催化效率或增加酶稳定性的其它试剂。

10.一种实现化学物质的羰基不对称还原的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体或权利要求8或9所述的催化剂与反应底物在15-

37℃、pH 6.0-11.0条件下进行催化反应。

说明书

撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体T145S

技术领域

[0001] 本发明涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体T145S。

背景技术

[0002] 羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性还具有高度的立体选择性。羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介导的酶促反应具有相对严格的立体选择性和“不”严格的底物特异性。例如，早在二十世纪八十年代初科学家就已经开始尝试利用微生物产生的7α-、7β-HSDH联合差向异构转化鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)合成熊去氧胆酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)，转化的过程如图1所示。而游离酶还可以催化结合态胆汁酸——牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)转化为牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)。

[0003] HSDH的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道HSDH还可以催化烷基取代单环酮类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。HSDH所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化领域具有较大应用潜力。然而，活性更高的HSDH改造体是其在生物转化领域进一步应用的基本保障。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-、7β-HSDH在生物转化领域所具有的巨大应用潜力。目前，GenBank中登记的功能已经确认的7α-HSDH共有5个，它们分别来自于Bacteroides fragilis、Clostridium scindens、Clostridium sordellii、Clostridium absonum和Escherichia coli；来自Clostridium absonum和Collinsellaaerofaciens的7β-HSDH基因也已经成功被克隆。上述双酶偶联构建的生物转化体系不但克服了辅酶循环难题，还实现了氧化、还原“一锅式”进行特定化学区域的羟基差向异构。

[0004] 酶的活性较低是限制其工业应用的主要因素之一，几乎所有的天然酶都需要经过改造后才能达到工业应用的要求。其中，撒丁岛梭菌7α-HSDH(Clostridium absonum7α-HSDH，CA 7α-HSDH)具有悠久的研究历史和广阔的应用前景。加之该酶的晶体结构已经解析，所以通过理性改造的方式获得催化效率显著提高的突变体具有重要意义。

发明内容

[0005] 为满足上述领域存在的需求，本发明提供一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，具有更高的催化效率，可用于多种底物的生物转化，在工业生产中有巨大的应用价值。

[0006] 本发明请求保护的技术方案如下：

[0007] 一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的7α-羟基类固醇脱氢酶的第145位氨基酸由Thr变为Ser所得。

[0008] 编码上述撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。

[0009] 所述基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0010] 一种表达盒，其特征在于，包含上述基因。

[0011] 一种载体，其特征在于，包含上述基因或表达盒。

[0012] 一种重组细胞，其特征在于，包含上述基因或表达盒或载体。

[0013] 一种制备上述撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的方法，其特征在于，在能够成功诱导蛋白表达的条件下培养上述重组细胞并分离得到撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体。

[0014] 一种催化剂，其特征在于，其有效成分包含上述撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体。所述催化剂，其特征在于，还包括与上述撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体同时使用时能够提高酶催化效率或增加酶稳定性的其它试剂。

[0015] 一种实现化学物质的羰基不对称还原的方法，其特征在于，使用上述撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体或任一上述催化剂与反应底物在15-37℃、pH 6.0-11.0条件下进行催化反应。

[0016] 本发明首先从一级结构至高级结构多角度多层系比较了野生型CA 7α-HSDH与同源酶蛋白的异同，确定了影响CA 7α-HSDH酶学性质的位点为第145位氨基酸——苏氨酸。然后通过密码子替换将苏氨酸变为丝氨酸，并利用全基因合成技术获得了CA 7α-HSDH T145S突变体的基因。最后通过构建突变体基因的GST融合表达载体并导入基因工程菌E.coli BL21中诱导表达，获得了CA 7α-HSDH T145S突变体酶蛋白。通过测定不同底物浓度下的酶促反应初速度，利用米氏方程计算得到了CA 7α-HSDH野生型和T145S突变体的酶促动力学参数。结果表明，T145S突变体对底物TCDCA和NADP+的催化效率是野生型的4.85倍，该突变体在生物转化CDCA/TCDCA获取UDCA/TUDCA的过程中具有巨大的应用潜力。

[0017] 本发明提供的载体，可以是克隆载体，包含CA 7α-HSDH T145S突变体基因和质粒复制所需的其它元件；也可以是表达载体，包含CA 7α-HSDH T145S突变体基因和能够使蛋白成功表达的其它元件。在一些实施例中，所述表达载体为插入了CA 7α-HSDH T145S突变体基因的pGEX-6p-1载体。

[0018] 本发明提供的重组细胞，可以是包含克隆载体的重组细胞，例如E.coli DH5α，通过培养细胞使细胞内的CA 7α-HSDH T145S突变体基因复制；也可以是包含表达载体的细胞，在适当的条件下培养细胞，例如，加入适量的IPTG，16℃诱导CA 7α-HSDH T145S突变体蛋白的表达。

[0019] 本发明提供一种催化剂，其有效成分包括CA 7α-HSDH T145S突变体。所述催化剂也可以与其它适合的催化剂同时使用，从而提高酶催化效率或者在同一反应体系中先后进行两种催化反应。

[0020] 本发明的CA 7α-HSDH T145S突变体，在15-37℃、pH 6.0-11.0的反应条件下能够催化TCDCA C7α-羟基的羰基不对称还原反应。其最适反应温度为37℃，最适pH值为10.5。

附图说明

[0021] 图1.7α-、7β-HSDH联合转化CDCA制备UDCA示意图。

[0022] 图2.撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体T145S的SDS-PAGE电泳图；

[0023] 其中，M为蛋白质分子量标准(Marker)；1为T145S突变体蛋白。

[0024] 图3.NADPH的标准曲线；

[0025] 其中，横坐标为NADPH溶液的浓度，纵坐标为每个浓度的NADPH溶液在340nm处的光吸收值。

具体实施方式

[0026] 下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

[0027] 主要试剂：

[0028] pGEX-6p-1为已知载体，本实验室保存；

[0029] E.coli BL21细胞为本实验室保存；

[0030] Lysis buffer，配制而得，10mM pH7.3的PBS含有PMSF 0.1mM、亮肽素Leupeptin 0.5mg/mL；

[0031] Glutathione Sepharose 4B，购买自GE Healthcare，货号：10223836；

[0032] PreScission Protease，购买自GenScript公司，货号：Z02799-100；

[0033] BCA试剂盒，购买自Beyotime公司，货号：P0006；

[0034] TCDCA，购买自百灵威科技公司，货号：330776；

[0035] 以下实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得。

[0036] 实施例1.撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的制备

[0037] 1.突变体基因合成

[0038] 原始序列：密码子优化后的野生型CA 7α-HSDH基因序列(参见专利CN102827848A公布文本)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

[0039] 通过从一级结构至高级结构的多角度多层系比较野生型CA 7α-HSDH与同源酶蛋白的异同，确定了影响酶学性质的位点为野生型CA 7α-HSDH的第145位氨基酸，所述氨基酸为苏氨酸，对应的核苷酸序列为第433-435位密码子。

[0040] 将野生型CA 7α-HSDH基因序列的第433-435处密码子由ACT更改为AGT，将原来的苏氨酸替换成丝氨酸，得到CA 7α-HSDH突变体，命名为CA 7α-HSDH T145S突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0041] 在CA 7α-HSDH T145S突变体基因序列的5’端引入酶切位点BamHI，3’端引入酶切位点NotI，用于通过双酶切反应和连接反应将CA 7α-HSDH T145S突变体基因插入pGEX-6p-1载体中的相应位点，然后送Sangon Biotech公司进行全基因合成并进行测序验证。Sangon Biotech公司直接提供的CA 7α-HSDHT145S/pGEX-6p-1的质粒和CA7α-HSDHT145S/pGEX-6p-
1/DH5α甘油菌。

[0042] 2.酶蛋白的GST融合异源表达

[0043] (1)质粒转化E.coli BL21细胞

[0044] a.-80℃中取出BL21感受态细胞E.coli冰上放置。

[0045] b.加入纯化后的表达质粒pGEX-6p-1/CA 7α-HSDH T145S2μL，冰上放置30min。

[0046] c.热休克42℃，90s。

[0047] d.冰上放置2min。

[0048] e.复苏，加入600μL LB培养基，37℃，150rpm，45min。

[0049] f.吸取200μL培养基涂布于Amp+LB平板培养基中。

[0050] g.37℃培养过夜。

[0051] (2)蛋白表达与纯化

[0052] a.将菌种接种入无菌LB培养基中，氨苄青霉素终浓度为50μg/mL，37℃，180rpm培养。

[0053] b.待OD600≈0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃诱导过夜(12h)。8000rpm，5min收集菌体。

[0054] c.按1L培养体系加30mL Lysis buffer的比例重悬菌体，超声破菌至澄清。12000rpm，20min。取上清。

[0055] d.上清与Glutathione Sepharose 4B结合，填料使用的比例为每升培养体系使用5mL填料，4℃结合2h。轻轻垂直颠倒混悬。

[0056] e.结合完毕后，500rpm，5min沉淀填料。填料用4℃预冷PBS冲洗3-5个柱体积。

[0057] 去除杂蛋白。

[0058] f.加入PreScission Protease酶切缓冲液，加入PreScission Protease酶。

[0059] g.4℃酶切过夜。酶切完毕后，将上清从层析柱中放出。

[0060] h.将所得样品进行SDS-PAGE，鉴定其分子量大小及纯度、BCA试剂盒测试纯化蛋白的浓度。

[0061] 结果如图2所示，SDS-PAGE检测结果显示T145S突变体可溶性表达成功，并且经一步亲和层析后蛋白的条带单一。

[0062] 实施例2.T145S突变体酶促动力学参数测定

[0063] 1.NADPH标准曲线的制作

[0064] 利用反应缓冲液(50mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH 8.0)分别配制0.1、0.2、0.3和0.4mM的NADPH溶液。用上述空白溶剂调零后将各个浓度的NADPH溶液分别加入2mL比色皿中，在340nm测定光吸收值OD340。以NADPH溶液的浓度为横坐标，对应的光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

[0065] 结果如图3所示，获得的标准曲线方程式为y＝2.7868x-0.0002，R2＝0.9999。

[0066] 2.酶活测定

[0067] 在2mL容积的比色皿中依次加入958μL反应缓冲液(50mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH 8.0)、20μL 50mM的NADP+、2μL实施例1制备得到的CA 7α-HSDH T145S突变体(2.46mg/mL)，调零后加入20μL 50mM的底物TCDCA。酶促动力学数据测定时，底物的终浓度的变化范围为0.1-10mM。

[0068] 于25℃，在340nm处记录1min内的光吸收变化，并根据NADPH的标准曲线计算产物的生成量。通过米氏方程(公式1)等号两侧取双倒数(公式2)通过Lineweaver-Burk双倒数作图法得到Km、kcat；并通过比较kcat/Km值来衡量突变体的催化效率变化。

[0069]

[0070]

[0071] 结果如表1所示，CA 7α-HSDH T145S突变体催化TCDCA转变为牛磺-7-酮石胆酸(T-7-KLCA)的效率是野生型CA 7α-HSDH的4.85倍。

[0072] 表1.野生型CA 7α-HSDH与T145S突变体催化TCDCA的酶促动力学参数[0073]