一种用于检测血清中SOD的胶乳增强免疫比浊法试剂盒

摘要

本发明公开了一种定量检测人血清中SOD胶乳增强免疫比浊试剂盒。试剂盒中包含试剂R1、试剂R2和校准品；其中试剂R1包含缓冲溶液、电解质、反应增强剂、稳定剂和防腐剂；试剂R2包含抗SOD抗体致敏胶乳颗粒、缓冲溶液、电解质、稳定剂、表面活性剂和防腐剂；校准品中包含缓冲溶液、稳定剂、防腐剂以及SOD重组蛋白；本发明利用多克隆抗体包被胶乳颗粒结合胶乳增强免疫比浊的方法优势，使得本发明试剂盒具有灵敏度高、准确性好、线性范围宽泛、高通量检测的优点，非常适合临床诊断应用。

权利要求

1.一种用于定量检测人血清中SOD的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征是该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品；

其中，试剂R1的组分及浓度：

试剂R1配制方法：分别将7.55g Na2HPO4.12H2O，1.21g KH2PO4，60g Nacl，1g NaN3，30g PEG6000，6ml小牛血清按顺序依次加入到装有500ml超纯水的烧杯中，置于磁力搅拌器上低速搅拌，待完全溶解后调pH至7.4，加超纯水定容至1L；

试剂R2的组分及浓度：

试剂R2配制方法：①试剂R2中缓冲溶液的配制：分别取12.1g Tris，5g BSA，1g NaN3，

0.001LTween20依次加入到0.8L超纯水中，置于磁力搅拌器上低速搅拌至完全溶解，调pH至

8.0，加超纯水定容至1L；②试剂R2中致敏胶乳的配制：将640μL 155nm胶乳颗粒加入到1ml pH为7.4浓度为50mM的MES缓冲溶液中，再加入511μL浓度为30mg/ml的EDAC活化15min，向活化好的胶乳颗粒中加入320μL 5mg/ml的抗SOD抗体，交联120min后，离心去上清③用8ml上述配制好的R2缓冲溶液将离心得到的致敏胶乳颗粒重悬得到试剂R2。

2.根据权利要求1所述试剂盒，试剂R2中的抗SOD抗体选自抗SOD多克隆抗体；抗体与胶乳颗粒交联的时间为120min。

3.根据权利要求2所述试剂盒，试剂R2中的胶乳颗粒选自JSR；胶乳颗粒直径为155nm；

胶乳颗粒最终质量浓度为0.4％。

4.根据权利要求1所述试剂盒，校准品中的SOD优选自Fitzgerald公司的SOD重组蛋白；

缓冲溶液优选pH7.2浓度为50mM PBS缓冲溶液；保护剂为质量浓度0.2％的牛血清白蛋白；

防腐剂为质量浓度0.05％的庆大霉素。

说明书

一种用于检测血清中SOD的胶乳增强免疫比浊法试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种采用胶乳增强免疫比浊法定量检测人体 血清中SOD的试剂盒。

背景技术

[0002] 超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是一种广泛存在于生物体内的金属酶它是 生物体内特异性清除自由基的首要物质。超氧阴离子自由基(O2-)是机体不同反应产生的重要 的自由基，在病理情况下，自由基产生过多，就会引起DNA蛋白质和脂类等生物大分子的 损伤，引起机体发生多种疾病。

[0003] SOD通过催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应，清除超氧阴离子自由基(O-2)对 机体的作用。通过SOD水平的高低可反映机体内自由基的含量，两者在人体中的含量呈负相 关。目前临床上已经将测定SOD的活性作为心脑血管疾病、肝病、肺病、风湿性疾病、癌症 等疾病的诊断和疗效评价的辅助指标。

[0004] 胶乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immune-assay，PETIA)是一种 发生在均相液体中的免疫反应，具有良好的特异性和稳定性等优点，近年来被广泛的应用于 临床诊断领域。其反应原理是将抗体或抗原包被到高分子胶乳颗粒上，与样本中相应抗体或 抗原发生免疫反应，形成凝集颗粒，乳胶颗粒上抗原与溶液中抗体结合使反应混合系统形成 一定浊度，浊度增加的程度与样本中被检物浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定， 即可测出样本中被检物的含量。

[0005] 目前市售的SOD检测试剂盒多是利用邻苯三酚自氧化比色法，该方法由产生超氧自 由基的系统和检测O2-的系统所组成。该方法具有操作简便，快速，试剂便宜且用量小等优点； 但在实际应用中该方法受反应物浓度、温度、pH值等条件影响较大，因此造成了不同条件下 测定结果混乱、缺乏可比性且重复性差。另外利用该方法的某些检测试剂成分中含有毒性物 质二甲胂酸钠，长期使用该试剂，不利于检测人员的健康。

发明内容

[0006] 本发明针对上述方法存在的不足，提供一种检测人体血清中SOD的胶乳增强免疫比 浊试剂盒，该试剂盒具有检测准确、稳定性佳、重复性好、线性范围宽泛的特点，同时能够

[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 所述的SOD检测试剂盒其特征在于包括试剂R1，试剂R2和校准品，其中试剂R1 中包含缓冲溶液、电解质、反应增强剂、稳定剂、防腐剂，其作用是提供本发明试剂与样本 反应的最适反应环境，控制反应达到终点的时间和速率。试剂R2中包含抗SOD抗体致敏胶 乳颗粒、缓冲溶液、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂，其作用是提供一种能够储存包 被有抗SOD抗体的胶乳颗粒并使其稳定的最适环境。校准品中包含缓冲溶液、稳定剂、防腐 剂以及SOD重组蛋白。

[0009] 所述R1试剂中的反应缓冲溶液为PBS缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、MES缓冲溶液、 Hepes缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液或DIPSO缓冲溶液中的一种或几种，优选 PBS缓冲溶液或Hepes缓冲溶液，缓冲溶液pH值应在7.0～8.0之间，优选pH7.2～7.4，缓 冲溶液浓度在10～200mM之间，优选120～140mM。

[0010] 所述R1试剂中电解质为氯化钠、氯化钾或碳酸钠中的一种，优选氯化钠，电解质浓 度在900～2400mM之间，优选1000～1027mM。

[0011] 所述R1试剂中反应增强剂为PEG6000、PEG8000和PEG12000中的一种，优选 PEG6000，反应增强剂含量在1％～10％之间，优选2％～3％。

[0012] 所述R1试剂中稳定剂为小牛血清、牛血清白蛋、明胶中的一种，优选牛血清白蛋白， 稳定剂含量在0.35％～1％之间，优选0.5％～0.6％。

[0013] 所述R1试剂中防腐剂为Proclin-300、NaN3、庆大霉素中的一种，优选NaN3，防腐 剂含量在0.01～0.5％之间，优选0.2％～0.1％。

[0014] 所述R2试剂中的胶乳颗粒为Merck、JSR、Bangslab公司中的一种，优选JSR，胶 乳颗粒直径为50～200nm之间，优选100～155nm，胶乳颗粒终浓度在0.1％～0.5％之间，优 选0.3％～0.4％，抗SOD抗体为抗SOD单克隆抗体或抗SOD多克隆抗体中的一种，优选抗 SOD多克隆抗体购自于Fitzgerald公司，货号为70R-15137，浓度优选在10～200μg/mg(抗 体：微球)之间，优选30～50μg/mg，抗体与胶乳颗粒交联的时间在30～200min之间，优 选100～
120min。

[0015] 所述R2试剂中抗SOD抗体致敏胶乳颗粒，抗体与胶乳交联方法为物理吸附或化学 交联，优选化学交联，活化剂为EDAC或NHS中的一种，优选EDAC，活化剂浓度在0.416～ 20.8mM之间，优选5～10mM，活化时间在10～30min之间，优选12～15min，交联活化缓 冲溶液为MES、PBS或Hepes中的一种，优选MES，缓冲液浓度为20～200mM之间，优选 40～50mM，缓冲溶液pH值应在7.0～8.0之间，优选pH7.2～7.4。

[0016] 所述R2试剂中反应缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳 酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，优选Tris-HCl缓冲液或甘氨酸缓冲液，缓冲溶 液pH值应在7.0～8.0之间，优选pH7.8～8.0，缓冲溶液的浓度在20～200mM之间，优选50～ 100mM。

[0017] 所述R2试剂中电解质为氯化钠、氯化钾或碳酸钠中的一种，优选氯化钾，电解质浓 度在800～2400mM之间，优选900～1000mM。

[0018] 所述R2试剂中的稳定剂为小牛血清、牛血清白蛋白、明胶中的一种，优选牛血清白 蛋白，浓度在0.1～5％之间，优选0.4～0.5％。

[0019] 所述R2试剂中的表面活性剂为Tween20、Tween40、Span40、Span80、TritonX-100 中的一种，优选TritonX-100或Tween20，浓度在0.1ml/L～5ml/L之间，优选0.5ml/L～1ml/L。

[0020] 所述R2试剂中防腐剂为叠氮钠、叠氮锂、亚硝酸钠中的一种，优选叠氮钠，浓度在 0.02％～0.1％之间，优选0.05％～0.1％。

[0021] 所述校准品中的SOD优选Fitzgerald公司的重组SOD蛋白，货号为30R-2714，缓冲 溶液优选pH7.2浓度为50mM的PBS缓冲溶液，保护剂为牛血清白蛋白或小牛血清中的一 种，优选牛血清白蛋白，含量在0.1～0.5％之间，优选0.2％，防腐剂为叠氮钠、叠氮锂、庆 大霉素中的一种，优选庆大霉素，含量在0.02％～0.1％之间，优选0.05％。

[0022] 本发明所述的SOD检测试剂盒波长在500～650nm之间，优选605nm波长。

[0023] 本发明所述的SOD检测试剂盒校准曲线采用数学模型Spline或Logit-log(4p)拟合绘 制校准曲线中的一种。

[0024] 本发明所述的SOD检测试剂盒，先将样本与试剂R1混匀后37℃温育1～5分钟然后 加入试剂R2，反应5分钟，记录反应3分钟后和5分钟后在605nm波长下的吸光度A1和 A2，计算吸光度差值，根据校准曲线计算出样本中SOD的含量。

附图说明

[0025] 图1所示是本发明所述试剂盒与对照试剂盒检测结果相关性比较。

[0026] 图2所示是本发明所述试剂盒线性范围相关性。

具体实施方式

[0027] 下面通过实施例进一步阐述本发明的技术手段、优点及功效，以下实施例旨在说明本 发明，但并不限定本发明的范围，相关领域的技术人员在没有背离本发明的主旨和范围内， 可对实施例进行更换和修改，但这些修改和更换均在本发明保护范围内。

[0028] 实施例1：

[0029] 检测血清中SOD的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备：

[0030] 配制所述发明试剂盒试剂R1的组分及浓度：

[0031]

[0032] 试剂R1配制方法：分别将7.55g Na2HPO4.12H2O，1.21g KH2PO4，60g Nacl，1g NaN3， 30g PEG6000，6ml小牛血清按顺序依次加入到装有500ml超纯水的烧杯中，置于磁力搅拌器 上低速搅拌，待完全溶解后调pH至7.4，加超纯水定容至1L。

[0033] 配制所述发明试剂盒试剂R2的试剂组分及浓度：

[0034]

[0035] 试剂R2配制方法：①试剂R2中缓冲溶液的配制：分别取12.1g Tris，5g BSA，1g NaN3， 0.001L Tween20依次加入到0.8L超纯水中，置于磁力搅拌器上低速搅拌至完全溶解，调pH 至8.0，加超纯水定容至1L；②试剂R2中致敏胶乳的配制：将640μL 155nm胶乳颗粒加入 到1ml pH为7.4浓度为50mM的MES缓冲溶液中，再加入511μL浓度为30mg/ml的EDAC 活化15min，向活化好的胶乳颗粒中加入320μL 5mg/ml的抗SOD抗体，交联120min后， 离心去上清③用8ml上述配制好的R2缓冲溶液将离心得到的致敏胶乳颗粒重悬即得到所述 发明试剂盒中试剂R2。

[0036] 配制SOD校准品的试剂组分及浓度：

[0037]

[0038] SOD校准品的配制方法：分别取2g BSA、0.5g庆大霉素溶于0.5L 1×PBS中，置于 磁力搅拌器上低速搅拌至完全溶解，调pH至7.2，加入1×PBS定容至1L，加入SOD纯品 5g，置于磁力搅拌器上低速搅拌至完全溶解，所得溶液分装于5ml管制瓶中，置于冻干机中 冻干。

[0039] 检测血清中SOD的胶乳增强免疫比浊试剂盒在全自动生化分析仪上的应用[0040] 分析方法：两点终点法

[0041] 反应方向：上升反应

[0042] 校准方式：Spline或Logit-log(4p)

[0043] 测定波长：605nm

[0044] 测定温度：37℃

[0045] 样本：R1:R2＝5:300:90(μL)

[0046] 操作步骤：将5μL检测样本加入到300μL试剂R1中，37℃孵育5分钟后加入90 μL试剂R2，3分钟后读取吸光度A1，5分钟后读取吸光度A2。

[0047] 采用6点定标法，用东芝-40全自动生化分析仪进行检测，校准品浓度分别为：171U/ml、 85.5U/ml、42.75U/ml、21.38U/ml、10.69U/ml、0U/ml

[0048] 实施例2：SOD试剂盒性能评价

[0049] 一、线性相关性

[0050] 用实施例1配制的本发明试剂盒B与市售SOD检测试剂盒A同时检测46份血清样 本，对这46例检测样本结果进行线性回归方程分析，计算两组试剂盒的线性相关性。结果见 图1(X,Y轴均为测定值，单位U/ml)，结果显示相关系数r＝0.9983，线性回归方程为：y＝ 0.9985x+0.5904,根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)文件要求(r>0.975)，本发明SOD 胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒与市售SOD检测试剂盒具有很好的相关性。实验数据如表1 所示，回归方程见附图1。

[0051] 表1

[0052]                                      单位：U/mL 样本号 A B 样本号 A B1 15.32 15.18 23 99.23 93.59
2 15.83 16.74 24 106.26 98.61
3 16.55 16.70 25 109.74 113.32
4 17.20 17.63 26 118.05 112.32
5 18.30 17.24 27 126.49 129.34
6 19.01 18.23 28 132.34 142.80
7 19.98 18.99 29 145.60 148.72
8 20.55 19.44 30 148.88 147.41
9 21.31 21.71 31 156.27 159.31
10 21.81 21.92 32 163.18 157.53
11 22.76 21.52 33 174.61 169.80
12 23.20 23.60 34 180.26 174.17
13 23.94 25.23 35 189.52 193.75
14 24.91 25.49 36 195.20 190.31
15 27.98 26.62 37 205.68 195.06
16 37.63 35.70 38 210.82 220.51
17 44.11 41.69 39 222.34 213.08
18 55.27 48.98 40 224.78 227.76
19 60.45 61.64 41 235.58 243.54
20 67.35 66.50 42 241.69 235.98
21 70.97 78.89 43 245.03 244.43
22 81.45 82.63 44 249.91 242.83
23 87.28 90.03 45 249.67 258.27

[0053] 二、线性范围相关性实验

[0054] 将SOD重组蛋白配制成550U/ml的高值样本，用生理盐水将其稀释为275U/ml、137.5 U/ml、68.75U/ml、34.78U/ml、17.19U/ml、3.43U/ml，6个稀释浓度浓度的样本，按照试剂 盒检测方法测进行检测，每个稀释浓度重复测试3次，求出测定结果的均值(yi)。以稀释浓度 (xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。经过计算可知回归系数r为 0.9987，前四个测量点的相对偏差在1％～9％范围内，测量点5和6时线性绝对偏差在±6。 数据见表2，回归方程见附图2。

[0055] 表2

[0056]                                   单位：U/mL[0057]

[0058] 三、准确度

[0059] 用发明试剂盒对具有溯源性的质控进行三次检测，求出平均值，与质控靶值进行比对， 计算相对偏差。结果表明，检测结果均值接近靶值，相对偏差位8.1％，准确度较好。结果见 表3。

[0060] 表3

[0061]                                      单位：U/mL

[0062]

[0063] 四、重复性

[0064] 选择一个高值标本和一个低值标本，用发明试剂盒分别测定高值标本和低值标本，分 别重复测10次，计算试剂盒检测样本测量值的平均值 标准差(s)和变异系数(CV)。 计算结果如表4所示：检测结果表明，发明试剂盒检测高值、低值样本变异系数分别为：3.71％， 5.71％，重复性较好。数据见表4。

[0065] 表4

[0066]                                 单位:U/mL

[0067]

[0068] 五、分析灵敏度

[0069] 以5％人血清白蛋白作为空白样本，按照发明试剂盒的检测方法，对空白样本进行20 次重复测定，计算20次检测结果平均值 为3.6U/ml，标准差SD为4.1U/ml，根据公式计算得到本试剂盒SOD检测试剂盒的分析灵敏度为11.8U/ml。