一种仿人骨材料的制备方法

摘要

本发明涉及一种仿人骨材料的制备方法，属于生物医学材料技术应用领域。该多孔材料以明胶为原料，加蒸馏水搅拌均匀得到明胶水溶液，通过模具将该溶液挤压成型，制备出具有规则直通孔相结合的多孔支架。随后将该支架在戊二醛溶液中交联，在SBF溶液中矿化，得到含有钙和磷的无机盐的明胶多孔支架。所述明胶多孔支架具有规则直通孔，孔径分布在300‑450μm。孔隙率在50%‑95%范围内；所述明胶多孔支架轴向抗压强度达到12‑14MPa，横向抗压强度达到7‑9 MPa。本发明工艺简单，便于操作，产量稳定；该方法制备出的支架细胞毒性合格，成骨效果良好，具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种仿人骨材料的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）配制质量百分比浓度为0.1%~0.3%的Ca(OH)2溶液，按200g/L~400g/L的比例在Ca(OH)2溶液中加入明胶颗粒，然后按100ml/L 150ml/L的比例加入质量百分比浓度为1%-6%~的丙三醇，待明胶颗粒完全溶于水中后，将溶胶放在室温下静置10 30 min后倒入挤压容器~中静置冷却，得到溶胶A；

（2）将溶胶A进行挤压成型，然后放入无水乙醇中脱水，得到式样B；

（3）将式样B放入戊二醛溶液中交联，然后取出置于蒸馏水中清洗，在空气中干燥得到式样C；

（4）将式样C放置在人体体液模拟液，然后置于37.5℃的恒温培养箱中静置14-30天，每

2 4天换一次液，矿化结束的样品用去离子水清洗、干燥后得到仿人骨材料。

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2.根据权利要求1所述仿人骨材料的制备方法，其特征在于：步骤（3）中的清洗过程为：取出式样置于蒸馏水中浸泡2-6次，每次10-30min。

3.根据权利要求1所述仿人骨材料的制备方法，其特征在于：步骤（3）中戊二醛溶液的质量百分比浓度为1-10wt%，交联时间为6-24 h。

4.根据权利要求1所述仿人骨材料的制备方法，其特征在于：步骤（3）中干燥的温度为

40-60℃。

说明书

一种仿人骨材料的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种仿人骨材料的制备方法，属于生物医用材料技术运用领域。

背景技术

[0002] 众所周知，自然骨组织主要是由以HAP为主要成分的无机相和以胶原为主的有机相组成的。所以，仿制人骨的材料也应该以这两种材料为标准，选取尽可能与人骨成分结构相似的材料。在骨支架材料中，将羟基磷灰石与天然高分子材料相结合制备有机-无机复合材料，能够结合天然高分子材料与羟基磷灰石矿物的优点。天然高分子材料中，胶原是骨组织的主要有机物，而明胶是胶原蛋白经部分变性或化学处理水解得到的天然产物。它具有优良的物理化学性能，如亲水性强、能够形成凝胶、侧链基因反应活性高、便于化学改性等。由于这些优点，明胶被广泛应用于各种领域。同时，它具有很好的生物相容性和降解性且价格低廉、来源广泛，所以可用作组织工程支架。而羟基磷灰石无论在硬骨还是软骨中的应用都体现出良好的生物相容性，并且作为骨细胞外基质的主要的组成成分之一，具有良好的骨传导和骨结合性能及高的力学强度。然而，人工合成的羟基磷灰石的断裂韧性较低、脆性较大，韧性不足及力学性能差，使其在承重骨方面的应用方面受到限制。为了解决这些问题，近年来人们特别重视研究和开发各种羟基磷灰石复合材料，以改善羟基磷灰石生物材料的力学性能和生物学性能。

[0003] 对生物矿化的研究表明，在整个生物矿化过程中，界面分子识别过程起着至关重要的作用。在一定的条件下，有机基质通过自组装形成模板，该模板在为无机矿物提供结构框架的同时，通过与无机离子在界面上静电匹配、几何相似性和立体化学互补等来控制矿物的成核和生长，从而控制生物矿物材料的结构和性能。生物矿化方法可有效控制晶体的形貌及结构。

[0004] 从仿生学的角度来看，聚合物调控仿生矿化所制备的聚合物-羟基磷灰石复合材料在成分和结构上都类似于天然骨组织。之前已经讨论过了材料的选择，需要将有机明胶与羟基磷灰石相结合。并且论述过了通过有机基质如胶原是能够引导合成羟基磷灰石的，况且明胶材料是能够代替胶原作为生物矿化的有机大分子基体的。

[0005] 目前的天然高分子材料/羟基磷灰石复合材料的制备一般都是将羟基磷灰石粉末与高分子聚合物的水溶液相混合，由于此类粉末是不易溶于水的，这就导致了大部分的生物活性羟基磷灰石都被包埋在了聚合物的内部，在体外进行培养或是植入缺损部位无法与细胞有效地接触。并且聚合物大都具有一定的黏度，物理上的混合容易导致羟基磷灰石粉末的团聚，影响到了骨支架的结构。并且在接近生理条件的环境下，避免高温或者使用有机溶剂，通过聚合物在水溶液中控制无机矿物的仿生沉积是材料科学方面的一个重要的研究领域。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种仿人骨材料的制备方法，具体包括以下步骤：

[0007] （1）配制质量百分比浓度为0.1%~0.3%的Ca(OH)2溶液，按200g/L~400g/L的比例在Ca(OH)2溶液中加入明胶颗粒，然后100ml/L~150ml/L的比例加入质量百分比浓度为1%-6%的丙三醇，待明胶颗粒完全溶于水中后，将溶胶放在室温下静置至黏度增加时倒入挤压容器中静置冷却，得到溶胶A；

[0008] （2）将溶胶A进行挤压成型，然后放入无水乙醇中脱水，得到式样B；

[0009] （3）将式样B放入戊二醛溶液中交联，然后取出置于蒸馏水中清洗，然后在空气中干燥得到式样C；

[0010] （4）将式样C放置在人体体液模拟液（SBF模拟体液）中，然后置于37.5℃的恒温培养箱中静置14-30天（即矿化时间），每2 4天换一次液，矿化结束的样品用去离子水清洗、干~燥后得到仿人骨材料。

[0011] 优选的，本发明步骤（1）中静置至黏度增加的时间为10 30 min。~

[0012] 优选的，本发明步骤（3）中的清洗过程为：取出式样置于蒸馏水中浸泡2-6次，每次10-30min。

[0013] 优选的，本发明步骤（3）中戊二醛溶液的质量百分比浓度为1-10wt%，交联时间为6-24 h。

[0014] 优选的，本发明步骤（3）中干燥的温度为40-60℃。

[0015] 本发明制备得到的仿人骨材料具有规则直通孔，孔径分布在300-450μm。孔隙率在50%-95%范围内。该多孔支架轴向抗压强度达到12-14MPa，横向抗压强度达到7-9 MPa。

[0016] 本发明的有益效果：

[0017] （1）本发明采用挤压成型法制备出以明胶为原料的多孔支架材料，该材料能满足骨组织工程要求的孔洞结构和孔隙大小，能够提供一个组织生长的三维支架结构。

[0018] （2）本发明采用体外仿生矿化的方法，构建出与人体生理环境相似的条件，并模拟人骨在体内的矿化，尝试在明胶的基体表面原位合成与自然骨中的生物矿物质相接近的羟基磷灰石晶体，构建仿骨有机-无机复合材料。

附图说明

[0019] 图1是实施例2中制备的明胶多孔支架的SEM图片。

具体实施方式

[0020] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

[0021] 本发明所述人体体液模拟液（SBF模拟体液）由常规方法及常规原料配制得到。本发明实施例中所述SBF模拟体液由以下方法配制得到：量取800ml的去离子水作为缓冲液，并放在水浴锅中加热到35℃-37℃，通过搅拌器不断搅拌溶液，并用PH计不断测量实时的PH值，当PH达到6.5-7.5时依次加入8g NaCl粉末、0.35g NaHCO3粉末、0.2g KCl粉末、0.2g K2HPO4*3H2O粉末、0.3g MgCl2*6H2O粉末，1.0mol/ml的 HCl 30ml，0.3g CaCl2粉末，0.1g Na2SO4粉末；再分批少量加入6g TRIS（CH2OH）3CNH2粉末，用HCl溶液使PH稳定在7.0左右，直到TRIS（CH2OH）3CNH2粉末全部加完为止；最后定容到1000ml定量瓶中，待溶液温度降到室温后滴加去离子水到刻度线即得到人体体液模拟液。

[0022] 实施例1

[0023] 本实施所述的一种原位合成仿人骨材料及其制备方法具体步骤包括：

[0024] （1）将0.01g Ca（OH）2加入到10ml蒸馏水中，置于磁力搅拌器上加热至40℃左右，再向上述溶液中加入2g的明胶颗粒，加入浓度为2%丙三醇1ml作为润滑剂，恒温搅拌。待明胶颗粒完全溶于水中后，将溶胶放在室温下静置（10min）至黏度有明显增加的时候倒入30ml的针管中静置冷却，得到溶胶A。

[0025] （2）将溶胶A进行挤压成型，每挤出3cm长的支架后用细铁丝切下，并将切下的样品直接放入无水乙醇中脱水，得到式样B。

[0026] （3）将式样B切割成3x3的小支架，将小支架放入浓度为10%的戊二醛溶液中交联6h后，取出置于蒸馏水中浸泡6次，每次10min，清洗完后放在滤纸上空气干燥，得到式样C。

[0027] （4）将式样C放置在50ml的塑料离心管中，每支离心管添加30ml的SBF模拟体液，然后置于37.5℃的恒温培养箱中静置30天，每三天换一次液，对矿化结束的样品用去离子水小心清洗，置于60℃的干燥箱中干燥，得到最终支架材料。

[0028] 本实施例通过对该明胶支架的轴向抗压强度和横向抗压强度进行测定，表明轴向抗压强度和横向抗压强度分别为11.52MPa，7.56 MPa；对其孔隙率进行测定，表明孔隙率为75%。

[0029] 实施例2

[0030] 本实施所述的一种原位合成仿人骨材料及其制备方法具体步骤包括：

[0031] （1）将0.02g Ca（OH）2加入到10ml蒸馏水中，置于磁力搅拌器上加热至40℃左右，再向上述溶液中加入3.5g的明胶颗粒，加入浓度为4%丙三醇1ml作为润滑剂，恒温搅拌。待明胶颗粒完全溶于水中后，将溶胶放在室温下静置（20min）至黏度有明显增加的时候倒入30ml的针管中静置冷却，得到溶胶A。

[0032] （2）将溶胶A进行挤压成型，每挤出3cm长的支架后用细铁丝切下，并将切下的样品直接放入无水乙醇中脱水，得到式样B。

[0033] （3）将式样B切割成3x3的小支架，将小支架放入浓度为5%的戊二醛溶液中交联12h后，取出置于蒸馏水中浸泡3次，每次20min，清洗完后放在滤纸上空气干燥，得到式样C。

[0034] （4）将式样C放置在50ml的塑料离心管中，每支离心管添加30ml的SBF模拟体液，然后置于37.5℃的恒温培养箱中静置25天，每三天换一次液，对矿化结束的样品用去离子水小心清洗，置于40℃的干燥箱中干燥，得到最终支架材料。

[0035] 本实施例通过对该明胶支架的轴向抗压强度和横向抗压强度进行测定，表明轴向抗压强度和横向抗压强度分别为13.50MPa，8.5 MPa。对其孔隙率进行测定，表明孔隙率为85%。本实施例中制备的明胶支架的SEM图片如图1所示，由图可看出，该多孔支架具有规则直通孔的孔洞结构，孔径为300-450um。

[0036] 实施例3

[0037] 本实施所述的一种原位合成仿人骨材料及其制备方法具体步骤包括：

[0038] （1）将0.03g Ca（OH）2加入到10ml蒸馏水中，置于磁力搅拌器上加热至40℃左右，再向上述溶液中加入4g的明胶颗粒，加入5%丙三醇1ml作为润滑剂，恒温搅拌。待明胶颗粒完全溶于水中后，将溶胶放在室温下静置（30min）至黏度有明显增加的时候倒入30ml的针管中静置冷却，得到溶胶A。

[0039] （2）将溶胶A进行挤压成型，每挤出3cm长的支架后用细铁丝切下，并将切下的样品直接放入无水乙醇中脱水，得到式样B。

[0040] （3）将式样B切割成3x3的小支架，将小支架放入浓度为1%的戊二醛溶液中交联24h后，取出置于蒸馏水中浸泡5次，每次30min，清洗完后放在滤纸上空气干燥，得到式样C。

[0041] （4）将式样C放置在50ml的塑料离心管中，每支离心管添加30ml的SBF模拟体液，然后置于37.5℃的恒温培养箱中静置14天，每三天换一次液，对矿化结束的样品用去离子水小心清洗，置于30℃的干燥箱中干燥，得到最终支架材料。

[0042] 本实施例通过对该明胶支架的轴向抗压强度和横向抗压强度进行测定，表明轴向抗压强度和横向抗压强度分别为14.50MPa，9.47 MPa。对其孔隙率进行测定，表明孔隙率为90%。

[0043] 根据国家标准GB/T14233.3-2005，采用选用293T细胞（转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞）、CCK-8法对实施例1制备的多孔磷酸钙/明胶复合支架材料进行细胞毒性测试，实验结果如表1所示。结合国家标准GB/T14233.3-2005相关规定，细胞毒性结果表明，支架浓度在0.1-0.2g/ml时，细胞增殖度均在145-165之间，细胞毒性为0级。由此说明实施例1所制备的多孔磷酸钙/明胶复合支架材料无细胞毒性。

[0044] 表1明胶支架的细胞增殖度