一种虾青素亚油酸单酯的制备方法

摘要

本发明公开了一种虾青素亚油酸单酯的制备方法，包括以下步骤：步骤一、粗提液的制备：用天平称取5.0 g雨生红球藻藻粉，加入纤维素酶液，破壁，离心，弃上清后，丙酮浸提，再次离心后，弃去下层沉淀，制得粗提液；步骤二、溶剂系统的建立：配制正己烷‑乙腈‑甲醇一级溶剂系统和配制正己烷‑甲醇二级溶剂系统；步骤三、高速逆流色谱纯化：在474nm波长下采集数据，首先以所述一级溶剂系统为实验条件，收集洗脱时间为12‑20min的组分，再以二级溶剂系统为实验条件，收集洗脱时间为52‑60min的组分，制得化合物，即虾青素亚油酸单酯。本发明首次采用高速逆流色谱纯化法从雨生红球藻藻粉分离得到了虾青素亚油酸单酯，从而对后续虾青素酯的研究具有重大意义。

权利要求

1.一种虾青素亚油酸单酯的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、粗提液的制备：

用天平称取5.0g雨生红球藻藻粉，加入浓度为0.5-0.7mg/mL的纤维素酶液200mL，酶反应pH为4.0-5.0，在45-50℃的条件下破壁25-30min，然后在5000rpm条件下离心5min，弃上清后，将500mL的丙酮加入藻粉中，浸提40min，再次离心后，弃去下层沉淀，制得粗提液；将所述粗提液浓缩蒸干，充氮，于-20℃条件下保存，备用；

步骤二、溶剂系统的建立：

按体积比4∶1∶2配制正己烷-乙腈-甲醇一级溶剂系统和按体积比2∶1配制正己烷-甲醇二级溶剂系统；每个溶剂系统分别按照上述比例配制溶液1500mL，置于分液漏斗中，剧烈振荡充分混合后静置分层，平衡后将上下两相分开，两个溶剂系统均以下相作为流动相，上相作为固定相，在使用前上下相分别超声脱气30min；

步骤三、高速逆流色谱纯化：

打开泵，将超声脱气后的上相作为固定相以30mL/min的流速泵入到高速逆流色谱仪中，直至上相充满整个HSCCC分离管中，暂停泵，将进液端放到流动相的试剂瓶中，打开主机的电源，设定转速850r/min，启动泵；在出液端用干净的量筒接液，在474nm波长下采集数据，首先以所述一级溶剂系统为实验条件，收集洗脱时间为12-20min的组分，再以二级溶剂系统为实验条件，将该组分溶解在二级溶剂系统的下相中，收集洗脱时间为52-60min的组分，初步用TLC分析流出物，合并相同组分，制得化合物，即虾青素亚油酸单酯；

步骤四、纯化物的鉴定：

采用高效液相色谱HPLC法或采用ESI-MS法分析所述化合物，或采用高效液相色谱HPLC法分析皂化后的所述化合物。

2.如权利要求1所述的一种虾青素亚油酸单酯的制备方法，其特征在于：所述采用高效液相色谱HPLC法：将所述化合物配成2mg/mL的样品溶液，高效液相的条件：进样量5μL，柱温

35℃，检测波长474nm，流速0.2mL/min；分析所述化合物的保留时间和特征吸收峰，判断所述化合物的保留时间是否为47.5min，特征吸收峰是否为476nm。

3.如权利要求1所述的一种虾青素亚油酸单酯的制备方法，其特征在于：所述ESI-MS法采用正离子模式；参数设置如下：氮气干燥流量10.0L/min，雾化压力为20psi，毛细管电压+

5000V，端板电压+4000V，毛细管出口电压80V，干燥温度200℃，雾化室温度50℃，干燥气体压力20psi，雾化气体压力50psi；判断一级质谱m/z是否为m/z 859.8和m/z 881.8。

4.如权利要求1所述的一种虾青素亚油酸单酯的制备方法，其特征在于：采用高效液相色谱HPLC法分析皂化后的所述化合物：将所述化合物12.5mg溶解在150mL的二氯甲烷溶液中，作为每组试验的样品溶液，然后加入含质量体积浓度为15.6％的NaOH的甲醇溶液，在磁力搅拌条件下，15.14℃温度下反应9.17min后，终止反应；加入蒸馏水直至溶液出现分层，上层漂浮有白色泡沫，下层呈红色的澄清溶液，离心弃去上清后，将下层溶液完全蒸干得到皂化产物，用HPLC法分析产物的保留时间和特征吸收峰，判断皂化后的所述述化合物的保留时间是否为13.2min。

5.如权利要求1所述的一种虾青素亚油酸单酯的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，加入浓度为0.6mg/mL的纤维素酶液200mL，在50℃的条件下破壁30min。

说明书

一种虾青素亚油酸单酯的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物制剂技术领域，尤其涉及一种虾青素亚油酸单酯的制备方法。

背景技术

[0002] 雨生红球藻是一种广泛分布于自然界的淡水藻，属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。雨生红球藻通常只有处于胁迫条件时才开始积累虾青素，以渡过不利的环境条件。关于雨生红球藻积累虾青素的营养盐及环境条件的研究表明，当其处于氮饥饿、高光强等条件下时，能够大量积累虾青素。近年来，光生物反应器技术的发展大大促进了雨生红球藻的养殖及虾青素的积累，应用这种技术可使藻体中虾青素含量达到干重的1.5-3％。

[0003] 从雨生红球藻中提取虾青素的方法多种多样，欧阳琴等对雨生红球藻厚壁孢子细胞的几种常用机械破壁方法的工艺条件分别进行研究，分别比较了几种不同破壁方法对破壁率和虾青素提取率的影响，结果表明高压均质法最适合于雨生红球藻中厚壁孢子的破碎和虾青素的提取，氯仿:乙醇(1:1，v/v)的混合溶剂最有利于从雨生红球藻孢子态细胞中提取出虾青素。Dong等人比较了4种不同的方法从雨生红球藻中提取虾青素，结果表明盐酸破壁后用丙酮提取的得率最高，且这种方法得到的粗提物的DPPH自由基清除能力也最高。周锦珂以雨生红球藻粉为原料利用纤维素酶对雨生红球藻进行酶解处理，然后用乙醇提取虾青素，在最佳条件下虾青素的提取率高达94.6％。

[0004] 虾青素末端环状结构中各有一个羟基(-OH)，这种自由羟基可与脂肪酸形成酯，雨生红球藻中的虾青素多数以酯的形式存在。如果其中一个羟基与脂肪酸成酯，称虾青素单酯；如果两个羟基都与脂肪酸成酯，则称为虾青素双酯。在鱼类吸收和色素沉积方面，虾青素酯和游离虾青素在生物利用方面差别很小。由于能够与虾青素酯化形成虾青素单酯和双酯的脂肪酸种类繁多，而且虾青素酯的极性比虾青素更小，且各类虾青素酯的结构极性相近，很难将单独一种虾青素酯分离纯化出来；采用传统柱层析法分离纯化虾青素酯，耗时长且得率很低，不利于大量制备纯的虾青素酯。因此，对虾青素酯分离纯化的研究鲜见报道。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种虾青素亚油酸单酯的制备方法，本案由此产生。

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种虾青素亚油酸单酯的制备方法。

[0006] 为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

[0007] 一种虾青素亚油酸单酯的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 步骤一、粗提液的制备：

[0009] 用天平称取5.0g雨生红球藻藻粉，加入浓度为0.5-0.7mg/mL的纤维素酶液200mL，酶反应pH为4.0-5.0，在45-50℃的条件下破壁25-30min，然后在5000rpm条件下离心5min，弃上清后，将500mL的丙酮加入藻粉中，浸提40min，再次离心后，弃去下层沉淀，制得粗提液；将所述粗提液浓缩蒸干， 充氮，于-20℃条件下保存，备用；

[0010] 步骤二、溶剂系统的建立：

[0011] 按体积比4:1:2配制正己烷-乙腈-甲醇一级溶剂系统和按体积比2:1配制正己烷-甲醇二级溶剂系统；每个溶剂系统分别按照上述比例配制溶液1500mL，置于分液漏斗中，剧烈振荡充分混合后静置分层，平衡后将上下两相分开，两个溶剂系统均以下相作为流动相，上相作为固定相，在使用前上下相分别超声脱气30min；

[0012] 步骤三、高速逆流色谱纯化：

[0013] 打开泵，将超声脱气后的上相作为固定相以30mL/min的流速泵入到高速逆流色谱仪中，直至上相充满整个HSCCC分离管中，暂停泵，将进液端放到流动相的试剂瓶中，打开主机的电源，设定转速850r/min，启动泵；在出液端用干净的量筒接液，在474nm波长下采集数据，首先以所述一级溶剂系统为实验条件，收集洗脱时间为12-20min的组分，再以二级溶剂系统为实验条件，将该组分溶解在二级溶剂系统的下相中，收集洗脱时间为52-60min的组分，初步用TLC分析流出物，合并相同组分，制得化合物，即虾青素亚油酸单酯。

[0014] 作为实施例的优选方式，还包括步骤四、纯化物的鉴定：采用高效液相色谱HPLC法或采用ESI-MS法分析所述化合物，或采用高效液相色谱HPLC法分析皂化后的所述化合物。

[0015] 作为实施例的优选方式，所述采用高效液相色谱HPLC法：将所述化合物配成2mg/mL的样品溶液，高效液相的条件：进样量5μL，柱温35℃，检测波长474nm，流速0.2mL/min；分析所述化合物的保留时间和特征吸收峰，判断所述述化合物的保留时间是否为47.5min，特征吸收峰是否为476nm。

[0016] 作为实施例的优选方式，所述ESI-MS法采用正离子模式；参数设置如下：氮气干燥流量10.0L/min，雾化压力为20psi，毛细管电压+5000V，端板电压+4000V，毛细管出口电压80V，干燥温度200℃，雾化室温度50℃，干燥气体压力20psi，雾化气体压力50psi；判断一级质谱m/z是否为m/z 859.8和m/z 881.8。

[0017] 作为实施例的优选方式，采用高效液相色谱HPLC法分析皂化后的所述化合物：将所述化合物12.5mg溶解在150mL的二氯甲烷溶液中，作为每组试验的样品溶液，然后加入含质量体积浓度为15.6％的NaOH的甲醇溶液，在磁力搅拌条件下，15.14℃温度下反应9.17min后，终止反应；加入蒸馏水直至溶液出现分层，上层漂浮有白色泡沫，下层呈红色的澄清溶液，离心弃去上清后，将下层溶液完全蒸干得到皂化产物，用HPLC法分析产物的保留时间和特征吸收峰，判断皂化后的所述述化合物的保留时间是否为13.2min。

[0018] 作为实施例的优选方式，所述步骤一中，加入浓度为0.6mg/mL的纤维素酶液200mL，在50℃的条件下破壁30min。

[0019] 本发明首次采用高速逆流色谱纯化法从雨生红球藻藻粉分离得到了虾青素亚油酸单酯，进一步采用 HPLC和ESI-MS技术鉴定纯化得到的化合物的结构，从而对后续虾青素酯的研究具有重大意义。

附图说明

[0020] 图1为本发明雨生红球藻中粗提物的HPLC分析图；

[0021] 图2为本发明的HSCCC溶剂系统纯化结果；

[0022] 图3为本发明的HSCCC二级溶剂系统纯化结果；

[0023] 图4为本发明HPLC和UVS分析HSCCC纯化得到的组分4结果；

[0024] 图5为本发明一级质谱分析HSCCC纯化得到的组分4结果；

[0025] 图6为本发明二级质谱分析组分4结果；

[0026] 图7为本发明HPLC分析皂化后的组分4结果。

具体实施方式

[0027] 本发明公开了一种虾青素亚油酸单酯的制备方法，包括以下步骤：

[0028] 步骤一、粗提液的制备：

[0029] 用天平称取5.0g雨生红球藻藻粉，雨生红球藻藻粉购于湖北雅仕达生物技术荆州市天然虾青素有限公司，加入浓度为0.5-0.7mg/mL的纤维素酶液200mL，酶反应pH为4.0-5.0，在45-50℃的条件下破壁25-30min，然后在5000rpm条件下离心5min，弃上清后，将
500mL的丙酮加入藻粉中，浸提40min，再次离心后，弃去下层沉淀，制得粗提液；将所述粗提液浓缩蒸干，充氮，于-20℃条件下保存，备用；步骤二、溶剂系统的建立：

[0030] 按体积比4:1:2配制正己烷-乙腈-甲醇一级溶剂系统和按体积比2:1配制正己烷-甲醇二级溶剂系统；每个溶剂系统分别按照上述比例配制溶液1500mL，置于分液漏斗中，剧烈振荡充分混合后静置分层，平衡后将上下两相分开，两个溶剂系统均以下相作为流动相，上相作为固定相，在使用前上下相分别超声脱气30min；

[0031] 高速逆流色谱法分离的效果，很大程度上取决于选择一个合适的两相溶剂体系，两相溶剂体系可以用分离系数K来定量测定。若K值太小，溶质将接近洗脱溶剂的前沿造成出峰时间太快，峰之间的分离度较差；当K值过大时，分离度较好但是出峰时间太长，并且峰形变宽，分离效率同样不高。因此实验中要试验不同的溶剂体系，从而在合适的时间内得到分离度很好的峰形。

[0032] 本文在选择溶剂系统的过程中，首先尝试了正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水这几种常见溶剂的的不同组成和配比，来满足合适的分离系数K。如表1所示，例如溶剂组成为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:1:1，v/v/v/v)和正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(6:3:2:5，v/v/v/v)的两种溶剂系统在试验后被排除，因为得到K值过大，并且保留率和分离效果也不好。在参考相关文献之后，考虑到虾青素酯的极性比虾青素更小，已不适用于有水的体系分离，因此更适合于非水溶剂体系进行分离。如表1中正己烷-二氯甲烷-丙酮溶剂体系，虽然极性较小，但当二氯甲烷加入后，由于几种溶剂极性相近和密度差的减小， 使上述溶液上下相混溶，不能很好地分层。通过对十余种不同有机溶剂的组成和比例的溶剂体系进行试验后，我们发现当加入乙腈时能使非水相的溶剂体系有很好的分层效果，最后选择溶剂比例为正己烷-乙腈-甲醇(4:1:2，v/v/v)作为一级溶剂系统，正己烷-甲醇(2:1，v/v)作为第二级溶剂系统来分离纯化虾青素酯。

[0033] 表1虾青素酯在不同两相溶剂系统中的分离系数K值

[0034]

[0035] 步骤三、高速逆流色谱纯化：

[0036] 打开泵，将超声脱气后的上相作为固定相以30mL/min的流速泵入到高速逆流色谱仪中，直至上相充满整个HSCCC分离管中，暂停泵，将进液端放到流动相的试剂瓶中，打开主机的电源，设定转速850r/min，启动泵；在出液端用干净的量筒接液，在474nm波长下采集数据，首先以所述一级溶剂系统为实验条件，收集洗脱时间为12-20min的组分；再以二级溶剂系统为实验条件，将该组分溶解在二级溶剂系统的下相中，收集洗脱时间为52-60min的组分，初步用TLC分析流出物，合并相同组分，制得化合物，即虾青素亚油酸单酯。

[0037] 作为实施例的优选方式，所述步骤一中，加入浓度为0.6mg/mL的纤维素酶液200mL，在50℃的条件下破壁30min。

[0038] 作为实施例的优选方式，还包括步骤四、纯化物的鉴定：采用高效液相色谱HPLC法或采用ESI-MS法分析所述化合物，或采用高效液相色谱HPLC法分析皂化后的所述化合物。

[0039] 由于已知的虾青素酯种类较多且与之酯化结合的脂肪酸鉴定比较困难，为进一步鉴定纯化得到的化合物是否为虾青素酯，需要对得到的化合物进行皂化实验，将虾青素酯皂化还原为虾青素，若皂化后产物在HPLC检测后，得到虾青素的特征吸收峰，则证明纯化得到的化合物为虾青素酯，反之，则为其他类胡萝卜素。

[0040] 作为实施例的优选方式，所述采用高效液相色谱HPLC法：将所述化合物配成2mg/mL的样品溶液， 高效液相的条件：进样量5μL，柱温35℃，检测波长474nm，流速0.2mL/min；分析所述化合物的保留时间和特征吸收峰，判断所述述化合物的保留时间是否为47.5min，特征吸收峰是否为476nm。

[0041] 雨生红球藻中粗提物各组分的HPLC分析结果如图1所示。其中数字1-6代表HSCCC分离得到的6个化合物，从图中可以看出，游离类胡萝卜素的保留时间为12-35min，虾青素单酯的保留时间集中在42-50min，而虾青素双酯的保留时间在55min之后。实验结果与各化合物的极性大小是相对应的，游离的类胡萝卜素，如虾青素、角黄素、叶黄素等的极性相对较大，因而洗脱时间较短；虾青素一端被酯化后，成为虾青素单酯，极性变小，洗脱时间相应的增加；虾青素两端被酯化后，变成虾青素双酯，分子极性进一步变小，洗脱时间最长。

[0042] 如图2所示，使用HSCCC溶剂体系，粗提物溶液分离纯化得到了4个组分，洗脱时间分别为22-27min、31-40min、102-104min、103-111min，分别将它们命名为化合物1、2、5、6(与图2中各个峰相对应)，并且发现分离得到峰A(12-20min)的量很大(25.51mg)，也当做一个组分收集以备下一步纯化。使用二级溶剂体系正己烷-甲醇(2:1，v/v)，将之前得到的峰A组分溶解在此溶剂体系的下相中，作为二级溶剂系统的样品溶液，继续纯化得到了化合物3和化合物4，结果如图3所示，洗脱时间分别为40-48min和52-60min。将上述纯化得到的化合物蒸干后称量，得到化合物1-6的质量分别为10.35mg、8.47mg、15.25mg、4.33mg、15.65mg、6.05mg。

[0043] 作为实施例的优选方式，所述ESI-MS法采用正离子模式；参数设置如下：氮气干燥流量10.0L/min，雾化压力为20psi，毛细管电压+5000V，端板电压+4000V，毛细管出口电压80V，干燥温度200℃，雾化室温度50℃，干燥气体压力20psi，雾化气体压力50psi；判断一级质谱m/z是否为m/z 859.8和m/z 881.8。

[0044] 作为实施例的优选方式，采用高效液相色谱HPLC法分析皂化后的所述化合物：将所述化合物12.5mg溶解在150mL的二氯甲烷溶液中，作为每组试验的样品溶液，然后加入含质量体积浓度为15.6％的NaOH的甲醇溶液，在磁力搅拌条件下，15.14℃温度下反应9.17min后，终止反应；加入蒸馏水直至溶液出现分层，上层漂浮有白色泡沫，下层呈红色的澄清溶液，离心弃去上清后，将下层溶液完全蒸干得到皂化产物，用HPLC法分析产物的保留时间和特征吸收峰，判断皂化后的所述述化合物的保留时间是否为13.2min。

[0045] 化合物4为红色固体粉末，在476nm波长处有最大的紫外吸收，HPLC分析化合物4的保留时间为47.5min，结果如图4所示；化合物4的一级质谱数据显示m/z 859.8和m/z 881.8的两个离子峰，结果如图5所示，分别为虾青素亚油酸单酯的分子离子峰[M+H]+和其加钠的离子峰[M+Na]+，进一步的二级串联质谱分析看到m/z 601.4的碎片离子为虾青素亚油酸单酯的加钠离子峰失去亚油酸后的离子碎片[M+Na-C18:2(280)]+，结果如图6所示；化合物4的皂化后的产物HPLC分析结果显示，皂化后在保留时间13.2min出现了虾青素的特征峰，结果如图7所示；由此可以鉴定化合物4是虾青素亚油酸单 酯。

[0046] 本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。