一种荧光纳米颗粒及其合成方法、应用

摘要

本发明涉及一种荧光纳米颗粒，由量子点和包覆于量子点外部的高分子共聚物所组成。由所得荧光纳米颗粒制备的新型纳米探针具有温度敏感且发光性质不受pH、离子强度影响的特点，解决了现有细胞内温度探测存在的问题。

权利要求

1.一种荧光纳米颗粒，其特征在于，由如下方法制得：取甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物，数均分子量为50,000，羧基基团质量分数：

1.0％，和CdSeS量子点分别溶解于四氢呋喃中，配制成丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物浓度为10mg/mL，量子点浓度为0.5mg/mL的四氢呋喃溶液；在搅拌下，将含有100μL共聚物溶液和

300μL量子点溶液的混合液滴加入5.0mL水中，继续搅拌10min；于30℃下蒸发除去四氢呋喃，离心分离，所得沉淀即为荧光纳米颗粒；所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为34nm；

zeta电位为-22.9±1.8mV。

2.权利要求1所述荧光纳米颗粒在制备纳米荧光生物探针或生物成像发光标记物中的应用。

3.一种溶胶，其特征在于，由权利要求1所述荧光纳米颗粒分散于水或缓冲溶液中所形成的；

其中，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液中的一种或多种。

说明书

一种荧光纳米颗粒及其合成方法、应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于温度探测的荧光纳米颗粒及其合成方法、应用。

背景技术

[0002] 温度是一个非常重要的物理参数，准确、灵敏的温度探测对于科学研究、工业生产都至关重要。例如，人生病发烧时往往伴随着体温的升高；肿瘤细胞的温度常常高于正常细胞的温度。因此，探测细胞的温度不仅有助于人们进一步了解细胞的新陈代谢规律，而且对于疾病预防、诊断等也具有重要的临床应用价值。

[0003] 细胞大多处于微米尺度，热电偶、热电阻及辐射温度计等传统温度计难以用于细胞的温度探测。为了测量微米级别的细胞温度，需要发展更小尺度的温度探测器。目前，研究人员已经发展了一系列纳米探针，用于细胞内的温度探测。这些纳米探针大多基于量子点、银纳米球、有机染料等纳米发光材料，当温度变化时，这些发光纳米材料的发射光谱发生移动或者发光强度改变大小或者荧光寿命发生改变，通过对上述光学信号变化的检测和“解码”，最终实现对细胞内的温度探测。

[0004] 然而，细胞内部环境十分复杂，纳米温度计的准确性、稳定性往往受到细胞内的pH、离子环境等生化因素的影响，其温度探测的准确性和可靠性受到很大的影响。细胞的胞内环境十分复杂，不同部位的生化环境，尤其是pH和离子强度，差异较大，例如：溶酶体内部的pH可达5，而细胞质的pH通常在7.0左右。并且活细胞的内环境是动态变化的，其pH和离子强度是高度变化的，某一时刻、某一部位的生化环境难以准确表征。而纳米探针的发光性质又往往受pH、离子强度的影响较大，当探测温度变化时，pH、离子强度等生化环境对温度探测的影响就难以避免；鉴于细胞内环境的复杂性和动态变化性，pH、离子强度等的影响又难以有效扣除。因此，发展温度敏感且发光性质不受pH、离子强度影响的新型纳米探针，就成为细胞温度探测领域亟需解决的技术难题。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种用于温度探测的荧光纳米颗粒，其制备的新型纳米探针具有温度敏感且发光性质不受pH、离子强度影响的特点，解决了现有细胞内温度探测存在的问题。

[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 一种荧光纳米颗粒，是由量子点和包覆于量子点外部的高分子共聚物所组成。

[0008] 本发明所述的荧光纳米颗粒中，所述高分子共聚物与所述量子点的质量比为0.1～500：1，优选0.1～100:1，更进一步优选0.1～10:1。

[0009] 本发明所述的荧光纳米颗粒中，所述高分子共聚物选自主链为碳氢链，侧基为羧基和疏水基团的高分子共聚物。

[0010] 本发明所述的荧光纳米颗粒中，所述高分子共聚物的数均分子量为3,000～100,000；所述高分子共聚物中羧基的质量百分数为0.01％～40％；所述疏水基团包括但不限于烷基、苯基、酯基中的一种或一种以上的任意组合。

[0011] 作为本发明优选的实施方式，所述高分子共聚物选自甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸-丙烯酸酯共聚物，马来酸烷基酯-马来酸共聚物，苯乙烯-甲基丙烯酸酯-丙烯酸三嵌段共聚物中的一种或多种。更优选为甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物或二者混合。

[0012] 本发明所述的荧光纳米颗粒中，所述量子点为能够在可见光和/或近红外光和/或紫外光激发下发射可见光或近红外光性能的量子点，优选Cd、Zn、In、Te、Ga、As等元素中的一种或多种。进一步包括但不限于由II-VI族或III-V族组成的两组份(如CdSe,CdTe,CdS，ZnSe，InP和InAs)、合金型(如CdSeS,CdTeS,CdZnSe)、核-壳型(如CdSe/ZnS，CdSeS/ZnS，CdTe/CdSe，InP/GaAs，CdSe/ZnTe)、核-壳-壳型(如CdTe/CdS/ZnS)量子点。

[0013] 本发明所述的荧光纳米颗粒的表面具有可供偶联生物分子的羧基，所述荧光纳米颗粒的粒径为10～200纳米。

[0014] 本发明还提供上述荧光纳米颗粒的制备方法，所述荧光纳米颗粒采用共沉淀包裹法制备得到，具体包括如下步骤：

[0015] (1)将量子点和高分子共聚物溶于能与水混溶的有机溶剂中，得到有机溶液；

[0016] (2)将步骤1)得到的有机溶液与水或缓冲溶液混合，得到溶胶；

[0017] (3)除去溶胶中的有机溶剂，离心分离后，所得沉淀即为荧光纳米颗粒。

[0018] 本发明所述的荧光纳米颗粒的制备方法中，步骤1)所述有机溶液中，所述量子点的浓度为1×10-4～10mg/mL，所述高分子共聚物的浓度为1×10-4～100mg/mL；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃中的一种或多种。

[0019] 本发明所述的荧光纳米颗粒的制备方法中，步骤2)中所述水的体积为所述步骤1)得到的有机溶液体积的1～1000倍。

[0020] 本发明所述的荧光纳米颗粒的制备方法中，步骤3)中除去溶胶中有机溶剂时可依据有机溶剂的性质而定去除蒸发温度。所述除去溶胶中有机溶剂的温度为4～100℃。

[0021] 本发明所述的荧光纳米颗粒的制备方法中，通过调变量子点、共聚物的质量比例以及有机溶剂可以很方便地对荧光纳米颗粒中量子点含量、颗粒尺寸等参数进行调控，使其获得更加优异的发光性能。。而荧光纳米颗粒表面羧基的含量可以通过改变共聚物组成控制。

[0022] 本发明还提供上述荧光纳米颗粒在制备纳米荧光生物探针或生物成像发光标记物中的应用。其中，为了更好的保证荧光纳米颗粒的品质以及便于操作，在具体应用中，可将荧光纳米颗粒分散于水或缓冲溶液中形成溶胶。

[0023] 本发明所述溶胶中，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液中的一种或多种。

[0024] 本发明以可在紫外光、可见光或近红外光下激发发光的量子点为基础，选择含有疏水侧基的共聚物与其配伍形成荧光纳米颗粒。由于含有疏水侧基和碳氢主链导致较强的位阻效应，使共聚物上的羧基无法与量子点表面有效配位。当将含有所述共聚物与量子点的有机溶液与水混合时，不溶于水的共聚物和量子点将发生共自组装，聚合物的强疏水部分和疏水量子点倾向与远离水，而聚合物中部分羧基则倾向暴露于表面并电离为羧酸根，使纳米颗粒表面荷负电。由于纳米颗粒尺寸较小且表面荷负电，因此本发明的荧光纳米颗粒在水和缓冲溶液中具有优异的分散稳定性。

[0025] 由上述可知，本发明荧光纳米颗粒中高分子共聚物具有较宽的选择范围，对共聚物碳氢链上的疏水侧基进行简单的代换，均在本发明的保护范围内。

[0026] 本发明所述技术方案具有如下优点：

[0027] 1、具有优异的发光性能。本发明的荧光纳米颗粒不受细胞内环境的复杂性和动态变化性，pH、离子强度等的影响，保持了量子点发射峰窄、Stocks位移大、荧光寿命长的优点，可应用于细胞的温度探测。在水和缓冲溶液中对激发光和发射光散射能力弱，发光亮度高。

[0028] 2、稳定性好。由于所用共聚物具有两亲性，当荧光纳米颗粒分散在水或缓冲溶液中时，量子点分散于高分子基质材料的疏水环境中，避免了水分子以及水溶液中的其他成分与其作用。本发明荧光纳米颗粒表面含有羧基，使其在水溶液及一些缓冲溶液中具有很好的分散稳定性，分散于水中的荧光纳米颗粒表面带负电，有利于减少生物分析中的非特异性吸附，同时具有很好的耐光、热稳定性。在激发光长时间照射的条件下，其发光强度下降幅度小于10％。

[0029] 3、本发明所述荧光纳米颗粒的制备方法为共沉淀包裹法，该方法简便、可控性强，解决了具有优良可见光和近红外光激发发光性能性能量子点的纳米包埋问题，使其优异的发光性能在纳米粒子中得以基本保持或进一步提高。

[0030] 4、本发明所述荧光纳米颗粒表面的羧基可用于生物分子的键合以制备性能优异的纳米荧光探针。具有灵敏度高、穿透深度大、对生物样品损伤小等特点。此外，各种抗原、抗体、酶、DNA、RNA，如免疫球蛋白IgG，甲胎蛋白AFP等均可采用本发明所提供的荧光纳米颗粒进行标记。标记后获得的纳米荧光生物探针可以用于细胞内温度探测，也可用于生物分析，例如高灵敏荧光免疫分析，生物荧光成像以及生物芯片等。

附图说明

[0031] 图1为实施例1制备的以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于CdSeS量子点的荧光纳米颗粒的粒径分布图(动态光散射法测定，纳米粒子粒径分布范围为31～39nm，平均粒径34nm)。

[0032] 图2为实施例1制备的荧光纳米颗粒的透射电镜照片。

[0033] 图3为实施例1制备的荧光纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱和光致发光谱。

[0034] 图4为实施例1制备的荧光纳米颗粒的荧光激发谱(发射波长λem＝519nm)。

[0035] 图5为实施例2制备的以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质材料，基于CdSeS量子点的荧光纳米颗粒的粒径分布图(动态光散射法测定，纳米粒子尺寸范围35～46nm，平均粒径38nm)。

[0036] 图6为实施例2制备的荧光纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱和光致发光谱。

[0037] 图7为实施例3制备的荧光纳米颗粒的粒径分布(动态光散射法测定，纳米粒子粒径分布范围为45～56nm，平均粒径48nm)。

[0038] 图8为实施例4制备的荧光纳米颗粒的粒径分布(动态光散射法测定，纳米粒子粒径分布范围为55～66nm，平均粒径58nm)。

[0039] 图9为实施例13中纳米荧光粒子的细胞毒性评价。

[0040] 图10为实施例14中对Lewis细胞的荧光成像图，A为明场成像图，B为荧光成像图(激发波长λex＝405nm)。

[0041] 图11为实施例15中a)在各种温度下纳米探针(P-QDs)的发光强度；b)纳米探针(P-QDs)的发光强度随温度变化的线性关系。

[0042] 图12为实施例15中a)所制备纳米探针(P-QDs)在各种pH下的实物图(上)及其相对发光强度(下)；b)所制备纳米探针(P-QDs)在不同离子强度下的实物图(上)及其相对发光强度(下)；c)所制备纳米探针(P-QDs)在25℃和37℃温度切换时的稳定性；d)所制备纳米探针(P-QDs)温度探测与热电偶温度计探测的温度对比。

具体实施方式

[0043] 为了更具体地说明本发明，现给出若干实施例，但本发明所涉及的内容并不仅仅局限于这些实施例。

[0044] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，实施例中所用试剂均可商购获得。实施例中所用CdSeS或CdSeS/ZnS量子点是专利ZL 200610163308.3中公开的量子点。其它种类的量子点均为商购获得。

[0045] 实施例1、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于CdSeS量子点的荧光纳米颗粒的制备

[0046] 取甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量为50,000，羧基基团质量分数：1.0％)和CdSeS量子点分别溶解于四氢呋喃中，配制成丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物浓度为10mg/mL，量子点浓度为0.5mg/mL的四氢呋喃溶液。在搅拌下，将含有100μL共聚物溶液和300μL量子点溶液的混合液滴加入5.0mL水中，继续搅拌10min。于30℃下蒸发除去四氢呋喃，离心分离，所得沉淀即为荧光纳米颗粒；将所得沉淀重新分散于纯水中，制得所述表面含羧基的荧光纳米颗粒的溶胶。

[0047] 如图1所示，动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为34nm，粒径分布范围31～39nm。荧光纳米颗粒透射电子显微镜照片如图2所示，此类荧光纳米颗粒呈球形，电镜照片中纳米粒子粒径分布和动态光散射测试结果相吻合。

[0048] 图3为所制备的荧光纳米颗粒溶胶的紫外-可见吸收光谱和光致发光谱，由图中可以看到，荧光纳米颗粒在可见光区和紫外区均有较强的吸收，其主要吸收峰位于460nm,荧光纳米颗粒对可见光的散射强度较弱。光致发光谱测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒具有优异的发光性能,其发射峰窄且对称,最大发射峰位于519nm。荧光纳米颗粒的荧光激发谱(λem＝519nm)如图4所示，其最有效激发在470nm。上述结果表明包埋于所制备荧光纳米颗粒中的量子点结构完整，保持了其优异的发光特性。所制备的荧光纳米颗粒在水溶液或磷酸盐缓冲溶液(PBS)中具有优良的分散稳定性，放置3个月没有观察到沉淀。所制备的荧光纳米颗粒具有优异的光稳定性，经400nm光照射1小时后，其发光强度减弱程度小于5％。Zeta电位测试结果表明，分散于水中的所制备荧光纳米颗粒的zeta电位为-22.9±1.8mV。

[0049] 实施例2、以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质的基于CdSeS量子点的荧光纳米颗粒的制备

[0050] 将实施例1中共聚物换为苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物(数均分子量为100,000，苯乙烯基团质量分数：40％，羧基基团质量分数：25％)，浓度为10mg/mL，制备得到以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质的基于CdSeS量子点的荧光纳米颗粒。如图5所示，动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为38nm，粒径分布范围为35～46nm。图6为所制备的荧光纳米颗粒溶胶的紫外-可见吸收光谱和光致发光谱，由图中可以看到，荧光纳米颗粒在可见光区和紫外区均有较强的吸收，其主要吸收峰位于578nm,荧光纳米颗粒对可见光的散射强度较弱。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米颗粒的zeta电位为-
24.6±1.9mV。

[0051] 实施例3、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质的基于CdSe量子点的荧光纳米颗粒的制备

[0052] 将甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量：5,000，羧基基团质量分数：10％)以及CdSe量子点溶解于二甲基甲酰胺中，配制成甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物浓度为10mg/mL，CdSe量子点浓度为0.5mg/mL的二甲基甲酰胺溶液。在搅拌条件下，将含有
100μL共聚物溶液和100μL量子点溶液的混合液滴加入5.0mL水中，继续搅拌10min。于30℃真空旋转蒸发除去二甲基甲酰胺，离心分离，将所得沉淀重新分散于纯水中，制得表面含羧基的荧光纳米颗粒的溶胶。

[0053] 如图7所示，动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为48nm，粒径分布范围45nm～56nm。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米颗粒的zeta电位为-22.6±1.1mV，经400nm光照射0.5小时后，其荧光强度减弱10％。

[0054] 实施例4、以苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物为基质的基于CdSe量子点的荧光纳米颗粒的制备

[0055] 将苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物(数均分子量为50,000，羧基基团质量分数：2％)和CdSeS量子点溶于丙酮中，配置成苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物浓度为25mg/mL，CdSeS量子点浓度为0.5mg/mL，按照实施例1中所述步骤制备得到以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质的基于CdSeS量子点的荧光纳米颗粒。

[0056] 如图8所示，动态光散射测试结果表明，所制备荧光纳米颗粒的粒径分布范围55nm～66nm，平均粒径为58nm。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米颗粒的zeta电位为-25±1.2mV。

[0057] 实施例5、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物和苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质材料的基于CdSe的荧光纳米颗粒的制备

[0058] 取0.1g甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量为50,000，羧基质量百分数为3％),0.05g苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物(数均分子量为20,000，羧基质量百分数为5％),0.1g CdSe量子点溶于10mL丙酮，在搅拌和超声作用下将上述溶液加入90mL水中，按实施例1中操作步骤制备，得到上述两种共聚物之混合物为基质的基于CdSe的荧光纳米颗粒。

[0059] 动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为35nm。荧光纳米颗粒经400nm光照射1小时后，其发光强度减弱5％。

[0060] 实施例6、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于CdSeS/ZnS的荧光纳米颗粒的制备

[0061] 将甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量为3,000，羧基基团质量分数：15％)和CdSeS/ZnS溶解于乙腈中，配制成甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物浓度为1.0×
10-3mg/mL，CdSeS/ZnS浓度为2.0×10-4mg/mL的乙腈溶液。在超声条件下，将1mL上述溶液滴加入100mL水中，继续超声10min。于80℃处理除去乙腈，离心分离，将所得沉淀重新分散于磷酸盐缓冲溶液中，制得表面含羧基的荧光纳米颗粒的溶胶。

[0062] 动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为42nm。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米颗粒的zeta电位为-20±2.2mV。

[0063] 实施例7、以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质材料的基于CdSe/ZnS的荧光纳米颗粒的制备

[0064] 将苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物(数均分子量为50,000，羧基基团质量分数：0.5％)和CdSe/ZnS溶解于四氢呋喃中，配制成苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物浓度为50mg/mL，CdSe/ZnS浓度为1mg/mL的四氢呋喃溶液。在超声条件下，将10mL上述溶液滴加入50mL水中，继续超声10min。于35℃旋转蒸发除去四氢呋喃，离心分离，将所得沉淀重新分散于Tris-HCl(pH＝8)缓冲溶液中，制得表面含羧基的荧光纳米颗粒的溶胶。

[0065] 动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为80nm。

[0066] 实施例8、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于InP量子点的荧光纳米颗粒的制备

[0067] 甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量：10,000，羧基基团质量分数：5％)以及InP量子点溶解于二甲基甲酰胺中，配制成甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物浓度为0.2mg/mL，InP量子点浓度为0.02mg/mL的二甲基甲酰胺溶液。在磁力搅拌条件下，将10mL上述溶液滴加入10mL水中，继续搅拌15min。于100℃加热回流40分钟，离心分离，将所得沉淀重新分散于去离子水中，制得表面含羧基的荧光纳米颗粒的溶胶。

[0068] 动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为50nm。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米颗粒的zeta电位为-24±2.1mV。

[0069] 实施例9、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于InAs的荧光纳米颗粒的制备

[0070] 将实施例8中的InP换成InAs，使InAs浓度为0.02mg/mL其他操作步骤如实施例8中所述。动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为45nm。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米颗粒的zeta电位为-23±1.1mV。

[0071] 实施例10、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于CdZnSe的荧光纳米颗粒的制备

[0072] 将实施例8中的InP换成CdZnSe，其他操作步骤同实施例8中所述。动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为35nm。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米颗粒的zeta电位为-22±1.3mV。

[0073] 实施例11、以丙烯酸-丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于CdSeS量子点的荧光纳米颗粒的制备

[0074] 丙烯酸-丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量：15,000，羧基基团质量分数：5％)以及CdSeS量子点溶解于丙酮中，配制成丙烯酸-丙烯酸酯共聚物浓度为5mg/mL，CdSeS量子点浓度为5mg/mL的丙酮溶液。在磁力搅拌条件下，用微量注射器将500微升上述溶液注射加入100mL水中，继续搅拌10min。于40℃处理除去丙酮，离心分离，将所得沉淀重新分散于去离子水中，制得表面含羧基的荧光纳米颗粒的溶胶。

[0075] 动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为61nm。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米颗粒的zeta电位为-26±1.3mV。

[0076] 实施例12、以马来酸二烷基酯与马来酸共聚物为基质材料，基于CdSeS量子点的荧光纳米颗粒的制备

[0077] 将马来酸二烷基酯-马来酸共聚物(数均分子量：5,000，羧基基团质量分数：0.5％)和CdSeS量子点溶解于乙腈中，配制成马来酸二烷基酯-马来酸共聚物浓度为5mg/mL，CdSeS量子点浓度为0.01mg/mL的乙腈溶液。在超声条件下，用注射器将1mL上述溶液注射加入100mL水中，继续超声10min。于80℃旋转蒸发除去丙酮，离心分离，将所得沉淀重新分散于磷酸盐缓冲溶液中，制得表面含羧基的荧光纳米颗粒的溶胶。

[0078] 动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米颗粒的平均粒径为80nm。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米颗粒的zeta电位为-22±1.3mV。

[0079] 实施例13、纳米荧光粒子的细胞毒性评价

[0080] 将HeLa细胞和L929细胞用胰酶消化、悬散在带有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基里。细胞接种以0.2-1.0×105个/孔的密度接种在96孔板上。37℃和5％CO2的条件下培养24h。取出后用0.01mol/L的PBS缓冲液(pH 7.4)冲洗掉培养基。90μL培养基和10μL不同浓度(0.1-1.0mg/mL)的实施例1所制备的荧光纳米颗粒加入到每个孔里面，每个浓度做六次重复试验。24h孵育后，除去上清，用0.01mol/L的PBS缓冲液(pH 7.4)冲洗三遍。
每孔加入100μL MTT试剂。37℃下孵育4h，除去培养液，将细胞溶解在100μL DMSO。用酶标仪(BioRad Model 550Microplate Reader)检测570nm的吸收值。每个浓度取6个平行试验的数据的平均。没有加量子点的空白对照的值作为100％活性标准。结果如图9所示，在荧光纳米颗粒浓度高达600nM时，HeLa和L929细胞的成活率均在90％以上，没有表现出明显的细胞毒性。上述结果表明，制备的荧光纳米颗粒具有良好的生物相容性，适合生物体系研究。

[0081] 实施例14、纳米荧光生物探针在Lewis肺癌细胞成像中的应用

[0082] 在实施例1所制备的荧光纳米颗粒表面偶联叶酸,使用所形成的生物探针与Lewis肺癌细胞作用，在荧光显微镜下做Lewis肺癌细胞的荧光成像。具体方法如下所述：

[0083] 取实施例1所制备荧光纳米颗粒溶胶5ml，离心分离，将沉淀分散于5ml PBS缓冲液(10mM)中，向其中加入0.1ml浓度为100mg/ml的EDC溶液，0.05ml浓度为100mg/ml的NHS溶液，25℃活化反应1.0h，将反应物离心分离，沉淀用5mL PBS(10mM)溶液洗涤，重新分散于5mL PBS(10mM)中，加入0.05ml浓度为10mg/mL的叶酸溶液，反应4.0h。将产物离心，沉淀用
5ml PBS(10mM)溶液洗涤，除去过量的叶酸后将产物分散于含1mg/ml BSA的10mM PBS溶液中，即制得表面经叶酸修饰的纳米荧光探针FA@LNP，于4℃下保存待用。

[0084] 取对数生长期的Lewis肺癌细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化后，以大约3×104个/2
cm的密度接种于共聚焦培养皿中。加入0.5ml德氏改良基础培养基(DMEM培养基)，在含有
5％CO2的培养箱中于37℃培养24h,取出后用10mM PBS冲洗除去培养基，将荧光探针FA@LNP用DMEM培养基稀释10倍加入培养皿，常温温育2h。用10mM PBS冲洗三次，除去培养基和过量的荧光纳米颗粒，使用荧光显微镜进行Lewis肺癌细胞成像(如图10)，明场成像图(图10A)表明细胞状态良好，探针分子未造成细胞死亡，说明荧光探针FA@LNP毒性较低。荧光成像图如图10B所示，激发波长为405nm。图10B表明，荧光探针FA@LNP特异性修饰于Lewis细胞表面，并且FA@LNP未发生明显聚集。

[0085] 实施例15、纳米荧光探针P-QDs的温度探测应用

[0086] 在实施例1所制备的荧光纳米颗粒,在不同温度下的发光谱探测；不同pH、离子强度下的实物图和荧光发射谱测定。具体方法如下：

[0087] 将P-QDs水溶液在25-45℃之间每隔5℃用F-4500荧光分光光度计测量一次P-QDs的荧光发光谱，得到图11a；其发射峰强度与温度的关系进行分析，得图11b。

[0088] 将P-QDs水溶液在不同pH、离子强度下，分别用F-4500荧光分光光度计测量一次P-QDs的荧光发射谱，分别得到图12a和图12b。

[0089] 测量P-QDs外界温度在25℃和37℃连续变化100个循环，每个循环用F-4500荧光分光光度计测量一次P-QDs的荧光发射谱，其发射峰强度与温度的关系进行分析，得图12c。

[0090] 将P-QDs分散在细胞裂解液中，用水浴控温，是溶液温度在25-45℃之间变化，分别用F-4500荧光分光光度计测量P-QDs的荧光发射谱，计算其发射峰强度。用热电偶温度计测定水浴温度。基于P-QD发光强度变化计算所得温度与热电偶温度计测量温度相比较，得图12d。

[0091] 经检测，实施例2-12所得荧光纳米颗粒也同样具备上述应用结果。

[0092] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。