表小檗碱在制备脲酶抑制剂中的应用

摘要

本发明涉及表小檗碱在制备脲酶抑制剂中的应用。该应用中，所述的脲酶可以是洋刀豆脲酶，也可以是幽门螺杆菌脲酶；所述脲酶抑制剂是颗粒剂、胶囊或片剂。本发明所述的表小檗对脲酶的抑制效果显著优于公认的乙酰氧肟酸。

权利要求

1.表小檗碱作为唯一活性成分在制备脲酶抑制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述的脲酶是洋刀豆脲酶。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述的脲酶是幽门螺杆菌脲酶。

4.根据权利要求1、2或3所述应用，其特征在于，所述的脲酶抑制剂是颗粒剂、胶囊或片剂。

说明书

表小檗碱在制备脲酶抑制剂中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及杂环化合物，具体涉及原小檗碱类化合物。

背景技术

[0002] 脲酶(Urease，EC 3.5.1.5，Ure)，又称尿素酰胺水解酶，是一种广泛存在于各种生2+
物体内和生态环境中的含镍离子(Ni )的金属酶。脲酶可催化尿素水解为氨，因此对氮的新陈代谢过程起着重要作用。然而，脲酶活性过高会使尿素的催化水解速度过快，大量地释放出氨气，从而给农业、畜牧业、环境甚至人体健康带来各种危害。在农业方面，脲酶过快的催化水解尿素成氨，会导致氨的挥发以及土壤中的硝酸根离子、铵根离子蓄积过多，从而降低氨的利用率，污染大气，水体，土壤等环境；在畜牧业方面，非蛋白氮在反刍动物瘤胃脲酶的作用下过快分解，产生过量的氨会在反刍动物的血液中蓄积，增加家禽血氨中毒的可能性。
此外，禽舍内氨含量过高会诱导反刍动物多种疾病的发生，还会污染空气质量。在医药领域，脲酶还是人和动物体内某些致病菌如幽门螺杆菌(H.pylori)的重要致病因子和定植因子，其可通过分解人体血液中的尿素，产生氨而中和胃酸，在细胞内外营造一个近中性的环境，使H.pylori能够顺利穿过胃部粘液层，到达近中性的胃粘膜表面，从而在胃部强酸性环境下生存；还能促进炎症的发生与发展，，从而引起消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌等一系列的胃肠道疾病。

[0003] 目前，针对脲酶对人类生产和生活中带来的严重危害，国内外学者研究并使用脲酶抑制剂进行预防与治疗。迄今，脲酶抑制剂被广泛应用于医药，农业，畜牧业等领域，其种类主要包括尿素类似物，异羟肟酸类，重金属离子类，磷酰胺酯类，醌类，多酚类等。然而，现有的脲酶抑制剂因为大多具有稳定性差、作用时间短、毒副作用明显等问题，在实际应用中具有一定的限制。因此，从天然药物中筛选出安全、高效、无污染的脲酶抑制剂的研究备受关注。

[0004] 表小檗碱是从毛茛科黄连属植物黄连(Coptis chinensis)中提取分离得到的，是一种天然季铵原小檗碱型生物碱，其英文名称epiberberine，分子式为C20H18NO4，分子量为336.36，化学结构式如式(Ⅰ)所示。表小檗碱具有多种药理作用，如对细胞色素P450亚型CYP2D6较强的抑制活性，非竞争性BACE1抑制活性，抑制醛糖还原酶活性，α受体阻断作用，体外降血糖活性等。

[0005]

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是提供表小檗碱的新用途。

[0007] 上述新用途具体为，表小檗碱在制备脲酶抑制剂中的应用。

[0008] 上述应用中，所述的脲酶可以是洋刀豆脲酶，也可以是幽门螺杆菌脲酶。

[0009] 上述应用中，所述的脲酶抑制剂是颗粒剂、胶囊或片剂。

[0010] 本发明的有益效果是：(1)开拓了表小檗碱在抑制脲酶方面新的应用领域，且抑制脲酶的活性优于公认的脲酶抑制剂---乙酰氧肟酸。(2)表小檗碱原料来源丰富，安全无毒。(3)抑制机理明确，可广泛用于治疗幽门螺旋杆菌相关性胃肠道疾病。

[0011] 下面对表小檗碱抑制脲酶效果进行验证。

[0012] 实验一(表小檗碱对洋刀豆脲酶活性的影响)

[0013] 1、实验材料

[0014] 1.1受试药物

[0015] 中药材广金钱草、陈皮、青皮、味连、雅连、云连、川黄柏、关黄柏分别来自广州、广州、广州、重庆、四川，云南，四川和河北。广藿香醇，黄芩苷，野黄芩苷，亚硫酸氢钠穿心莲内酯，广州中医药大学新药开发研究中心自制，纯度均大于98％。小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱、表小檗碱，橙皮苷、延胡索乙素、柠檬烯，均购自成都植标化纯生物技术有限公司，纯度均大于98％。洋刀豆脲酶(Urease from Canavalia ensiformis，Type III，40.3U/mg)，尿素(urea)，二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、半胱氨酸(cysteine,L-Cys)、氟化钠(sodium fluoride,NaF)、硼酸(boric acid,BA)均购自美国西格玛奥德里奇公司。乙酰氧肟酸，购自阿拉丁(aladdin)公司。4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES,Amresco>99％)，水杨酸钠，亚硝基铁氰化钠,氢氧化钠，次氯酸钠，丙三醇，均购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

[0016] 1.2受试药物的配制

[0017] 称取广金钱草、陈皮、青皮、川黄柏、关黄柏、味连、云连、雅连各100g,用粉碎机粉碎后，加10倍体积的纯水浸泡30min,后采用回流提取法提取2h,再趁热过滤，滤渣采用同样方法再提取一次，合并两次滤液，减压浓缩后置于高压瓶内，高压灭菌后，于4℃保存备用。

[0018] 取上述中药提取物，，分别用20mM HEPES缓冲液(PH 7.5)配制成相应浓度，此外，称取小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱、表小檗碱、黄芩苷、野黄芩苷、广藿香醇、亚硫酸氢钠穿心莲内酯、橙皮苷、延胡索乙素、柠檬烯、乙酰氧肟酸受试药物适量，再分别用20mM HEPES缓冲液(PH 7.5)配制成相应浓度，放于4℃避光保存，备用。

[0019] 1.2洋刀豆脲酶的配制

[0020] 称取洋刀豆脲酶适量，溶于20mM HEPES缓冲液(PH 7.5)中，配制成10U/mL的洋刀豆脲酶溶液，置于4℃冰箱中冷冻保存，备用。

[0021] 1.3尿素的配制

[0022] 称取尿素适量，溶解于20mM HEPES缓冲液(PH 7.5)中，配制成150mM的尿素溶液，放于4℃冰箱中冷冻保存，备用。

[0023] 1.4 Berthelot显色液的配制

[0024] A液：分别称取适量的亚硝基铁氰化钠和水杨酸钠粉末，溶解于20mM HEPES缓冲液(PH 7.5)中，配制成含9.73mM亚硝基铁氰化钠、700mM水杨酸钠的显色A液，置于4℃避光保存，备用。

[0025] B液：称取氢氧化钠18g，溶解于20mM HEPES缓冲液(PH 7.5)中，放冷，加入24mL次氯酸钠(有效氯≥7.5％)，混匀，定容至100mL，置4℃避光保存，备用。

[0026] 2、实验方法

[0027] 把100μL一定浓度洋刀豆脲酶溶液和一系列浓度的受试药物溶液混匀，置37℃孵育20min，然后在室温下加入100μL尿素溶液避光反应20min，再加入berthelot显色液避光显色10min(先加A液后加B液，分别加入100μL)，吸取250μL孵育液至96孔板上，通过酶标仪测定595nm下的OD绝对值。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。根据公式1求得相应的OD相对值。根据公式2求得残余酶活性(Residual activity，RA)，并通过浓度-剩余酶活性曲线求得相应半数抑制浓度IC50，以平均值±标准偏差表示。

[0028] OD相对＝OD绝对–OD空白  (公式1)

[0029] 剩余酶活性RA(％)＝OD相对sample/OD相对control*100％  (公式2)

[0030] 3、实验结果

[0031] 本实验对中医常用于治疗胃肠道疾病的中药及其主要有效活性成分抑制洋刀豆脲酶活性的作用进行了筛选。实验结果如表一所示，常用于治疗胃肠道疾病的中药广金钱草、陈皮、青皮、川黄柏、关黄柏、味连、云连、雅连中，抑制洋刀豆脲酶作用效果最佳的为味连，但效果远弱于公认的脲酶抑制剂乙酰氧肟酸。而这些中药的主要活性成分小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱、表小檗碱、黄芩苷、野黄芩苷、广藿香醇、亚硫酸氢钠穿心莲内酯、橙皮苷、延胡索乙素、柠檬烯，抑制洋刀豆脲酶作用效果最佳的为表小檗碱。表小檗碱抑制洋刀豆脲酶的半数抑制浓度IC50为0.001±0.00mg/mL或2.3±0.00μM，优于公认的脲酶抑制剂乙酰氧肟酸(IC50＝0.002±0.00mg/mL或22±0.00μM)。筛选出表小檗碱可作为新型的天然脲酶抑制剂，为表小檗碱在抑制脲酶活性方面的应用奠定了基础。

[0032] 表一 天然产物抗洋刀豆脲酶活性的半数抑制浓度IC50

[0033]

[0034]

[0035] a抑制活性不确定，样品在较高浓度下仍不具抑制洋刀豆脲酶活性的作用[0036] 实验二(表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶的作用效果及机理研究)

[0037] 1、实验材料

[0038] 1.1药物的配制

[0039] 称取表小檗碱、乙酰氧肟酸、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、半胱氨酸(cysteine,L-Cys)、氟化钠(sodium fluoride,NaF)、硼酸(boric acid,BA)适量，分别用20mM HEPES缓冲液(PH 7.5)配制成相应浓度，放于4℃避光保存，备用。

[0040] 1.2 H.pylori的培养

[0041] 在37℃含5％O2、10％CO2和85％N2的微氧条件下，对H.pylori进行24h的培养，培养液为含有10％灭活马血清的布氏肉汤。复苏培养3天后，对经过鉴定且无污染的H.pylori进行传代培养：用接种环从母板刮取菌团，接种于新鲜的培养平板上，轻轻均匀涂布于整个平板，然后装罐培养3天。

[0042] 1.3 H.pylori脲酶的提取

[0043] 取50mL H.pylori菌液在5,000g，4℃的条件下离心分离并收集H.pylori，用PH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤两次后，将H.pylori沉淀在-80℃保存24h，取出放置至室温，加入
3mL蒸馏水和蛋白酶抑制剂，超声1min，15,000g，4℃离心10min，取出上层清夜透析除盐，得到脲酶溶液，加入等体积的甘油后放于4℃储存。

[0044] 1.4尿素的配制

[0045] 称取尿素适量，溶解于20mM HEPES缓冲液(PH 7.5)中，配制成150mM的尿素溶液，放于4℃冰箱中冷冻保存，备用。

[0046] 1.5 Berthelot显色液的配制

[0047] A液：分别称取适量的亚硝基铁氰化钠和水杨酸钠粉末，溶解于20mM HEPES缓冲液(PH 7.5)中，配制成含9.73mM亚硝基铁氰化钠、700mM水杨酸钠的显色A液，置于4℃避光保存，备用。

[0048] B液：称取氢氧化钠18g，溶解于20mM HEPES缓冲液(PH 7.5)中，放冷，加入24mL次氯酸钠(有效氯≥7.5％)，混匀，定容至100mL，置4℃避光保存，备用。

[0049] 2、实验方法

[0050] 2.1表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性试验

[0051] 把100μL一定浓度的幽门螺杆菌脲酶和一系列浓度的表小檗碱溶液(0.4-50.0μM)混匀，置37℃孵育20min，然后在室温下加入100μL尿素溶液避光反应20min，再加入berthelot显色液避光显色10min(先加A液后加B液，分别加入100μL)，吸取250μL孵育液至96孔板上，通过酶标仪测定595nm下的OD绝对值，求得相应的OD相对值以及残余酶活性RA，并通过浓度-剩余酶活性曲线求得相应半数抑制浓度IC50。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。

[0052] 2.2表小檗碱对幽门螺旋杆菌脲酶的抑制类型研究

[0053] 取一定浓度的幽门螺杆菌脲酶和一系列浓度的表小檗碱溶液各100μL混匀(0、6.3、12.5、25.0μM)，置37℃孵育20min。然后在室温下加入100μL一系列浓度的尿素溶液(4.5-150mM)避光反应20min，再根据“抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性试验”的方法显色并测得OD绝对值并求得相应的OD相对值。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。实验通过反应速度的倒数(1/V，即1/OD相对)对底物浓度的倒数(1/[urea])作Lineweaver-Burk图，最后通过L-B曲线结合公式3求得动力学参数KM、vmax，并通过L-B曲线进行二次作图求得抑制常数Ki。

[0054]

[0055] 2.3表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶的动力学研究

[0056] 取相同体积一系列浓度的表小檗碱溶液(0、1.4、4.2、12.5、25.0μM)以及一定浓度的幽门螺杆菌脲酶混匀，接着在37℃培养箱孵育20min后在室温下加入等体积的尿素溶液避光反应20min(孵育系统)或者不经过培养箱孵育直接加入等体积的尿素溶液避光反应20min(不孵育系统)。然后在不同的时间间隔(0-35min)移取300μL反应液至1.5mL离心管中，再根据“抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性试验”的方法显色并测得OD绝对值并求得相应的OD相对值。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。

[0057] 将上述两个反应系统求得的OD相对代入至氨含量标准曲线，计算出相对应的氨浓度。根据公式4对表小檗碱各个浓度的各试验点进行曲线拟合，判断表小檗碱与幽门螺旋杆菌脲酶的结合的速率。

[0058] Pt＝Vs*t+(V0-Vs)(l-e-kapp*t)*kapp-1  (公式4)

[0059] 其中，P是反应开始t分钟后反应产物所累积的数量，V0和Vs分别为反应起始速率和反应平衡速率，kapp是V0和Vs之间互相转换时遵循的表观一级速率常数。

[0060] 2.4含巯基化合物对幽门螺旋杆菌脲酶活性的影响

[0061] 2.4.1孵育时间试验

[0062] 把幽门螺旋杆菌脲酶溶液，含巯基化合物溶液(DTT溶液，L-Cys溶液或GSH溶液，浓度均为1.25mM)以及12.5μM表小檗碱溶液各100μL混匀，置37℃分别预孵育5,10,20或40min后，于室温下加入100μL尿素反应20min，再根据“抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性试验”的方法显色并测得OD绝对值并求得相应的OD相对值，并求出相应的残余酶活性RA。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。

[0063] 2.4.2表小檗碱-巯基-脲酶的相互作用试验

[0064] 把幽门螺旋杆菌脲酶溶液，含巯基化合物溶液(DTT溶液，L-Cys溶液或GSH溶液，浓度均为1.25mM)以及12.5μM表小檗碱溶液中的其中两种溶液混匀，置37℃预孵育20min后，接着加入第三中溶液混匀，并在37℃再孵育20min，然后在室温下向共孵育液加入尿素反应20min，再根据“抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性试验”的方法显色并测得OD绝对值并求得相应的OD相对值，并求出相应的残余酶活性RA。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。

[0065] 2.5无机化合物对幽门螺旋杆菌脲酶活性的影响

[0066] 取幽门螺旋杆菌脲酶溶液与无机化合物溶液(5mM硼酸或氟化钠溶液)各100μL混匀，置37℃培养箱预孵育20min。再加入100μL表小檗碱溶液(12.5μM)混匀，置37℃培养箱再孵育20min后取出，在室温下加入100μL尿素反应20min，再根据“抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性试验”的方法显色并测得OD绝对值并求得相应的OD相对值，并求出相应的残余酶活性RA。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。

[0067] 2.6表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶的再活化试验

[0068] 把等体积的幽门螺旋杆菌脲酶溶液与表小檗碱溶液(12.5μM)混匀，经37℃培养箱孵育20min后，取出一半孵育液加入适量的DTT溶液(1.25mM)，再与另一半孵育液置37℃培养箱孵育0-100min，在每个指定的时间点取出DTT加入前与后的孵育液适量，分别加入适量的尿素溶液，于室温避光反应20min，再根据“抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性试验”的方法显色并测得OD绝对值并求得相应的OD相对值，并求出相应的残余酶活性RA。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。

[0069] 2.7表小檗碱与幽门螺旋杆菌脲酶活性部位分子对接研究

[0070] 为了研究表小檗碱以及脲酶的结合模式，本研究应用Auto-Dock version 4.2软件，AutoDock Tools(ADT 1.5.6)图形工作站对表小檗碱以及幽门螺旋杆菌脲酶进行分子对接模拟。其中，实验靶点幽门螺杆菌脲酶的三维结构从RCSB蛋白数据库下载，其PDB代码为1E9Y，分辨率为 而配体化合物表小檗碱通过chem3D Ultra 8.0software软件获得其标准PDB格式。

[0071] 实验以幽门螺杆菌脲酶活性中心的两个镍离子的平均坐标作为网格的中心，并把立方网格盒子的大小设置为 (x,y,z)，格点间隔定为默认值 分子对接开始前，把脲酶上所有的水分子除去，再加上极性氢原子跟赋予电荷。分子对接后，采用拉马克的混合遗传算法(the hybrid Lamarckian Genetic Algorithm，LGA)寻找最佳的结合构象。

[0072] 3、实验结果

[0073] 3.1表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性试验

[0074] 结果如图1所示，表小檗碱抑制幽门螺杆菌脲酶活性的半数抑制浓度(IC50)为3.0±0.00μM,而公认的脲酶抑制剂乙酰氧肟酸抑制幽门螺杆菌脲酶活性的半数抑制浓度(IC50)为22.0±0.00μM，表小檗碱抑制脲酶的作用比乙酰氧肟酸强大约10倍。

[0075] 3.2表小檗碱对幽门螺旋杆菌脲酶的抑制类型研究

[0076] 结果如图2所示，在没有表小檗碱的存在下，幽门螺旋杆菌脲酶酶促反应的米氏常数KM为2.50±0.15mM，最大反应速度vmax分别为0.32±0.01mM/min。由Lineweaver-Burk双倒数图可知随着表小檗碱浓度的变化，表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶的动力学参数KM，vmax均降低，由此可初步推断表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶的作用类型为反竞争性抑制类型。此外，结合表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶类型，对Lineweaver-Burk双倒数图进行二次作图可求得表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶的抑制常数Ki为10.6±0.006μM。

[0077] 3.3表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶的动力学研究

[0078] 根据图3表小檗碱与幽门螺旋杆菌脲酶的反应进度曲线可知，表小檗碱与幽门螺旋杆菌脲酶先快速形成脲酶-表小檗碱复合物EI，随后缓慢异构化为脲酶-表小檗碱复合物EI*。结合前人的研究可知，表小檗碱与幽门螺旋杆菌脲酶的结合方式属于缓慢结合型。

[0079] 3.4含巯基化合物对幽门螺旋杆菌脲酶活性的影响

[0080] 图4显示，当系统中含有巯基化合物(DTT，L-Cys或GSH)时，即使是在表小檗碱存在的情况下，幽门螺旋杆菌脲酶仍能保持较高的酶活性，且由图4可知幽门螺旋杆菌脲酶的活性与含巯基化合物，幽门螺旋杆菌脲酶，表小檗碱三者的孵育时间以及加入顺序密切相关。由此我们可推测表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性的其中一个作用位点为脲酶氨基酸系列中的巯基基团。

[0081] 3.5无机化合物对幽门螺旋杆菌脲酶活性的影响

[0082] 实验结果如图5所示，当系统中幽门螺旋杆菌脲酶同时与表小檗碱及BA或NaF存在时，剩余酶活性RA均降至，甚至低于表小檗碱单独与幽门螺旋杆菌脲酶作用时的残余酶活性，表明BA与NaF对幽门螺旋杆菌脲酶的活性无保护作用，且表小檗碱可能与BA和NaF协同抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性。

[0083] 3.6幽门螺旋杆菌脲酶的再活化试验

[0084] 从图6可知，表小檗碱与幽门螺旋杆菌脲酶共同孵育20min后脲酶的活性从100％降至20％，加入DTT后，表小檗碱抑制的幽门螺旋杆菌脲酶活性在100分钟内逐渐恢复，最终幽门螺旋杆菌脲酶的活性可恢复到初始活性的65％。结果表明表小檗碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性的作用具有时间依赖关系且其抑制作用具有可逆性。

[0085] 3.7表小檗碱与幽门螺旋杆菌脲酶活性部位分子对接研究

[0086] 经过分子对接程序的运行计算，表小檗碱与幽门螺杆菌脲酶的对接得分为-5.38kcal/mol，提示表小檗碱可能为幽门螺杆菌脲酶抑制剂。图7分子对接示意图显示，表小檗碱不与脲酶的活性部位Ni2+相作用，表小檗碱以形成O-H…H氢键的方式，主要通过与幽门螺杆菌脲酶flap区域上的ASN-168和MET-366残基形成较强的氢键作用，使flap构象保持张开的状态，从而使酶活性发生变化。

[0087] 以上实验表明，表小檗碱能显著抑制幽门螺杆菌脲酶的活性，且其抑制效果为乙酰氧肟酸抑制脲酶效果的10倍。此外，表小檗碱抑制幽门螺杆菌脲酶作用机理的研究证明表小檗碱是一种缓慢结合的反竞争性脲酶抑制剂，其抑制幽门螺杆菌脲酶的作用是时间、浓度依赖并且可逆的，且主要是通过作用于幽门螺杆菌脲酶氨基酸序列中的巯基活性基团从而抑制脲酶的活性。通过上述机理研究可进一步证实表小檗碱具抗幽门螺杆菌脲酶的作用,且作用效果明显。再结合表小檗碱结构简单，安全等优点可知，表小檗碱在制备抗幽门螺杆菌的药物方面具有良好的应用价值与开发前景，是潜在的脲酶抑制剂，具有治疗幽门螺旋杆菌相关性胃肠道疾病的作用。

附图说明

[0088] 图1为表小檗碱与乙酰氧肟酸对幽门螺杆菌脲酶的抑制活性曲线；其中，A图为表小檗碱的抑制活性，B图为乙酰氧肟酸的抑制活性。

[0089] 图2中的A图为表小檗碱抑制幽门螺杆菌脲酶的Lineweaver-Burk双倒数图，B图为表小檗碱抑制幽门螺杆菌脲酶Lineweaver-Burk双倒数图中曲线的截距与抑制剂浓度关系图。

[0090] 图3为表小檗碱与幽门螺杆菌脲酶的反应进度曲线；其中，A图为不孵育情况下的反应进度曲线，B图为孵育的情况下的反应进度曲线。

[0091] 图4为含巯基化合物对幽门螺杆菌脲酶活性影响的条形图；其中，A图为含巯基化合物与幽门螺杆菌脲酶孵育时间对脲酶活性影响的条形图，B图为含巯基化合物，表小檗碱与幽门螺杆菌脲酶三种的加入顺序对脲酶活性影响的条形图。

[0092] 图5为无机化合物对幽门螺杆菌脲酶活性影响的条形图。

[0093] 图6为二硫苏糖醇(DTT)对表小檗碱抑制的幽门螺杆菌脲酶的再活化影响的曲线图。

[0094] 图7表小檗碱与幽门螺杆菌脲酶之间的分子对接结合的示意图；其中，A图为表小檗碱与幽门螺杆菌脲酶活性位点结合模式的示意图，B图为表小檗碱与幽门螺杆菌脲酶活性位点结合的示意图(图中破折号为受体与配体形成的氢键，编号1为碳，2为氧，3为氮，4为氢)。

具体实施方式

[0095] 实施例1(胶囊剂)

[0096] 表小檗碱10g与淀粉300g混合均匀，用7％的淀粉浆300g作为粘合剂、湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁16g混合，制得表小檗碱胶囊内容物；填充胶囊，规格为每粒含表小檗碱10mg的胶囊1000粒，每粒净重0.31g。每次1～2粒，一日3次，10～15天为一疗程，可连续使用
2～3疗程。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤，甚至胃癌等期间，用于口服使用。

[0097] 实施例2(胶囊剂)

[0098] 表小檗碱1g与淀粉300g混合均匀，用7％的淀粉浆300g作为粘合剂、湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁16g混合，制得表小檗碱胶囊内容物；填充胶囊，规格为每粒含表小檗碱1mg的胶囊1000粒，每粒净重0.30g。每次1～2粒，一日3次，10～15天为一疗程，可连续使用2～3疗程。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤，甚至胃癌等期间，用于口服使用。

[0099] 实施例3(胶囊剂)

[0100] 表小檗碱100g与淀粉300g混合均匀，用7％的淀粉浆300g作为粘合剂、湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁16g混合，制得表小檗碱胶囊内容物；填充胶囊，规格为每粒含表小檗碱100mg的胶囊1000粒，每粒净重0.30g。每次1粒，一日3次，10～15天为一疗程，可连续使用2～3疗程。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤，甚至胃癌等期间，用于口服使用。

[0101] 实施例4(片剂)

[0102] 表小檗碱200g，加入乳糖480g、淀粉1100g混合均匀，用7％的淀粉浆300g作为粘合剂、湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁16g混合，压制成每片含表小檗碱20mg的片剂10000片，每片净重0.20g。每次1～3片，一日3次，10～15天为一疗程，可连续使用2～3疗程。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤，甚至胃癌等期间，用于口服使用。

[0103] 实施例5(片剂)

[0104] 表小檗碱20g，加入乳糖480g、淀粉1100g混合均匀，用7％的淀粉浆300g作为粘合剂、湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁16g混合，压制成每片含表小檗碱2mg的片剂10000片，每片净重0.20g。每次1～3片，一日3次，10～15天为一疗程，可连续使用2～3疗程。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤，甚至胃癌等期间，用于口服使用。

[0105] 实施例6(片剂)

[0106] 表小檗碱100g，加入乳糖480g、淀粉1100g混合均匀，用7％的淀粉浆300g作为粘合剂、湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁16g混合，压制成每片含表小檗碱10mg的片剂10000片，每片净重0.20g。每次1～3片，一日3次，10～15天为一疗程，可连续使用2～3疗程。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤，甚至胃癌等期间，用于口服使用。

[0107] 实施例7(颗粒剂)

[0108] 表小檗碱10g，用400g倍他环糊精包合，得包合物；包合物加淀粉至600g，混匀，制成颗粒，60℃以下干燥，分装成1000袋(1g/袋)。服用剂量为每天2次，每次一袋。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤，甚至胃癌等期间，用于口服使用。

[0109] 实施例8(颗粒剂)

[0110] 表小檗碱100g，用400g倍他环糊精包合，得包合物；包合物加淀粉至600g，混匀，制成颗粒，60℃以下干燥，分装成1000袋(1g/袋)。服用剂量为每天2次，每次一袋。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤，甚至胃癌等期间，用于口服使用。

[0111] 实施例9(颗粒剂)

[0112] 表小檗碱50g，用400g倍他环糊精包合，得包合物；包合物加淀粉至600g，混匀，制成颗粒，60℃以下干燥，分装成1000袋(1g/袋)。服用剂量为每天2次，每次一袋。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤，甚至胃癌等期间，用于口服使用。