以荧光蛋白编码基因为第二基因编码框的双顺反子特异DNA及其应用

摘要

本发明公开了一种以荧光蛋白编码基因为第二基因编码框的双顺反子特异DNA及其在表达目的基因中的应用。本发明提供了一种特异DNA分子，具有双顺反子结构，自上游至下游依次包括如下元件：启动区、操纵区、第一个核糖体结合位点、基因编码框Ⅰ、第二个核糖体结合位点、基因编码框Ⅱ、终止子；基因编码框Ⅰ的最后一个核苷酸与第二个核糖体结合位点的第一个核苷酸连接；基因编码框Ⅱ编码荧光蛋白。本发明提供的特异DNA分子，无需特殊步骤直接观察即可判断基因编码框Ⅰ内的外源目的基因表达与否、外源目的基因表达量的双重能力，具有重大的应用价值。

权利要求

1.序列表的序列2所示的DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组质粒。

3.一种用于表达目的基因的试剂盒，包括权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述重组质粒。

4.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述重组质粒或权利要求3所述试剂盒在表达目的基因中的应用。

说明书

以荧光蛋白编码基因为第二基因编码框的双顺反子特异DNA

及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以荧光蛋白编码基因为第二基因编码框的双顺反子特异DNA及其在表达目的基因中的应用。

背景技术

[0002] 大肠杆菌表达系统是研发最早、应用最为广泛的外源基因表达系统，具有其它系统不可比拟优越性，因而大肠杆菌被形象地称为“重组蛋白工厂”。但并非每一种外源基因都能在其中有效表达，这归因于每种外源基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、大肠杆菌密码子偏好性、外源蛋白对大肠杆菌的细胞毒性等等。甚至实验的失误，如重组菌甘油管保存时间过长导致的质粒丢失、表达宿主菌选择错误、诱导剂加错或用量不当、污染杂菌等等，导致原来表达很好的重组菌突然“不表达”了。而实验失误导致的蛋白不表达，常常需要多次重复实验进行逐一排查，费时费力。

[0003] 鉴定重组蛋白表达与否主要有两种传统的方法，即蛋白质电泳和免疫印迹法。将诱导表达后的菌体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，相对于未诱导菌体，在理论分子量附近出现浓重的条带，可初步判断外源蛋白表达，而条带的灰度反映了蛋白表达量。进一步通过蛋白质印迹法(Western Blot,WB)对其进一步检测，以明确其表达。可选针对外源蛋白本身的抗体作为一抗，当然大多断情况，外源蛋白均与相应表达标签融合表达，一方面利于后续纯化，另一方面可选商品化的标签抗体作为一抗，方便WB检测外源蛋白的表达。此外，还有一些表达极其微量的重组蛋白，SDS-PAGE检测无法明确其表达，WB灵敏度和特异性更高，这种情况下，WB检测是必需的。目前，尚缺乏可以在加入诱导剂后，实时检测重组蛋白表达情况的检测手段。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种以荧光蛋白编码基因为第二基因编码框的双顺反子特异DNA及其在表达目的基因中的应用。

[0005] 本发明提供了一种特异DNA分子，具有双顺反子结构，自上游至下游依次包括如下元件：启动区、操纵区、第一个核糖体结合位点、基因编码框Ⅰ、第二个核糖体结合位点、基因编码框Ⅱ、终止子；基因编码框Ⅰ的最后一个核苷酸与第二个核糖体结合位点的第一个核苷酸连接；基因编码框Ⅱ编码荧光蛋白。

[0006] 第一个核糖体结合位点与第二个核糖体结合位点，既可以为相同序列也可以为不同序列。

[0007] 所述荧光蛋白具体可为红色荧光蛋白。

[0008] 所述红色荧光蛋白具体为如下(a1)或(a2)：

[0009] (a1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0010] (a2)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

[0011] 所述基因编码框Ⅱ具体为如下(b1)或(b2)或(b3)：

[0012] (b1)序列表的序列2中自5’末端第174-884位核苷酸所示的DNA分子；

[0013] (b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码相同蛋白质的DNA分子；

[0014] (b3)与(b1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码相同蛋白质的DNA分子。

[0015] 第一个核糖体结合位点具体如序列表的序列2中自5’末端第74-80位核苷酸所示。第二个核糖体结合位点具体如序列表的序列2中自5’末端第159-165位核苷酸所示。

[0016] 所述启动区具体可为T7启动区。所述T7启动区具体如序列表的序列2中自5’末端第1-18位核苷酸所示。所述操纵区具体为lac操纵区。所述lac操纵区具体如序列表的序列2中自5’末端第20-42位核苷酸所示。

[0017] 所述终止子具体可为T7终止子。所述T7终止子具体如序列表的序列2中自5’末端第975-1022位核苷酸所示。

[0018] 基因编码框Ⅰ中可具有MCS区。MCS即多克隆位点。MCS区的作用为：方便外源目的基因的插入。基因编码框Ⅰ中还可具有多肽标签的编码序列。多肽标签的作用为：方便对外源目的基因表达的蛋白进行纯化。所述多肽标签具体可为T7tag标签。

[0019] 所述特异DNA分子具体可为序列表的序列2所示的DNA分子。

[0020] 含有以上任一所述特异DNA分子的重组质粒也属于本发明的保护范围。所述重组质粒具体可为在载体pET-21a(+)的Hind III和Xho I酶切位点之间插入序列表的序列1所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

[0021] 本发明还保护用于表达目的基因的试剂盒，包括以上任一所述特异DNA分子或以上任一所述重组质粒。所述试剂盒还可包括宿主菌。所述宿主菌为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。所述试剂盒还可包括IPTG。

[0022] 本发明还保护以上任一所述特异DNA分子或以上任一所述重组质粒或以上任一所述试剂盒在表达目的基因中的应用。

[0023] 应用所述特异DNA分子表达目的基因的方法包括如下步骤：

[0024] (1)将目的基因以不改变读码框的方式插入以上任一所述特异DNA分子的基因编码框Ⅰ中(对于含有MSC区的特异DNA分子来说，插入MSC区)；

[0025] (2)将步骤(1)得到的DNA分子导入以上任一所述宿主菌，得到重组菌；

[0026] (3)培养所述重组菌并在培养过程中加入IPTG，通过对培养体系或培养上清进行观察或检测判断目的基因是否表达。

[0027] 应用所述重组质粒表达目的基因的方法包括如下步骤：

[0028] (1)将目的基因以不改变读码框的方式插入以上任一所述重组质粒中的特异DNA分子的基因编码框Ⅰ中(对于含有MSC区的特异DNA分子来说，插入MSC区)；

[0029] (2)将步骤(1)得到的质粒导入以上任一所述宿主菌，得到重组菌；

[0030] (3)培养所述重组菌并在培养过程中加入IPTG，通过对培养体系或培养上清进行观察或检测判断目的基因是否表达。

[0031] 通过对培养体系进行观察判断目的基因是否表达的方法如下：观察培养体系的颜色，如果培养体系显示为红色说明目的基因表达(培养体系的红色越深说明目的基因的表达越多)，如果培养体系不显示为红色说明目的基因未表达。

[0032] 通过对培养体系进行检测判断目的基因是否表达的方法如下：在587nm激发光下，检测培养上清610nm处荧光强度，如果荧光强度为5000以上说明目的基因表达(荧光强度越大说明目的基因表达越多)，如果荧光强度小于5000说明目的基因未表达。

[0033] 通常认为核糖体遇终止密码子将发生大小亚基解离，本发明提供的特异DNA分子中，基因编码框Ⅰ中的终止密码子后紧跟着第二个核糖体结合位点，则部分核糖体将来不及解离而接下去启动了基因编码框Ⅱ的翻译，即报告系统被激活，从而实现了指示外源基因表达的能力。如果核糖体在此之前遇到了表达阻力，而使得基因编码框Ⅰ不表达，或表达意外终止，将不会启动基因编码框Ⅱ的翻译，即报告系统无法激活，提示表示失败。

[0034] 应用所述特异DNA分子表达目的基因时，将目的基因以不改变读码框的方式插入基因编码框Ⅰ中，然后导入宿主菌。在IPTG诱导下，转录生成一条双顺反子融合mRNA。只有在外源目的基因成功翻译后，才能启动红色荧光蛋白编码序列的翻译。因此，可以通过裸眼观察红色或检测红色荧光实现目的基因的表达情况的实时监测。本发明提供的DNA分子中，采用红色荧光蛋白指示外源目的基因的表达情况。在诱导表达的同时，不借助任何仪器设备就能判断外源目的基因的表达与否，不需要额外的SDS-PAGE或WB检测。

[0035] 本发明还保护一种特异DNA分子，具有双顺反子结构，自上游至下游依次包括如下元件：第一个核糖体结合位点、基因编码框Ⅰ、第二个核糖体结合位点、基因编码框Ⅱ；基因编码框Ⅰ的最后一个核苷酸与第二个核糖体结合位点的第一个核苷酸连接；基因编码框Ⅱ编码荧光蛋白。

[0036] 本发明提供的特异DNA分子，无需特殊步骤直接观察即可判断基因编码框Ⅰ内的外源目的基因表达与否、外源目的基因表达量的双重能力，具有重大的应用价值。

附图说明

[0037] 图1为载体pET-21a(+)的多克隆位点附近的元件示意图。

[0038] 图2为序列表的序列2的元件示意图。

[0039] 图3为各个重组质粒的元件示意图。

[0040] 图4为实施例3的结果。

具体实施方式

[0041] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。基因编码框：基因中起始密码子至终止密码子之间的区域(含起始密码子和终止密码子，可含有内含子也可不含有内含子)。RBS即核糖体结合位点。mCherry即红色荧光蛋白。大肠杆菌BL21(DE3)：Novagen公司，产品目录号为69450。载体pET-21a(+)：Novagen公司，产品目录号为69740；载体pET-21a(+)的多克隆位点附近的元件示意图见图1。

[0042] 实施例1、重组质粒的构建

[0043] 1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。

[0044] 2、取步骤1得到的DNA分子，用限制性内切酶Hind III和Xho I双酶切，回收酶切产物。

[0045] 3、取载体pET-21a(+)，用限制性内切酶Hind III和Xho I双酶切，回收约5428bp的载体骨架。

[0046] 4、将步骤2得到的酶切产物与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pET-ORF-mcherry。

[0047] 经测序，重组质粒pET-ORF-mcherry中具有序列表的序列2所示的DNA分子。

[0048] 序列表的序列2中，第1-18位核苷酸为T7启动区，第20-42位核苷酸为lac操纵区，第74-80位核苷酸为RBS1，第89-91位核苷酸为基因编码框Ⅰ的起始密码子，第92-121位核苷酸为T7tag标签的编码序列，第122-155位核苷酸为MCS区(依次具有BamHⅠ酶切识别序列、EcoRⅠ酶切识别序列、SacⅠ酶切识别序列、SalⅠ酶切识别序列和HindⅢ酶切识别序列)，第156-158位核苷酸为基因编码框Ⅰ的终止密码子，第159-165位核苷酸为RBS2，第174-884位核苷酸为mCherry的编码序列(第174-176位核苷酸为基因编码框Ⅱ的起始密码子，第882-
884位核苷酸为基因编码框Ⅱ的终止密码子)，第975-1022位核苷酸为T7终止子。

[0049] 序列表的序列2的元件示意图见图2。

[0050] 5、在重组质粒pET-ORF-mcherry的EcoRⅠ酶切识别序列和SacⅠ酶切识别序列之间插入1个稀有密码子“CTA”，得到重组质粒pET-ORFmu1-mcherry。

[0051] 6、在重组质粒pET-ORF-mcherry的EcoRⅠ酶切识别序列和SacⅠ酶切识别序列之间插入2个稀有密码子“CTAATA”，得到重组质粒pET-ORFmu2-mcherry。

[0052] 7、在重组质粒pET-ORF-mcherry的EcoRⅠ酶切识别序列和SacⅠ酶切识别序列之间插入3个稀有密码子“CTAATAAGG”，得到重组质粒pET-ORFmu3-mcherry。

[0053] 实施例2、构建重组菌

[0054] 将重组质粒pET-ORF-mcherry导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Ⅰ。

[0055] 将重组质粒pET-ORFmu1-mcherry导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Ⅱ。

[0056] 将重组质粒pET-ORFmu2-mcherry导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Ⅲ。

[0057] 将重组质粒pET-ORFmu3-mcherry导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Ⅳ。

[0058] 各个重组质粒的元件示意图见图3。

[0059] 稀有密码子，特别是连续的稀有密码子，对于基因表达存在阻力。当第一个基因编码框内出现稀有密码子时，相比无稀有密码子的情况，第二个基因编码框的翻译水平将降低，即第二个基因编码框内的报告基因的表达水平将明显降低，体现为mCherry含量降低，进一步表现为红色变浅。当第一个基因编码框内出现3个连续的稀有密码子时，其翻译将提前终止，核糖体大小亚基提前解离，导致第二个基因编码框将无法启动翻译，体现为无mCherry产生，菌液不变色。

[0060] 实施例3、通过目测红色或红色荧光检测重组菌中基因编码框Ⅰ的表达情况[0061] 一、试验处理

[0062] 分别将实施例2构建的重组菌Ⅰ、重组菌Ⅱ、重组菌Ⅲ和重组菌Ⅳ作为待测菌，进行如下操作：

[0063] 1、将待测菌接种至含50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃、250rpm振荡培养至OD600nm值＝0.6。

[0064] 2、完成步骤1后，在培养体系中加入IPTG(IPTG在培养体系中的浓度为0.5mM)，37℃、250rpm振荡培养4小时。

[0065] 3、完成步骤2后，取整个培养体系，3500rpm离心，取上清液，拍照。

[0066] 二、对照处理

[0067] 1、将重组菌Ⅰ接种至含50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃、250rpm振荡培养至OD600nm值＝0.6。

[0068] 2、完成步骤1后，继续37℃、250rpm振荡培养4小时。

[0069] 3、完成步骤2后，取整个培养体系，3500rpm离心，取上清液，拍照。

[0070] 三、结果分析

[0071] 上清液的照片见图4。图4中，1为试验处理中重组菌Ⅰ得到的上清液，2为试验处理中重组菌Ⅱ得到的上清液，3为试验处理中重组菌Ⅲ得到的上清液，4为试验处理中重组菌Ⅳ得到的上清液，5为对照处理中重组菌Ⅰ得到的上清液。可以观察到，图3中1、2、3的颜色为红色，但颜色依次变浅，4和5不显示红色。结果表明，随着引入第一个基因编码框内的稀有密码子的数量上升，上清液红色程度逐渐下降；引入连续3个稀有密码子后，上清液肉眼已观察不到红色出现，与未诱导菌液上清颜色基本一致。

[0072] 在587nm激发光下，检测上清液610nm处荧光强度，结果见表1。

[0073] 表1

[0074]  610nm处荧光强度
试验处理中重组菌Ⅰ得到的上清液 281752
试验处理中重组菌Ⅱ得到的上清液 226947
试验处理中重组菌Ⅲ得到的上清液 183289
试验处理中重组菌Ⅳ得到的上清液 2837
对照处理中重组菌Ⅰ得到的上清液 2350