构建彩叶栾树品种指纹图谱的SSR引物、所构建的指纹图谱及其应用

摘要

本发明公开了构建彩叶栾树品种指纹图谱的SSR引物、所构建的指纹图谱及其应用。本发明根据栾树转录组数据设计获得96对SSR引物，进一步从中筛选出差异较为稳定、多态性好的13对引物用于构建彩叶栾树品种的特异指纹图谱。本发明进一步公开了利用所筛选的SSR引物构建彩叶栾树品种指纹图谱的方法，包括：提取栾树样品DNA作为扩增模板，以所述SSR引物进行PCR扩增；将扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果对彩叶栾树品种样品DNA的扩增结果形成引物字母编号加扩增条带长度数字的带型编号，获得各个品种的指纹图谱。本发明所述SSR引物对栾树属植物的品种筛选或鉴定以及优良树种的选育等方面具有重要的应用价值。

权利要求

1.用于构建彩叶栾树品种指纹图谱的SSR引物，其特征在于，由以下13对引物组成：引物对1：由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示上游引物和SEQ ID No.2所示下游引物组成；引物对2：由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示上游引物和SEQ ID No.4所示下游引物组成；引物对

3：由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示上游引物和SEQ ID No.6所示下游引物组成；引物对4：由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示上游引物和SEQ ID No.8所示下游引物组成；引物对5：由核苷酸序列为SEQ ID No.9所示上游引物和SEQ ID No.10所示下游引物组成；引物对6：由核苷酸序列为SEQ ID No.11所示上游引物和SEQ ID No.12所示下游引物组成；引物对7：由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示上游引物和SEQ ID No.14所示下游引物组成；引物对8：由核苷酸序列为SEQ ID No.15所示上游引物和SEQ ID No.16所示下游引物组成；引物对9：由核苷酸序列为SEQ ID No.17所示上游引物和SEQ ID No.18所示下游引物组成；引物对10：由核苷酸序列为SEQ ID No.19所示上游引物和SEQ ID No.20所示下游引物组成；引物对

11：由核苷酸序列为SEQ ID No.21所示上游引物和SEQ ID No.22所示下游引物组成；引物对12：由核苷酸序列为SEQ ID No.23所示上游引物和SEQ ID No.24所示下游引物组成；引物对13：由核苷酸序列为SEQ ID No.25所示上游引物和SEQ ID No.26所示下游引物组成。

2.按照权利要求1所述的SSR引物，其特征在于，所述彩叶栾树品种选自锦叶栾、晋栾1号、晋栾2号或晋栾3号。

3.权利要求1所述的SSR引物在彩叶栾树品种鉴定中的应用。

4.权利要求1所述的SSR引物在构建彩叶栾树品种指纹图谱中的应用。

5.按照3或4所述的应用，其特征在于，所述彩叶栾树品种选自锦叶栾、晋栾1号、晋栾2号或晋栾3号。

6.一种彩叶栾树品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取彩叶栾树样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以权利要求1所述SSR引物为扩增引物，建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)将扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果对彩叶栾树每个品种的样品DNA的扩增结果形成引物字母编号加扩增条带长度数字的带型编号，即得。

7.按照权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述PCR反应体系包括：反应体系的总体积为25μL，其中，2×PCR MIX 12.5μl，DNA模板2μl，上游引物2μl，下游引物0.5μl，ddH2O 

3μl，M13蛋白5μl；其中，在上游引物5‘端添加核苷酸序列为SEQ ID No.27所示的序列，然后再进行PCR扩增；所述PCR扩增的程序包括：94℃，3min；94℃，30s；每对引物的退火温度+1℃，30s；72℃，40s；94℃，30s；每对引物的退火温度+0.5℃，30s；72℃，40s；94℃，30s；每对引物的退火温度，30s；72℃，40s，35个循环；72℃，7min；每对引物的退火温度为：引物对1的退火温度为53℃；引物对2的退火温度为52℃；引物对3的退火温度为55℃；引物对4的退火温度为54℃；引物对5的退火温度为56℃；引物对6 的退火温度为54℃；引物对7的退火温度为52℃；引物对8的退火温度为55℃；引物对9的退火温度为55℃；引物对10的退火温度为55℃；引物对11的退火温度为53℃；引物对12的退火温度为53℃；引物对13的退火温度为52℃。

8.权利要求6或7所述的构建方法构建得到的彩叶栾树品种指纹图谱，其中，所述彩叶栾树品种是锦叶栾、晋栾1号、晋栾2号和晋栾3号。

9.按照权利要求8所述的彩叶栾树品种指纹图谱，其特征在于，

所述锦叶栾的指纹图谱为：

C243-249D291-293F302H241I232L256；

所述晋栾1号的指纹图谱为：

B128-194C249D291-293F302H247I232L256；

所述晋栾2号的指纹图谱为：

B128-134-194-203C243-247D291-293F302H247-256I232L256；

所述晋栾3号的指纹图谱为：

B128-134-194-203C249D293F302H241-256I232L256；

其中，B为权利要求1的引物对2的字母编号，C为权利要求1的引物对3的字母编号，D为权利要求1的引物对4的字母编号，F为权利要求1的引物对6的字母编号，H为权利要求1的引物对8的字母编号，I为权利要求1的引物对9的字母编号，L为权利要求1的引物对12的字母编号；各字母后的阿拉伯数字为采用该引物所扩增的DNA条带的长度，单位为bp。

10.一种用于鉴别彩叶栾树品种的PCR试剂盒，包括：PCR扩增引物，2×PCR MIX和ddH2O，其特征在于，所述PCR扩增引物为权利要求1所述的SSR引物。

说明书

构建彩叶栾树品种指纹图谱的SSR引物、所构建的指纹图谱及

其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及SSR引物，尤其涉及用于构建彩叶栾树品种指纹图谱的SSR引物，本发明还涉及所述SSR引物在构建彩叶栾树品种指纹图谱中的应用，属于彩叶栾树品种指纹图谱的构建领域。

背景技术

[0002] 简单重复序列标记技术是针对基因组DNA中简单重复序列所设计的分子标记技术。基因组DNA中重复序列包括两种类型：分散型和串联型，其中SSR标记主要针对的是串联重复序列中的微卫星DNA，因此又被称为微卫星DNA标记。由于微卫星DNA在不同植物中存在基因组位置不同、重复次数不同、重复程度不同以及同一物种中不同基因型重复次数不同等原因，造成SSR标记具有较高的多态性，同时SSR两端序列又具有较高的保守性，因此通过设计合适的引物即可快速进行SSR分子标记多态性的检测。

[0003] SSR分子标记在应用上具备多种优势，它数量丰富，覆盖了整个基因组，可以鉴别出纯合子和杂合子，重复性高，同时具备多等位基因的特性，提供遗传信息量多，又由于两端序列的保守性，在同种而不同遗传型的个体中引物具有通用性；同时它的多态性信息量也远高于其他类型的分子标记。SSR分子标记技术的应用十分广泛，其在遗传多样性、定位基因、图谱构建以及品种鉴定等方面都有着重要应用价值。随着研究者们不断的创新与完善，由SSR又衍生出了多种标记技术，其中以ISSR和EST-SSR应用最为广泛。ISSR标记技术是由加拿大学者Zietkiewicz等提出的一种新型分子标记技术，其应用SSR序列两端几个碱基作为锚定序列，对其两侧具有反向SSR排列的序列进行扩增，兼顾了SSR、RAPD等多种标记的优点，同时操作简单，成本低，因此深受广大研究者喜爱，多被应用于种质资源鉴定、指纹图谱的构建、亲属关系的研究以及辅助育种等。EST-SSR为在EST序列中开发的SSR标记技术，由于EST序列保守型较非编码系列高，因此EST-SSR相对于SSR标记来说，重复性更好，更稳定，并在药用植物、蔬菜以及水果中的应用都成功进行了实践。同样在经济作物的育种过程中，EST-SSR标记也有极高的应用价值，在小麦、水稻、棉花以及小米的遗传多样性分析以及品种鉴定筛选过程中，相应的SSR标记都发挥了重要作用。

[0004] 栾树属植物为落叶乔木，在分类学上共有4种，其中三种为中国乡土树种，分别为栾树(Koelreuteria paniculata Laxm.)、台湾栾树(K.formosana Hayta.)和复羽叶栾树(K.Bipinnata Franch.)。除此之外，在复羽叶栾树中还有一变种为全缘叶栾树(K.integrifolia Merr.)，在栾树中有一芽接变种为锦叶栾。栾树是栾树属植物中最主要的代表植物，与其他三种栾树属植物相比，它不具备完全的二回羽状复叶，且在小叶上边缘上有钝锯齿，在近基部的齿则常疏离而呈深缺刻状；蒴果也与其他三种不同，呈圆锥形，顶端有渐尖的趋势。由于栾树其本身抗性强，适应性好，因此栾树在园林绿化应用中具有极其重要的作用。锦叶栾为栾树的芽接变种，其生理学特征与普通栾树类似，它的叶色特异，为金黄色，具有独特的红色的茎，红色的脉和红色的嫩梢，观赏价值较普通栾树更高，具备更好的园林树种特性。全缘叶栾树，又称黄山栾，是复羽叶栾树的一个变种，其与栾树相比，具有完整的二回羽状复叶，果实为椭圆形、阔卵形或近球形，其顶端圆或钝；与复羽叶栾树相比，差异主要体现在它的小叶通常为全缘，或一侧近顶端略有锯齿，而复羽叶栾树的小叶边缘则通常具有稍密、内弯的小锯齿。除此之外，其与复羽叶栾树具备相同的生理和外部特性，因其生长迅速、抗烟尘、可三季观景的特点，常常被栽培于庭园和行道供观赏，其木材也可制家具，种子可用作油工业的材料；同时它的根和花还具有一定的药用价值。

[0005] 开发关于栾树属植物的分子标记，对栾树属植物的品种鉴定筛选以及优良树种的选育均具有重要意义，将为栾树属植物领域的相关研究发挥极其重要的作用。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供用于构建彩叶栾树品种指纹图谱的SSR引物；

[0007] 本发明所要解决的另一个技术问题是将所述SSR引物应用于构建彩叶栾树品种指纹图谱以及应用于品种鉴定。

[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

[0009] 本发明首先公开了用于构建彩叶栾树品种指纹图谱的SSR引物，选自以下13对引物中的任意一对或多对：

[0010] 引物对1：由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示上游引物和SEQ ID No.2所示下游引物组成；引物对2：由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示上游引物和SEQ ID No.4所示下游引物组成；引物对3：由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示上游引物和SEQ ID No.6所示下游引物组成；引物对4：由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示上游引物和SEQ ID No.8所示下游引物组成；引物对5：由核苷酸序列为SEQ ID No.9所示上游引物和SEQ ID No.10所示下游引物组成；引物对6：由核苷酸序列为SEQ ID No.11所示上游引物和SEQ ID No.12所示下游引物组成；引物对7：由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示上游引物和SEQ ID No.14所示下游引物组成；引物对8：由核苷酸序列为SEQ ID No.15所示上游引物和SEQ ID No.16所示下游引物组成；引物对9：由核苷酸序列为SEQ ID No.17所示上游引物和SEQ ID No.18所示下游引物组成；引物对10：由核苷酸序列为SEQ ID No.19所示上游引物和SEQ ID No.20所示下游引物组成；引物对11：由核苷酸序列为SEQ ID No.21所示上游引物和SEQ ID No.22所示下游引物组成；引物对12：由核苷酸序列为SEQ ID No.23所示上游引物和SEQ ID No.24所示下游引物组成；引物对13：由核苷酸序列为SEQ ID No.25所示上游引物和SEQ ID No.26所示下游引物组成。

[0011] 优选的，本发明用于构建彩叶栾树品种指纹图谱的SSR引物，包括以下7对引物：引物对2：由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示上游引物和SEQ ID No.4所示下游引物组成；引物对3：由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示上游引物和SEQ ID No.6所示下游引物组成；引物对4：由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示上游引物和SEQ ID No.8所示下游引物组成；引物对6：
由核苷酸序列为SEQ ID No.11所示上游引物和SEQ ID No.12所示下游引物组成；引物对8：
由核苷酸序列为SEQ ID No.15所示上游引物和SEQ ID No.16所示下游引物组成；引物对9：
由核苷酸序列为SEQ ID No.17所示上游引物和SEQ ID No.18所示下游引物组成；和引物对
12：由核苷酸序列为SEQ ID No.23所示上游引物和SEQ ID No.24所示下游引物组成。

[0012] 本发明所述彩叶栾树品种选自锦叶栾、晋栾1号、晋栾2号或晋栾3号。

[0013] 本发明根据栾树转录组数据进行了SSR引物的设计，并根据设计引物的稳定性、渗透性、产物的大小以及前后引物的Tm值差异进行了初步筛选，获得96对引物。本发明利用四个样本(栾树样本B1、B2；全缘叶栾树样本B3、B4)对所设计的96对引物的退火温度及扩增效果进行了初步筛选，结果在96对引物中有92对引物扩增出明确条带，其中27对为具有差异效果的引物，在总引物中占据了28％的比例，证明本发明所述SSR引物具有一定的多态性。

[0014] 本发明进一步通过对六个样本(栾树的四个变异品种锦叶栾、晋栾1号、晋栾2号和晋栾3号；2个栾树样本为对照)进行SSR扩增反应，对栾树的四个变异品种的特异SSR标记进行筛选。在初步筛选结果中，96对引物中共有25对引物在六个样本中具有疑似不一致的扩增效果，表现形式主要以条带长度不一致和部分样本为两条相近带等两种形式体现。根据琼脂糖凝胶电泳的结果，本发明从上述对栾树四个品种具有疑似差异扩增效果的引物中选择差异较为稳定、多态性好的13对引物，用于构建彩叶栾树四个品种的特异指纹图谱。

[0015] 本发明进一步公开了所述的SSR引物在构建彩叶栾树品种指纹图谱中的应用。

[0016] 本发明还公开了所述的SSR引物在彩叶栾树品种鉴定中的应用。

[0017] 本发明彩叶栾树品种指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)提取彩叶栾树样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以所述SSR引物为扩增引物，建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果对彩叶栾树样品DNA的扩增结果形成引物字母编号加扩增条带长度数字的带型编号，即得各个彩叶栾树品种的指纹图谱。

[0018] 如果一份彩叶栾树样品经同一对引物扩增同时出现多条条带，则依据分子量从小到大的顺序用“-”连接数字(分子量单位为bp，在这里省略单位，只记录数字)。

[0019] 其中，所述PCR反应体系包括：反应体系的总体积为25μL，其中，2×PCR MIX 12.5μl，DNA模板2μl，上游引物2μl，下游引物0.5μl，ddH2O3μl，M13蛋白5μl。所述PCR扩增的程序包括：94℃，3min→94℃，30s→(每对引物的退火温度+1℃)，30s→72℃，40s→94℃，30s→(每对引物的退火温度+0.5℃)，30s→72℃，40s→[94℃，30s→(每对引物的退火温度)，30s→72℃，40s]x35→72℃，7min→4℃，∞。其中，在上游引物5‘端添加核苷酸序列为SEQ ID No.27所示的M13蛋白的序列，然后再进行PCR扩增。每对引物的退火温度为：引物对1的退火温度为53℃；引物对2的退火温度为52℃；引物对3的退火温度为55℃；引物对4的退火温度为54℃；引物对5的退火温度为56℃；引物对6的退火温度为54℃；引物对7的退火温度为52℃；引物对8的退火温度为55℃；引物对9的退火温度为55℃；引物对10的退火温度为55℃；引物对11的退火温度为53℃；引物对12的退火温度为53℃；引物对13的退火温度为52℃。

[0020] 本发明将所筛选的差异较为稳定、多态性好的13对引物，按照固定顺序用大写字母编号，引物对1-13编号依次为A、B、C……M，通过毛细管电泳的结果，记录每份彩叶栾树样品经不同SSR引物对扩增出现的条带，依据长度从小到大的顺序记录各条带的长度(单位为bp，在这里省略单位bp，只记录数字)；如果一份彩叶栾树样品经同一对引物扩增同时出现多条条带，则用“-”连接数字。每个彩叶栾树样品的DNA经不同引物扩增后将会形成由字母和阿拉伯数字组成的一系列带型编号，便形成了该品种的SSR指纹图谱。

[0021] 本发明还公开了所述构建方法构建得到的彩叶栾树品种指纹图谱。

[0022] 其中，所述锦叶栾的指纹图谱为：C243-249D291-293F302H241I232L256；所述晋栾1号的指纹图谱为：B128-194C249D291-293F302H247I232L256；所述晋栾2号的指纹图谱为：
B128-134-194-203C243-247D291-293F302H247-256I232L256；所述晋栾3号的指纹图谱为：
B128-134-194-203C249D293F302H241-256I232L256。其中，B为引物对2的字母编号，C为引物对3的字母编号，D为引物对4的字母编号，F为引物对6的字母编号，H为引物对8的字母编号，I为引物对9的字母编号，L为引物对12的字母编号；数字为扩增条带的分子量。例如锦叶栾的指纹图谱中C243-249，则表示锦叶栾经C引物(即引物对3)扩增出现了长度分别为
243bp和249bp的2条条带。

[0023] 本发明还公开了一种用于彩叶栾树品种鉴定的试剂盒，包括：PCR扩增引物，2×PCR MIX和ddH2O，其中所述PCR扩增引物包括：引物对1-引物对13；优选的，包括引物对2、引物对3、引物对4、引物对6、引物对8、引物对9和引物对12。本发明所述试剂盒能够用于彩叶栾树品种锦叶栾、晋栾1号、晋栾2号和晋栾3号的准确鉴定。

[0024] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

[0025] 本发明利用转录组数据进行了栾树属植物SSR标记的开发。本发明从所设计的96对SSR引物中筛选出差异较为稳定、多态性好的13对引物，构建了四个彩叶栾树品种的特异指纹图谱，将为四个具备重要观赏价值的栾树品种的推广和规划奠定良好的基础。本发明所述SSR引物以及用其所构建的指纹图谱对栾树属植物的品种筛选和优良树种的选育等具有重要的价值。

附图说明

[0026] 图1为部分引物在栾树六个样品中扩增出的效果；其中，(a)为引物11、17、27、29对栾树六个样本的扩增结果，其中17号引物在B2、A1、A2三个样本中扩增出两条相近的条带，在其余样本中扩增出单条带；(b)为引物13、16、26、36对栾树六个样本的扩增结果，其中引物13在六个样本中均扩增出双条带，但条带亮度并不明显；(c)为引物21、23、24、30对栾树六个样本的扩增结果，其中引物21在A2、A4样本中扩增条带与其余样本有细微差异，引物30在样本A3中扩增条带与其余样本有细微差异；(d)为引物48、67、73、81对栾树六个样本的扩增结果，其中67号引物在A3、A4两个样本中扩增条带与其余样本有细微差异；(e)为引物56、59、60、61对栾树六个样本的扩增结果，其中引物60在B2、A2、A5三个样本中均扩增出两条相近条带，其余样本扩增出单条带；(f)为引物70、82、83、87对栾树六个样本的扩增结果，其中引物70、87未扩增出明确条带，引物82在B2样本中扩增出双条带，在A1样本中扩增出与其他样本大小不一致的单条带；(g)为引物71、74、75、85对栾树六个样本的扩增结果，其中引物
71在B2、A1样本中扩增出与其他样本不一致的单条带，引物74在A5样本中扩增出两条近似带，在其余样本中扩增出单条带；

[0027] 图2为部分毛细管电泳结果图(Gel Image)；其中，(a)、(b)、(c)分别为经由软件GeneMarker处理后引物17、48、92的毛细管电泳胶图显示结果，纵坐标为样本序号(1-7依次为样本B1、B2、A1、A2、A3、A4、A5)，横坐标为条带长度，方框中为扩增差异的条带；

[0028] 图3为部分毛细管电泳结果图；其中，(a)、(b)、(c)分别为经由软件GeneMarker处理后引物17、48、92的毛细管电泳峰图显示结果；纵坐标代表了引物在样本中的扩增效果，横坐标代表了扩增条带的长度；Sample1-7依次为样本B1、B2、A1、A2、A3、A4、A5；

[0029] 图4为部分毛细管电泳结果图；其中，(a)、(b)、(c)、(d)分别为经由软件GeneMarker处理后引物13、23、69、71的毛细管电泳峰图显示结果；纵坐标代表了引物在样本中的扩增效果，横坐标代表了扩增条带的长度；Sample 1-7依次为样本B1、B2、A1、A2、A3、A4、A5。

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

[0031] 实施例1用于构建栾树指纹图谱的SSR引物设计及筛选

[0032] 1、材料与方法

[0033] 1.1实验材料

[0034] 实验材料及其来源见表1，锦叶栾未正式命名分种，故没有列出学名。材料采集均采用了当年生枝条的幼嫩叶片。

[0035] 表1实验材料及来源

[0036]

[0037] 锦叶栾为栾树的芽接变种；晋栾1号、2号、3号，均为锦叶栾的种子实生苗选育品种，它们各自具备了与栾树和锦叶栾所不同的表型性状，主要表现在叶色、叶片大小以及嫩茎颜色方面，具体表型差异如表2所示。

[0038] 表2栾树特异品种的对比

[0039]

[0040] 1.2实验方法

[0041] 1.2.1基因组DNA的提取

[0042] 针对材料的来源与生理特性：对于北京地区的材料采取实验室内水培，取水培枝条上新发的幼嫩叶片为实验材料(注：实验期间室内平均温度为28℃，昼夜温差为10℃-12℃)；对于山西地区的实验材料，实地采取当年生叶片，保存于液氮中带回；取栾树新鲜叶片约100mg，加入液氮充分研磨后，采取改良的CTAB提取法对栾树样本进行了DNA提取。

[0043] 1.2.2SSR-PCR扩增

[0044] 1.2.2.1引物设计

[0045] 本发明SSR引物的设计采用构建基因组文库，筛选物种的SSR位点，根据位点两侧的序列来设计引物，由之前本发明人所在实验室获得的栾树转录组数据进行了SSR引物的设计，通过QDD软件对转录组数据进行处理后，根据设计引物的稳定性、渗透性、产物的大小以及前后引物的Tm值差异进行了初步筛选，获得并合成了96对引物，引物具体情况见表3。由于本发明设计引物的来源为转录组数据，故所用SSR标记分属于EST-SSR标记。

[0046] 表3SSR引物

[0047]

[0048]

[0049]

[0050] 1.2.2.2引物筛选

[0051] 对于所合成的96对引物，本发明在实验最初阶段使用四个样本DNA(B1、B2、B3和B4)进行了预实验，对于每对引物的退火温度则采取了三个梯度，以其前后引物Tm值的均值为中间体度，上下各浮动1℃，期望可以获得96对引物较适的退火温度，并验证其具有良好的多态性。

[0052] 1.2.2.3SSR-PCR反应体系的优化

[0053] 一个合适的SSR-PCR反应体系对于良好的实验结果的获得是必不可少的。根据本发明人实验室已有的实验基础，所采取的PCR反应体系在20μl和50μl反应体系中进行选择，具体反应体系见表4。

[0054] 表4SSR-PCR反应体系

[0055]

[0056] SSR-PCR反应程序设置为两部分，第一部分以合适的退火温度上浮1℃为基准，每个循环递减0.5℃，设置3个循环；第二部分以合适的退火温度为基准，设置35个循环，延伸时间均设置为40s，反应完成后，于琼脂糖凝胶电泳中进行初步检测。

[0057] 1.2.3毛细管电泳

[0058] 1.2.3.1设计引物

[0059] 从筛选好的引物中选择差异性稳定、多态性好的几对引物，重新合成引物，在所有前引物的5‘端添加M13蛋白的序列：TGTAAAACGACGGCCAGT。

[0060] 1.2.3.2PCR扩增

[0061] PCR退火温度和反应程序不变，以新合成的带有荧光蛋白序列的引物进行PCR反应扩增，PCR反应体系如下表5所示。

[0062] 表5SSR-PCR反应体系(加入荧光蛋白)

[0063]

[0064] 1.2.3.3检测及数据分析

[0065] PCR反应完成后，先进行琼脂糖凝胶电泳检测，条带确认无误后，送入公司进行检测，获得峰图后进行统计与列表。

[0066] 1.2.4指纹图谱构建

[0067] 指纹图谱的构建方法参考李瑞峰等(李瑞峰,高鹏,朱子成,栾非时.基于形态学标记及SSR标记的甜瓜主栽品种分类鉴定研究[J].中国蔬菜,2014,06:20-27.)的指纹图谱构建方法，从筛选好的引物中选择出差异较为稳定、多态性好的引物对，将其按照固定顺序用大写字母编号，通过利用毛细管电泳的结果，记录每对引物对七个栾树样品扩增结果，对四个彩叶栾树品种样品的DNA形成字母加数字的带型编号，将其作为每个品种的指纹图谱。

[0068] 2、实验结果

[0069] 2.1SSR-PCR反应体系的优化

[0070] 通过对样本B1、B2、B3和B4进行的预实验，50μl的反应体系效果较20μl显著，能够很好的避免操作过程中实验操作的误差，因此在本发明后期实验中均采用50μl反应体系。

[0071] 通过样本B1、B2、B3和B4对所设计的96对引物的退火温度进行了初步探索，对其效果进行了初步筛选，在96对引物中有92对引物扩增出明确条带，其中27对为具有差异效果的引物，在总引物中占据了28％的比例，因此可认定本发明所用引物具有一定的多态性。

[0072] SSR-PCR反应程序：94℃，3min→94℃，30s→(合适的退火温度+1℃)，30s→72℃，40s→94℃，30s→(合适的退火温度+0.5℃)，30s→72℃，40s→[94℃，30s→(合适的退火温度)，30s→72℃，40s]x35→72℃，7min→4℃，∞。每对引物合适的退火温度及扩增情况，则如表6所示。

[0073] 表6SSR引物退火温度及扩增情况总述

[0074]

[0075]

[0076]

[0077]

[0078] 2.2栾树属植物品种间SSR扩增差异

[0079] 通过对六个样本B2、A1、A2、A3、A4和A5进行SSR扩增反应，其中B2和A1为对照组，对栾树的四个变异品种(锦叶栾、晋栾1号、晋栾2号、晋栾3号)的特异SSR标记进行了筛选。在初步筛选结果中，96对引物中共有25对引物在六个样本中具有疑似不一致的扩增效果，表现形式主要以条带长度不一致和部分样本为两条相近带等两种形式体现(图1)。

[0080] 2.3栾树四个品种指纹图谱的构建

[0081] 根据琼脂糖凝胶电泳的结果，从对于栾树四个品种具有疑似差异扩增效果的引物中选取了13对引物，进行了毛细管电泳；根据毛细管电泳结果详细得出了每对引物在各个品种中扩增条带的长度，并结合引物的字母编号得出了四个品种的特异指纹图谱。

[0082] 指纹图谱构建所用引物的字母编号具体如表7所示，各个品种的指纹图谱如表8所示，部分毛细管电泳结果如图2、图3和图4所示。

[0083] 表7指纹图谱构建所用引物字母编号

[0084]

[0085]

[0086] 表8栾树四个品种的指纹图谱

[0087]

[0088] 引物13(字母编号为B)虽然在样本A2(锦叶栾)中扩增出128bp和194bp长度的峰，但其峰值较低(峰值至少在500bp以上才有价值)，且对样本A2用引物13进行重复验证，发现其峰值一直持续保持在低水平。因此为保证实验的准确性，本发明舍弃了引物13在样本A2中的扩增结果，将其扩增出的两个峰视为引物不特异造成的。