一种羊肚菌酒及其高效液相指纹图谱的建立方法

摘要

本发明提供了一种羊肚菌露酒的制作方法，所述方法为先将新鲜干净的羊肚菌分别进行高压80～120MPa处理8～15min，再‑30℃～‑25℃下冷冻1～2天，去除羊肚菌表面的霜花后，用基酒浸泡，即得一种风味独特、口感极佳的羊肚菌酒。之后采用高效液相色谱建立羊肚菌酒的指纹图谱。本发明的羊肚菌酒制作方法简单，且产品气味香醇，留香持久，可显著延长产品的褪色时间，有效地保持酒体的澄清性和稳定性。同时，建立的羊肚菌酒指纹图谱的方法容易实现，且方法的稳定性、重现性和专属性好，可为羊肚菌酒的质量控制提供参考。

权利要求

1.一种羊肚菌酒的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将新鲜采收羊肚菌洗净，沥干；

(2)高压和冷冻处理：将沥干后的羊肚菌装袋，密封，进行加压处理，所述的加压条件为

80～120MPa，加压时间为8～15min，加压温度设置为3℃；缓慢降压取出羊肚菌后迅速放入-

30～-25℃下冷冻1～2天；

(3)基酒浸泡处理：将上述冷冻羊肚菌取出除霜花后，用基酒浸泡，即得；

所述基酒为纯50～60度的清香型高粱酒；

所述浸泡时间为4-7个月；

所述羊肚菌与基酒重量比为1:50～100。

2.一种羊肚菌酒的高效液相指纹图谱建立方法，包括如下步骤：(1)供试品溶液制备：量取如权利要求1方法泡制的羊肚菌酒，抽滤后置旋转蒸发仪中减压浓缩，并使用乙醚进行萃取；

(2)高效液相色谱检测步骤(1)中萃取液：采用Ultimate AQ-C18色谱柱，4.6×250mm，5μm，柱温保持25～27℃之间，检测波长270nm，使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为

1mL/min；所述流动相A为体积比0.1％的甲酸水溶液，流动相B为体积比0.1％的甲酸乙腈溶液，按体积百分比计，洗脱梯度如下：

0-25min，流动相A为90％匀速变为87％，流动相B为10％匀速变为13％；

25-35min，流动相A为87％匀速变为80％，流动相B为13％匀速变为20％；

35-50min，流动相A为80％匀速变为30％，流动相B为20％匀速变为70％；

50-55min，流动相A为30％匀速变为90％，流动相B为70％匀速变为10％。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(1)中减压浓缩温度为55～65℃。

4.根据权利要求2-3任一项所述的方法，其中，所述羊肚菌酒的高效液相指纹图谱由5个指纹峰构成，所述指纹图谱的5个指纹峰的相对保留时间和相对标准偏差如下：a号峰：16.470min，RSD为0.16％；

b号峰：17.517min，RSD为0.04％；

c号峰：23.974min，RSD为1.30％；

d号峰：35.564min，RSD为0.35％；

e号峰：40.7 58min，RSD为0.35％。

说明书

一种羊肚菌酒及其高效液相指纹图谱的建立方法

技术领域

[0001] 本发明涉及饮食品领域，具体涉及一种羊肚菌酒的制作方法及其高效液相指纹图谱的建立方法。技术背景

[0002] 羊肚菌(Morchella esculenta)，俗称羊肚子，羊肚蘑，是世界著名的食药用菌。传统中医认为羊肚菌性平，味甘寒，无毒，具有消化助食、益肠胃、化痰理气、补肾、壮阳、提神醒脑之功能，有较高的食用、药用价值以及广阔的开发前景。《本草纲目》记载，羊肚菌对化痰理气、提神醒脑具有一定的作用。

[0003] 露酒在《中华人民共和国国家标准》中将定义为：以蒸馏酒、发酵酒或食用酒精为酒基，加入可食用或药食两用(或符合相关规定)的辅料或食品添加剂，进行调配、混合或再加工制成的、已改变了其原酒基风格的饮料酒。露酒本身具有其他酒类不可替代的特点，色泽多彩悦目，酒精含量居中，风味多样而独特，营养更为丰富，且具有一定的保健功能。最近几年，随着人们生活水平的提高，越来越多的人开始关注健康的保健食品。因羊肚菌营养丰富，风味独特，味道鲜美，含有多糖、氨基酸、脂肪酸和矿质元素等多种化学成分，其中，羊肚菌含有较为独特的风味，其主要源于其中含有的α-氨基异丁酸、2,4-二氨基异丁酸、顺-3-氨基酸等稀有氨基酸，而羊肚菌挥发性香气成分主要为1-辛烯-3-醇和沉香醇。因此，将羊肚菌作为药食两用的辅料加入到基酒中，不仅气味独特，营养丰富，具有保健作用，还可借酒的宣行药势之力，提高机体对药物的吸收。

[0004] 迄今为止，对羊肚菌酒研究较少，其中各类物质的成分和含量也尚不明确。发明专利ZL 101113397和CN 102807942提供了以高粱酒为基酒，以羊肚菌作为主辅料的一种组合物羊肚菌酒制备方法。这两篇文献都是以组合物为原料制作的酒，然而以组合物为原料制作的酒对羊肚菌酒的口感、风味、色泽等都有影响，不能体现羊肚菌的独特风味，且以常规的方法处理原辅料如直接浸泡，对长期保存的酒体澄清度和稳定性也有影响，且前处理过程简单，其营养物质不能很好融出。张青等在论文《发酵型羊肚菌保健酒的工艺研究》中提供了以羊肚菌液体深层发酵菌丝体为原料的羊肚菌保健酒制备工艺路线，结果表明羊肚菌菌丝体以料水比9:100，初始糖度11％，接种量7％，22℃发酵92h，获得的羊肚菌保健酒色泽、风味俱佳。然而，羊肚菌发酵菌丝体与子实体在化学成分、气味、口感等方面还是有很大的差异。目前尚未有只包括羊肚菌特有风味的露酒，其质量控制方法也有待研究。因此，本发明专利除了公开一种特殊的羊肚菌酒制备方法外，还将首次通过高效液相色谱建立羊肚菌酒的指纹图谱，为羊肚菌酒的质量控制提供参考。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的问题是就现有技术的不足提供一种制作羊肚菌酒的方法。该制作方法简单易行，通过对羊肚菌子实体的前处理，能够很好的保留其独特的芳香气味，再用特定的基酒浸泡，能很好的保留酒中羊肚菌的气味，显著延长产品的褪色时间，且获得的产品不仅气味香醇，留香持久，能够保持澄清，而且具有很好的保健作用。

[0006] 本发明的另一个目的是建立羊肚菌酒的指纹图谱。

[0007] 本发明的目的是通过以下技术条件来实现的。

[0008] 一方面，本发明提供了一种制作羊肚菌酒的方法，其中，所述方法包括：

[0009] (1)将新鲜采收羊肚菌洗净，沥干；

[0010] (2)高压和冷冻处理：将沥干后的羊肚菌装袋，密封，进行加压处理；缓慢降压取出羊肚菌后迅速放入-30℃～-25℃下冷冻1～2天；

[0011] (3)基酒浸泡处理：将上述冷冻羊肚菌取出除霜花后，用基酒浸泡，即得；

[0012] 所述基酒为纯50～60度的清香型高粱酒；

[0013] 所述浸泡时间为4-7个月；

[0014] 所述羊肚菌与基酒重量比为1:50～100；

[0015] 在一些实施例中，所述步骤(2)的加压条件为80～120MPa，加压时间为8～15min，加压温度设置为3℃。

[0016] 另一方面，本发明提供了一种利用高效液相色谱建立羊肚菌酒指纹图谱的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

[0017] (1)供试品溶液制备：量取本发明所述方法泡制的羊肚菌酒，抽滤后置旋转蒸发仪中减压浓缩，并使用乙醚进行萃取；

[0018] (2)高效液相色谱检测步骤(1)中萃取液：采用Ultimate AQ-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，柱温保持25～27℃之间，检测波长270nm，使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为1mL/min；所述流动相A为体积比0.1％的甲酸水溶液，流动相B为体积比0.1％的甲酸乙腈溶液，按体积百分比计，所述洗脱梯度如下：

[0019] 0-25min，流动相A为90％匀速变为87％，流动相B为10％匀速变为13％；

[0020] 25-35min，流动相A为87％匀速变为80％，流动相B为13％匀速变为20％；

[0021] 35-50min，流动相A为80％匀速变为30％，流动相B为20％匀速变为70％；

[0022] 50-55min，流动相A为30％匀速变为90％，流动相B为70％匀速变为10％。

[0023] 在一些实施例中，步骤(1)中减压浓缩温度为55～65℃。

[0024] 在一些实施例中，所述羊肚菌酒的高效液相指纹图谱由5个指纹峰构成，所述指纹图谱的5个指纹峰的相对保留时间和相对标准偏差如下：

[0025] a号峰：16.470min，RSD为0.16％；

[0026] b号峰：17.517min，RSD为0.04％；

[0027] c号峰：23.974min，RSD为1.30％；

[0028] d号峰：35.564min，RSD为0.35％；

[0029] e号峰：40.758min，RSD为0.35％。

[0030] 本发明具有如下有益效果：

[0031] 1.本发明采用加压处理羊肚菌，可促进酒体长期保持较好的澄清性和稳定性，且羊肚菌酒气味香醇，留香持久，长期保持色泽光亮。同时，加压处理后低温条件下冷冻1～2天，可以促使羊肚菌细胞间隙水形成冰晶，冰晶增大，刺破细胞壁，从而可使羊肚菌在基酒浸泡时其营养物质更好地的融出来。

[0032] 2.本发明使用低极性有机溶剂，如乙醚萃取羊肚菌酒中的化学物质，获得的高效液相色谱基线较稳定和特征峰较多，能够很好的表征羊肚菌酒的质量。

[0033] 3.本发明首次采用高效液相建立羊肚菌酒的指纹图谱，且方法的稳定性、专属性较好，为羊肚菌酒的质量控制提供参考。

[0034] 4.本发明提供制作羊肚菌酒的方法和建立羊肚菌酒指纹图谱的方法都简单易行，适合大规模工业化应用。

附图说明

[0035] 图1为不同萃取剂层在270nm处的色谱图比较(从下往上依次为：空白样品、水层萃取物、正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物和乙醚萃取物)。

[0036] 图2为乙醚层萃取物在不同波长下的色谱图比较(从下往上依次为：210nm，230nm，250nm，270nm，290nm，310nm，330nm和350nm)。

[0037] 图3为羊肚菌酒专属性指纹图谱。

[0038] 图4为羊肚菌酒特征指纹图谱。

具体实施方式

[0039] 为使本发明更容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施仅用于说明而不用于限制本发明的范围。

[0040] 实施例1：将1公斤新鲜羊肚菌进行清洗，沥干后，装袋，密封，进行加压处理，压力为80MPa，温度为3℃，加压时间8min。之后迅速将加压后的羊肚菌转移至-30℃下冷冻1天。取冷冻后的羊肚菌，去除霜花后，用50公斤50度的纯的清香型的大米酒浸泡4个月，即得。

[0041] 实施例2：将1公斤新鲜羊肚菌进行清洗，沥干后，装袋，密封，进行加压处理，压力为80MPa，温度为3℃，加压时间12min。之后迅速将加压后的羊肚菌转移至-30℃下冷冻1.5天。取冷冻后的羊肚菌，去除霜花后，用70公斤58度的纯的清香型的大米酒浸泡6个月，即得。

[0042] 实施例3：将1公斤新鲜羊肚菌进行清洗，沥干后，装袋，密封，进行加压处理，压力为100MPa，温度为3℃，加压时间12min。之后迅速将加压后的羊肚菌转移至-30℃下冷冻1.5天。取冷冻后的羊肚菌，去除霜花后，用80公斤55度的纯的清香型的高粱酒浸泡4个月，即得。

[0043] 实施例4：将1公斤新鲜羊肚菌进行清洗，沥干后，装袋，密封，进行加压处理，压力为100MPa，温度为3℃，加压时间12min。之后迅速将加压后的羊肚菌转移至-30℃下冷冻1.5天。取冷冻后的羊肚菌，去除霜花后，用60公斤58度的纯的清香型的高粱酒浸泡6个月，即得。

[0044] 实施例5：将1公斤新鲜羊肚菌进行清洗，沥干后，装袋，密封，进行加压处理，压力为120MPa，温度为3℃，加压时间12min。之后迅速将加压后的羊肚菌转移至-25℃下冷冻2天。取冷冻后的羊肚菌，去除霜花后，用100公斤58度的纯的清香型小麦酒浸泡5个月，即得。

[0045] 实施例6：将1公斤新鲜羊肚菌进行清洗，沥干后，装袋，密封，进行加压处理，压力为120MPa，温度为3℃，加压时间15min。之后迅速将加压后的羊肚菌转移至-25℃下冷冻2天。取冷冻后的羊肚菌，去除霜花后，用100公斤60度的纯的清香型小麦酒浸泡7个月，即得。

[0046] 此外，设置两个对照组，对照组1样品处理不加压，其他条件与实施例1相同；对照组2样品处理不加压，其他条件与实施例4相同。

[0047] 为验证本发明的有益效果，经10名专业评委组成的品评小组对各实施例所得酒通过以下几项指标来评价经过不同处理方法获得的羊肚菌酒：包括色泽、气味、口感、澄清性及稳定性、沉淀。如表1所示为8种不同羊肚菌样品处理方法获得的羊肚菌酒的结果。

[0048] 表1 8种不同羊肚菌样品处理方法获得的羊肚菌酒的评价结果

[0049]

[0050]

[0051] 由表1可知，通过比较加压处理和不经过加压处理的羊肚菌酒，可发现经过加压处理后的羊肚菌酒的酒体长期存放依然保持澄清，即酒体稳定较好，具有广阔的应用前景。根据10位品酒专家中的90％专家对实施例4所获得的羊肚菌酒评价最好。

[0052] 因此，选择通过加压和冷冻处理后用58度的纯的清香型的高粱酒浸泡6个月获得的羊肚菌酒作为分析羊肚菌酒特征性成分的样品。

[0053] 实施例7：羊肚菌酒的萃取物选择

[0054] 7.1仪器：高效液相色谱仪(Agilent 1260)，旋转蒸发仪(IKA HB10DS25，上海，中国)，冷冻离心机(Sigma-Aidrich，Sigma 3K15)，涡旋振荡器(Scientific Industries，Vortex Genie 2)，超纯水仪(Milligroe，Milli-Q Integral 10)。

[0055] 7.2试剂：乙醚，乙酸乙酯，正丁醇，无水甲醇，甲酸均为分析级试剂；HPLC用甲醇、乙腈均为色谱级；甲酸为阿拉丁色谱级。

[0056] 7.3溶液配制：80％甲醇：分别量取无水甲醇40mL，超纯水10mL，混匀。

[0057] 流动相A(0.1％甲酸水溶液)：取过0.2μm滤膜超纯水2L，加入2mL甲酸，混匀，超声15min。

[0058] 流动相B(0.1％甲酸乙腈溶液)：取色谱级乙腈1L，加入1mL甲酸，混匀，超声15min。

[0059] 7.4羊肚菌酒供试品溶液制备：准确量取上述实施例4中浸泡后的羊肚菌酒，抽滤后的样品50mL转移至于250mL茄形瓶中，置旋转蒸发仪中减压浓缩(55～65℃)至5mL左右，将浓缩液转移至50mL离心管中，5mL超纯水洗涤茄型瓶2次，合并浓缩液和洗涤液，用超纯水补至15mL。

[0060] 准确量取乙醚15mL加至浓缩液中，振荡30s，静置3min，再重复振荡静置2次，5500rpm离心5min，吸取上层乙醚层转移至另一50mL离心管中。再量取乙醚10mL加入水层继续萃取，重复2次，下层为水萃取物A1。合并三次上层乙醚萃取层，水浴(65～70℃)蒸干，得乙醚萃取物。然后量取等体积的乙酸乙酯加入到水萃取物A1中，按照上述石油醚萃取方法操作，分别得乙酸乙酯萃取物和下层水萃取物A2。最后量取等体积的正丁醇加入到水萃取物A2，按照石油醚萃取同样方法操作，分别得到正丁醇萃取物和水层萃取物A3。水层萃取物A3置旋转蒸发仪中减压浓缩(60～65℃)蒸干，得到最终水层萃取物。向上述乙醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水层萃取物中分别加1mL 80％甲醇复溶，之后复溶液分别过
0.22μm有机系滤膜，待用。

[0061] 7.5高效液相色谱检测：采用Welch Ultimate AQ-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，柱温保持25～27℃之间，检测波长270nm，并使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为1mL/min，进样量为20μL；所述流动相A为体积比0.1％的甲酸水溶液，流动相B为体积比
0.1％的甲酸乙腈溶液，按体积百分比计，所述洗脱梯度如下：

[0062] 0-25min，流动相A为90％匀速变为87％，流动相B为10％匀速变为13％；

[0063] 25-35min，流动相A为87％匀速变为80％，流动相B为13％匀速变为20％；

[0064] 35-50min，流动相A为80％匀速变为30％，流动相B为20％匀速变为70％；

[0065] 50-55min，流动相A为30％匀速变为90％，流动相B为70％匀速变为10％。

[0066] 7.6检测结果：如图1所示，从下往上依次为空白样品、水层萃取物、正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物和乙醚萃取物。由指纹图谱可知，水层萃取物和正丁醇层萃取物图谱中的色谱峰数目相对较少，且峰面积也比乙醚层萃取物和乙酸乙酯层萃取物小，原因可能是羊肚菌酒中所溶解的化学物质极性较小，易被小极性溶剂乙醚和乙酸乙酯所萃取。此外，乙醚层萃取物色谱图出峰时间比乙酸乙酯层萃取物出峰时间短，分离度更好，因此选择色谱峰信息较多、出峰时间较快和分离度较好的乙醚作为萃取溶剂。

[0067] 实施例8：检测波长的优化

[0068] 采用实施例7所述的乙醚层萃取物作为供试品，高效液相检测条件与实施例6相同，其中考察的检测波长为210nm，230nm，250nm，270nm，290nm，310nm，330nm和350nm，记录色谱图。

[0069] 通过紫外光谱对八个波长进行扫描，结果如图2所示，从下往上依次为210nm，230nm，250nm，270nm，290nm，310nm，330nm和350nm。由图可知，乙醚层萃取物在210nm和
230nm处的基线波动大；310nm，330nm和350nm处的色谱信息较少，峰面积也较小；270nm和
290nm处的峰信息较多，且270nm检测波长的谱线在41min左右的峰比290nm谱线的峰面积更大，因此选择波长为270nm作为羊肚菌酒的检测波长。

[0070] 实施例9：羊肚菌酒指纹图谱的方法学考察：

[0071] (1)专属性考察

[0072] 实验材料：

[0073] 表2实验材料

[0074]种类 酒基 酒基酒精度(％) 配方 泡制时间
空白 毛铺纯谷酒 50 N/A N/A
羊肚菌酒 毛铺纯谷酒 50 10.26g-1000mL 2015.09.29
玛咖酒 毛铺纯谷酒 50 5g-250mL 2015.12.04
虫草酒 仿茅台 53 70g-500mL 2015.11.30

[0075] 按照表2以纯50度的毛铺纯谷酒为基酒，分别泡制羊肚菌酒和吗啡酒，以及以仿茅台为基酒泡制虫草酒。分别取泡制后的羊肚菌酒、玛咖酒、虫草酒和对照组样品按实例7所述方法分别制备供试品溶液，并按照实施例7所述的高效液相色谱检测条件进行分析，记录色谱图。专属性结果如图3所示，空白对照样品在羊肚菌酒指纹图谱主要色谱峰处无干扰；玛咖酒指纹图谱在15min～18min，32min～35min处有羊肚菌酒所不具备的色谱峰组；虫草酒指纹图谱在11min左右有一特征峰，但不具备41min附近羊肚菌酒特征峰。因此玛咖酒、虫草酒和空白样品均能够与羊肚菌酒显著区分，羊肚菌酒指纹图谱专属性较好。

[0076] (2)羊肚菌酒指纹图谱的重复性

[0077] 取羊肚菌酒(基酒为毛铺纯谷酒)样品6份，按实例7所述方法分别制备供试品溶液，并根据其色谱检测条件进行检测，记录色谱图。以峰面积最大的色谱峰为参照峰，计算其它峰的相对保留时间和相对峰面积及RSD值。6份羊肚菌酒样品的指纹图谱如图4所示，a、b、c、d、e表示羊肚菌酒的5个特征峰。通过计算6份平行样品中5个特征峰的相对保留时间、相对峰面积、保留时间RSD和峰面积RSD可知，5个特征指纹峰的平均保留时间分别为16.470min、17.517min、23.974min、35.564min和40.759min，各特征峰保留时间RSD在1.5％以内，峰面积RSD在5.0％以内，如表3所示。

[0078] 表3羊肚菌酒HPLC指纹图谱中各特征峰的平均保留时间和平均峰面积[0079]峰号 平均保留时间RT(min) RSD(％) 平均峰面积(A) RSD(％)
a 16.470 0.16 2923419 4.44
b 17.517 0.04 18656145 4.87
c 23.974 1.30 897158 5.00
d 35.564 0.35 716861 2.03
e 40.759 0.35 1825589 3.12

[0080] (3)仪器精密度

[0081] 取实施例9项下(2)所制备的2号样品，连续进样6次；第二天取实施例9项下(2)所制备的2号样品，连续进样3次，检测并记录色谱图。以峰面积最大的色谱峰为参照峰，计算其它峰的相对保留时间和相对峰面积及RSD值。结果显示，相对保留时间RSD均小于0.6％，相对峰面积RSD均小于3％，符合实验对仪器精密度的要求。

[0082] (4)羊肚菌酒指纹图谱的稳定性

[0083] 取实施例9项下(2)所制备的3号样品，分别放置0h，12h，18h和24h后，采用HPLC进行测定并记录色谱图。以峰面积最大的色谱峰为参照峰，计算其它峰的相对保留时间和相对峰面积及RSD值。稳定性结果见表3，保留时间RSD小于1.7％，峰面积RSD小于5.0％，说明本研究建立的检测方法24h内稳定。

[0084] 表4羊肚菌酒指纹图谱稳定性

[0085]

[0086] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。