一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法

摘要

本发明属于生物技术育种技术领域，特别涉及一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法。一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：授粉、胚挽救时期、种子培养前处理、接种方式、增殖培养、生根培养、移栽前处理和移栽。本发明的方法可减少嫩种子的愈伤率，使胚挽救时期提前至授粉后第5d。通过暗培养处理使种子处于失绿状态，幼胚周围的液体消失，没有胚部分的种壳变得中空，不跟幼胚争夺养分，且由于失绿而减少愈伤率。

权利要求

1.一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)授粉：为苦瓜远缘杂交授粉或辐射花粉授粉；所述的苦瓜材料为MC6、MC8、MC9、MC39、MC72或MC143；辐射采用C060y射线辐射，辐射剂量为150GY；

(2)胚挽救时期：取授粉后第5～10d的果实；

(3)种子培养前处理：在无菌条件下，剖开果实取出种子，将种子置于MS培养基中，并于暗培养条件下培养10～15d；

(4)接种方式：前处理结束后，切掉大部分种子，保留1/4含胚部分，放入MS培养基中培养，经7～20d光培养后，挑出绿胚并继续放MS培养基中培养，直至胚萌发成苗；

(5)增殖培养：将含有子叶、真叶的苗，切掉顶芽并置于MS培养基培养，待子叶的腋芽长出后，切下腋芽继续置于MS培养基中培养；

(6)生根培养：将未生根的苗置于生根诱导培养基进行生根诱导，将已生根的苗直接进行移栽前处理；

(7)移栽前处理：将已生根的苗炼苗5～7d后，取出生根苗，洗净培养基，栽入基质中，盖膜保温保湿，温度25～30℃，湿度90～95％；

(8)移栽：掀开膜后保持基质湿润，喷1次营养液，以叶面不滴水珠为止，待根系发育成侧根发达的根团时，即可移栽定植。

2.根据权利要求1所述的提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的远缘杂交授粉为：把次日要开放的待改良的雌花套袋隔离，次日早上8～10时，采集当日开放、抗性好资源的雄花给套袋的雌花授粉，授粉后继续套袋隔离至座果，获得膨大果实。

3.根据权利要求2所述的提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，其特征在于，所述抗性好的资源指葫芦科中与苦瓜不同属的资源或苦瓜属中不同种的资源。

4.根据权利要求1所述的提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的辐射花粉授粉为：于早上8～10时采集次日开放的雄花，装入防水袋中，即进行C060y射线辐射，辐射剂量为150GY；并于取雄花当天下午把要授粉的雌花套袋，用辐照过的花粉授粉并作好标记，继续套袋隔离至座果，获得膨大果实。

5.根据权利要求1所述的提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，其特征在于，步骤(3)中暗培养条件为温度24～28℃，光照时间0h/d。

6.根据权利要求1所述的提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，其特征在于，步骤(4)中光培养条件为温度24～28℃，光强2000Lux，光照时间8h/d。

7.根据权利要求1所述的提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，其特征在于，步骤(6)中所述的生根诱导培养基为1/2MS+IBA0.05mg/L。

8.根据权利要求1所述的提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，其特征在于，步骤(7)中的基质是由蛭石和苦瓜专用基质按照体积比为1：1组成。

9.根据权利要求1所述的提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，其特征在于，步骤(8)中的营养液为大量元素减半的MS培养基。

说明书

一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术育种技术领域，特别涉及一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法。

背景技术

[0002] 苦瓜离体胚挽救是苦瓜种质创制的重要途径之一。该方法可用于远缘杂交，利用具有相关抗性的资源来改良栽培品种，通过转育相关基因提高抗病性，而具有综合抗性好的资源一般为葫芦科中与苦瓜不同属的资源或苦瓜属中不同种的资源。这些资源与常规栽培种进行杂交，往往产生胚败育的现象，不能成功获得杂交种，需要在胚败育前进行挽救。苦瓜离体胚挽救也可用于诱变育种，用辐照过已受损伤的花粉来刺激子房膨大，剖开膨大的果实取种子进行离体胚挽救来获得再生苗。苦瓜在离体培养的过程中，容易愈伤化，即使是在没有激素的MS培养基中也一样产生愈伤现象，愈伤化的组织极难分化不定芽，常是多次继代后褐化死亡。在进行胚挽救时，既要考虑胚挽救效果，又要考虑胚挽救时期，太早由于种子属于活动旺盛的分生组织，培养易愈伤化，种子也难从果实中分离出来，增加培养难度，降低出苗率。太晚，胚已败育，不能获得植株。

[0003] 因此，胚挽救时期、接种方式和防止种子愈伤化的方法是提高苦瓜胚挽救成苗的关键。目前，有关苦瓜离体胚挽救成苗的方法的研究还未见有相关报道。

[0004] 公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

[0005] 针对现有苦瓜离体胚挽救的不足，本发明公开了一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，解决苦瓜远缘杂交胚败育问题，提高辐射花粉授粉离体胚的成苗率，推进苦瓜抗性育种进程。

[0006] 为了实现上述目的，本发明是采用以下技术方案实现：

[0007] 一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：

[0008] (1)授粉：为远缘杂交授粉或辐射花粉授粉；

[0009] (2)胚挽救时期：取授粉后第5～10d的果实；

[0010] (3)种子培养前处理：在无菌条件下，剖开果实取出种子，将种子置于MS培养基中，并于暗培养条件下培养10～15d；

[0011] (4)接种方式：前处理结束后，切掉大部分种子，保留1/4含胚部分，放入MS培养基中培养，经7～20d光培养后，挑出绿胚并继续放MS培养基中培养，直至胚萌发成苗；

[0012] (5)增殖培养：将含有子叶、真叶的苗，切掉顶芽并置于MS培养基培养，待子叶的腋芽长出后，切下腋芽继续置于MS培养基中培养；

[0013] (6)生根培养：将未生根的苗置于生根诱导培养基进行生根诱导，将已生根的苗直接进行移栽前处理；

[0014] (7)移栽前处理：将已生根的苗炼苗5～7d后，取出生根苗，洗净培养基，栽入基质中，盖膜保温保湿，温度25～30℃，湿度90～95％；

[0015] (8)移栽：掀开膜后保持基质湿润，喷1次营养液，以叶面不滴水珠为止，待根系发育成侧根发达的根团时，即可移栽定植。

[0016] 作为优选，步骤(1)中所述的远缘杂交授粉为：把次日要开放的待改良的雌花套袋隔离，次日早上8～10时，采集当日开放、抗性好资源的雄花给套袋的雌花授粉，授粉后继续套袋隔离至座果，获得膨大果实。

[0017] 作为优选，所述抗性好的资源指葫芦科中与苦瓜不同属的资源或苦瓜属中不同种的资源。

[0018] 作为优选，步骤(1)中所述的辐射花粉授粉为：于早上8～10时采集次日开放的雄花，装入防水袋中，即进行C060y射线辐射，辐射剂量为150GY；并于取雄花当天下午把要授粉的雌花套袋，用辐照过的花粉授粉并作好标记，继续套袋隔离至座果，获得膨大果实。

[0019] 作为优选，步骤(3)中暗培养条件为温度24～28℃，光照时间0h/d。

[0020] 作为优选，步骤(4)中光培养条件为温度24～28℃，光强2000Lux，光照时间8h/d。

[0021] 作为优选，步骤(6)中所述的生根诱导培养基为1/2MS+IBA 0.05mg/L。

[0022] 作为优选，步骤(7)中的基质是由蛭石和苦瓜专用基质按照体积比为1：1组成。

[0023] 作为优选，步骤(8)中的营养液为大量元素减半的MS培养基。

[0024] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0025] (1)本发明的方法可减少嫩种子的愈伤率，使胚挽救时期提前至授粉后第5d；通过暗培养处理使种子处于失绿状态，幼胚周围的液体消失，没有胚部分的种壳变得中空，不跟幼胚争夺养分，且由于失绿而减少愈伤率。

[0026] (2)本发明的方法可提高离体胚挽救的效率，可使胚萌发成苗率提高15％以上。由于整个种子培养幼胚难以突破种皮，几乎没有成苗。切掉大部分种子，培养1/4含胚部分，有利幼胚吸收培养基中营养，促进生长发育；同时有利减少人工剥离种壳取胚的工作量，减少污染机率，大大减少影响成苗率的人为因素。

[0027] (3)本发明的方法可解决苦瓜远缘杂交胚败育问题，提高辐射花粉授粉离体胚的成苗率，推进苦瓜抗性育种进程。

具体实施方式

[0028] 下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

[0029] 实施例1：

[0030] 一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：

[0031] (1)授粉：本试验采用的苦瓜材料为MC6；为远缘杂交授粉；所述的远缘杂交授粉为：把次日要开放的待改良的雌花套袋隔离，次日早上8时，采集当日开放、抗性好资源的雄花给套袋的雌花授粉，授粉后继续套袋隔离至座果，获得膨大果实；所述抗性好的资源指葫芦科中与苦瓜不同属的资源或苦瓜属中不同种的资源；

[0032] (2)胚挽救时期：取授粉后第5d的果实；

[0033] (3)种子培养前处理：在无菌条件下，剖开果实取出种子，将种子置于MS培养基中，并于暗培养条件下培养10d；暗培养条件为温度24℃，光照时间0h/d；

[0034] (4)接种方式：前处理结束后，切掉大部分种子，保留1/4含胚部分，放入MS培养基中培养，经7d光培养后，挑出绿胚并继续放MS培养基中培养，直至胚萌发成苗；光培养条件为温度24℃，光强2000Lux，光照时间8h/d；

[0035] (5)增殖培养：将含有子叶、真叶的苗，切掉顶芽并置于MS培养基培养，待子叶的腋芽长出后，切下腋芽继续置于MS培养基中培养；

[0036] (6)生根培养：将未生根的苗置于生根诱导培养基进行生根诱导，将已生根的苗直接进行移栽前处理；所述的生根诱导培养基为1/2MS+IBA 0.05mg/L；

[0037] (7)移栽前处理：将已生根的苗炼苗5d后，取出生根苗，洗净培养基，栽入基质中，盖膜保温保湿，温度25℃，湿度90％；基质是由蛭石与苦瓜专用基质的体积比为1：1组成；所述的苦瓜专用基质为长春赛世农业开发有限责任公司生产的全价育苗基质；

[0038] (8)移栽：掀开膜后保持基质湿润，喷1次营养液，以叶面不滴水珠为止，待根系发育成侧根发达的根团时，即可移栽定植；营养液为大量元素减半的MS培养基。

[0039] 实施例2：

[0040] 一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：

[0041] (1)授粉：本试验采用的苦瓜材料为MC8；为辐射花粉授粉；所述的辐射花粉授粉为：于早上8时采集次日开放的雄花，装入防水袋中，即进行C060y射线辐射，辐射剂量为150GY；并于取雄花当天下午把要授粉的雌花套袋，用辐照过的花粉授粉并作好标记，继续套袋隔离至座果，获得膨大果实；

[0042] (2)胚挽救时期：取授粉后第5d的果实；

[0043] (3)种子培养前处理：在无菌条件下，剖开果实取出种子，将种子置于MS培养基中，并于暗培养条件下培养10d；暗培养条件为温度24℃，光照时间0h/d；

[0044] (4)接种方式：前处理结束后，切掉大部分种子，保留1/4含胚部分，放入MS培养基中培养，经20d光培养后，挑出绿胚并继续放MS培养基中培养，直至胚萌发成苗；光培养条件为温度28℃，光强2000Lux，光照时间8h/d；

[0045] (5)增殖培养：将含有子叶、真叶的苗，切掉顶芽并置于MS培养基培养，待子叶的腋芽长出后，切下腋芽继续置于MS培养基中培养；

[0046] (6)生根培养：将未生根的苗置于生根诱导培养基进行生根诱导，将已生根的苗直接进行移栽前处理；所述的生根诱导培养基为1/2MS+IBA 0.05mg/L；

[0047] (7)移栽前处理：将已生根的苗炼苗7d后，取出生根苗，洗净培养基，栽入基质中，盖膜保温保湿，温度30℃，湿度95％；基质是由蛭石与苦瓜专用基质的体积比为1：1组成；所述的苦瓜专用基质为长春赛世农业开发有限责任公司生产的全价育苗基质；

[0048] (8)移栽：掀开膜后保持基质湿润，喷1次营养液，以叶面不滴水珠为止，待根系发育成侧根发达的根团时，即可移栽定植；营养液为大量元素减半的MS培养基。

[0049] 实施例3：

[0050] 一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：

[0051] (1)授粉：本试验采用的苦瓜材料为MC9；为远缘杂交授粉；所述的远缘杂交授粉为：把次日要开放的待改良的雌花套袋隔离，次日早上9时，采集当日开放、抗性好资源的雄花给套袋的雌花授粉，授粉后继续套袋隔离至座果，获得膨大果实；所述抗性好的资源指葫芦科中与苦瓜不同属的资源或苦瓜属中不同种的资源；

[0052] (2)胚挽救时期：取授粉后第8d的果实；

[0053] (3)种子培养前处理：在无菌条件下，剖开果实取出种子，将种子置于MS培养基中，并于暗培养条件下培养12d；暗培养条件为温度26℃，光照时间0h/d；

[0054] (4)接种方式：前处理结束后，切掉大部分种子，保留1/4含胚部分，放入MS培养基中培养，经10d光培养后，挑出绿胚并继续放MS培养基中培养，直至胚萌发成苗；光培养条件为温度25℃，光强2000Lux，光照时间8h/d；

[0055] (5)增殖培养：将含有子叶、真叶的苗，切掉顶芽并置于MS培养基培养，待子叶的腋芽长出后，切下腋芽继续置于MS培养基中培养；

[0056] (6)生根培养：将未生根的苗置于生根诱导培养基进行生根诱导，将已生根的苗直接进行移栽前处理；所述的生根诱导培养基为1/2MS+IBA 0.05mg/L；

[0057] (7)移栽前处理：将已生根的苗炼苗6d后，取出生根苗，洗净培养基，栽入基质中，盖膜保温保湿，温度28℃，湿度92％；基质是由蛭石与苦瓜专用基质的体积比为1：1组成；所述的苦瓜专用基质为长春赛世农业开发有限责任公司生产的全价育苗基质；

[0058] (8)移栽：掀开膜后保持基质湿润，喷1次营养液，以叶面不滴水珠为止，待根系发育成侧根发达的根团时，即可移栽定植；营养液为大量元素减半的MS培养基。

[0059] 实施例4：

[0060] 一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：

[0061] (1)授粉：本试验采用的苦瓜材料为MC39；为辐射花粉授粉；所述的辐射花粉授粉为：于早上8时采集次日开放的雄花，装入防水袋中，即进行C060y射线辐射，辐射剂量为150GY；并于取雄花当天下午把要授粉的雌花套袋，用辐照过的花粉授粉并作好标记，继续套袋隔离至座果，获得膨大果实；

[0062] (2)胚挽救时期：取授粉后第5d的果实；

[0063] (3)种子培养前处理：在无菌条件下，剖开果实取出种子，将种子置于MS培养基中，并于暗培养条件下培养10d；暗培养条件为温度24℃，光照时间0h/d；

[0064] (4)接种方式：前处理结束后，切掉大部分种子，保留1/4含胚部分，放入MS培养基中培养，经7d光培养后，挑出绿胚并继续放MS培养基中培养，直至胚萌发成苗；光培养条件为温度24℃，光强2000Lux，光照时间8h/d；

[0065] (5)增殖培养：将含有子叶、真叶的苗，切掉顶芽并置于MS培养基培养，待子叶的腋芽长出后，切下腋芽继续置于MS培养基中培养；

[0066] (6)生根培养：将未生根的苗置于生根诱导培养基进行生根诱导，将已生根的苗直接进行移栽前处理；所述的生根诱导培养基为1/2MS+IBA 0.05mg/L；

[0067] (7)移栽前处理：将已生根的苗炼苗5d后，取出生根苗，洗净培养基，栽入基质中，盖膜保温保湿，温度25℃，湿度90％；基质是由蛭石与苦瓜专用基质的体积比为1：1组成；所述的苦瓜专用基质为长春赛世农业开发有限责任公司生产的全价育苗基质；

[0068] (8)移栽：掀开膜后保持基质湿润，喷1次营养液，以叶面不滴水珠为止，待根系发育成侧根发达的根团时，即可移栽定植；营养液为大量元素减半的MS培养基。

[0069] 实施例5：

[0070] 一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：

[0071] (1)授粉：本试验采用的苦瓜材料为MC72；为远缘杂交授粉；所述的远缘杂交授粉为：把次日要开放的待改良的雌花套袋隔离，次日早上10时，采集当日开放、抗性好资源的雄花给套袋的雌花授粉，授粉后继续套袋隔离至座果，获得膨大果实；所述抗性好的资源指葫芦科中与苦瓜不同属的资源或苦瓜属中不同种的资源；

[0072] (2)胚挽救时期：取授粉后第10d的果实；

[0073] (3)种子培养前处理：在无菌条件下，剖开果实取出种子，将种子置于MS培养基中，并于暗培养条件下培养15d；暗培养条件为温度28℃，光照时间0h/d；

[0074] (4)接种方式：前处理结束后，切掉大部分种子，保留1/4含胚部分，放入MS培养基中培养，经20d光培养后，挑出绿胚并继续放MS培养基中培养，直至胚萌发成苗；光培养条件为温度28℃，光强2000Lux，光照时间8h/d；

[0075] (5)增殖培养：将含有子叶、真叶的苗，切掉顶芽并置于MS培养基培养，待子叶的腋芽长出后，切下腋芽继续置于MS培养基中培养；

[0076] (6)生根培养：将未生根的苗置于生根诱导培养基进行生根诱导，将已生根的苗直接进行移栽前处理；所述的生根诱导培养基为1/2MS+IBA0.05mg/L；

[0077] (7)移栽前处理：将已生根的苗炼苗7d后，取出生根苗，洗净培养基，栽入基质中，盖膜保温保湿，温度30℃，湿度95％；基质是由蛭石与苦瓜专用基质的体积比为1：1组成；所述的苦瓜专用基质为长春赛世农业开发有限责任公司生产的全价育苗基质；

[0078] (8)移栽：掀开膜后保持基质湿润，喷1次营养液，以叶面不滴水珠为止，待根系发育成侧根发达的根团时，即可移栽定植；营养液为大量元素减半的MS培养基。

[0079] 实施例6：

[0080] 一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：

[0081] (1)授粉：本试验采用的苦瓜材料为MC143；为辐射花粉授粉；所述的辐射花粉授粉为：于早上9时采集次日开放的雄花，装入防水袋中，即进行C060y射线辐射，辐射剂量为150GY；并于取雄花当天下午把要授粉的雌花套袋，用辐照过的花粉授粉并作好标记，继续套袋隔离至座果，获得膨大果实；

[0082] (2)胚挽救时期：取授粉后第8d的果实；

[0083] (3)种子培养前处理：在无菌条件下，剖开果实取出种子，将种子置于MS培养基中，并于暗培养条件下培养13d；暗培养条件为温度25℃，光照时间0h/d；

[0084] (4)接种方式：前处理结束后，切掉大部分种子，保留1/4含胚部分，放入MS培养基中培养，经15d光培养后，挑出绿胚并继续放MS培养基中培养，直至胚萌发成苗；光培养条件为温度26℃，光强2000Lux，光照时间8h/d；

[0085] (5)增殖培养：将含有子叶、真叶的苗，切掉顶芽并置于MS培养基培养，待子叶的腋芽长出后，切下腋芽继续置于MS培养基中培养；

[0086] (6)生根培养：将未生根的苗置于生根诱导培养基进行生根诱导，将已生根的苗直接进行移栽前处理；所述的生根诱导培养基为1/2MS+IBA0.05mg/L；

[0087] (7)移栽前处理：将已生根的苗炼苗6d后，取出生根苗，洗净培养基，栽入基质中，盖膜保温保湿，温度28℃，湿度93％；基质是由蛭石与苦瓜专用基质的体积比为1：1组成；所述的苦瓜专用基质为长春赛世农业开发有限责任公司生产的全价育苗基质；

[0088] (8)移栽：掀开膜后保持基质湿润，喷1次营养液，以叶面不滴水珠为止，待根系发育成侧根发达的根团时，即可移栽定植；营养液为大量元素减半的MS培养基。

[0089] 对实施例1～6中本发明方法中的种子培养前处理和接种方式具体操作进行统计调查，结果体现在嫩种子的愈伤率及胚萌发成苗率等指标。

[0090] 表1中实施例1～6与对照1～6为苦瓜材料相同，但是对照1～6为未经种子培养前处理且直接在光下培养；表2中实施例1～6与对照1～6为苦瓜材料相同，均经种子培养前处理，实施例1～6为采用含胚部分接种方式，对照1～6为培养整粒种子的接种方式，结果详见表1～2。

[0091] 表1本发明的方法对愈伤率及出苗率的影响

[0092]

[0093] 由表1可知，实施例1～6中整个种子经过10d左右的暗处理，然后再切块，接种含胚部分，转光下培养，出苗率均在16.7％以上；实施例1～6中的愈伤率均在10％以下，远低于对照。说明本发明的方法中种子培养前处理采用暗培养操作可减少嫩种子的愈伤率，使种子处于失绿状态，幼胚周围的液体消失，没有胚部分的种壳变得中空，不跟幼胚争夺养分，胚可充分吸收培养基中的养分，提高出苗率。

[0094] 表2本发明的方法对出苗率的影响

[0095]

[0096] 由表2可知，对照1～6中以整个种子作为培养对象，最后的出苗率均为0，表明幼胚没有能力突破种皮而萌发成苗，也可能是种皮阻碍了胚吸收养分而停止发育；而实施例1～6中种子培养前处理采用暗培养操作，并接种含胚部分种子，出苗率均在15％以上。

[0097] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。