一种生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法

摘要

本发明公开了一种生物降解番茄红素生成6‑甲基‑5‑庚烯‑2‑酮和异辛二烯酮的方法，所述的方法是利用蜡状芽孢杆菌降解番茄红素生成6‑甲基‑5‑庚烯‑2‑酮和异辛二烯酮。本发明首次采用蜡状芽孢杆菌降解番茄红素，生成香味物质6‑甲基‑5‑庚烯‑2‑酮和异辛二烯酮，开辟了微生物降解番茄红素生成香味物质的新途径，具有反应条件温和、易分离、绿色环保等特点。本发明通过对比不同底物浓度的降解效果，发现番茄红素在发酵培养基中的浓度为300～500mg/L时，番茄红素降解最佳。

权利要求

1.一种生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法，其特征在于，所述的方法是利用蜡状芽孢杆菌降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮；所述的蜡状芽孢杆菌的菌种编号为【CICC 10040】。

2.根据权利要求1所述的生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法，其特征在于，所述的方法是将番茄红素溶液加入发酵培养基中，再加入蜡状芽孢杆菌种子液，蜡状芽孢杆菌降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮。

3.根据权利要求2所述的生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法，其特征在于，所述的方法是将番茄红素溶液加入发酵培养基中，至番茄红素的终浓度≤500mg/L，再加入蜡状芽孢杆菌种子液，蜡状芽孢杆菌降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-

2-酮和异辛二烯酮。

4.根据权利要求2或3所述的生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法，其特征在于，所述的番茄红素溶液的制备方法为：将200mg番茄红素分散在2g吐温80中，得到番茄红素分散液，再将番茄红素分散液溶解在400mL二氯甲烷中，溶解完全后将二氯甲烷减压蒸出，减压蒸出后的残留物溶解在10mL乙醇中即得。

5.根据权利要求2或3所述的生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法，其特征在于，所述的蜡状芽孢杆菌种子液与发酵培养基的体积比为1-2:100。

6.根据权利要求2或3所述的生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的配方为：酵母粉3g、蛋白胨10g、NaCl 10g、葡萄糖1g、蒸馏水1L；pH 6.5-7.5。

7.根据权利要求1-3任一项所述的生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法，其特征在于，所述的蜡状芽孢杆菌降解番茄红素的条件为：30-37℃、150-

200 r/min摇床培养65-75h。

8.根据权利要求7所述的生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法，其特征在于，所述的蜡状芽孢杆菌降解番茄红素的条件为：35℃、150r/min摇床培养

72h。

说明书

一种生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯

酮的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物降解番茄红素的方法，特别涉及一种利用蜡状芽孢杆菌降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

[0002] 番茄红素是一种不含氧的类胡萝卜素，又称ψ-胡萝卜素，由于最早从番茄中分离制得，故称番茄红素。番茄红素主要存在于茄科植物西红柿的成熟果实中，是众多香味物质的前体物。例如，六氢番茄红素可经降解分生成茄酮、甲基辛烯酮及其衍生物、香叶基丙酮或金合欢基丙酮等芳香物质，这些芳香物质是植物花香和果香的来源，且香气阈值很低，在制备香精香料方面具有重要价值。

[0003] 番茄红素的降解方法有三种，分别为物理降解即热裂解法，化学降解即氧化降解法和生物降解法。目前关于番茄红素降解的报道主要集中于物理降解和化学降解，而生物降解法尤其是利用酶和微生物来降解番茄红素产生香味物质的研究还很少。生物法降解番茄红素与物理降解和化学降解相比较具有以下两个方面的显著优点：首先生物法降解利用了酶催化的专一性，得到成分相对单一的香味物质。其次，生物法降解得到的香味物质被认定为“天然成分”。因此，生物降解番茄红素越来越受到大家的关注。

[0004] 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus strain)是芽胞杆菌属(Bacillus)中的一种。蜡状芽胞杆菌广泛的存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处，是典型的菌体细胞。蜡状芽孢杆菌可产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的营养成分，改善生态环境；可产生细菌蛋白酶；可用于麻脱胶，是各种抗生素抗菌活性的测定菌；可用于明胶液化，牛奶胨化，还原硝酸盐，水解淀粉。但是未有文献报道其可以降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮。

发明内容

[0005] 为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法，该方法利用蜡状芽孢杆菌降解番茄红素，能够得到具有香味的物质6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮，方法简单、转化率高。

[0006] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

[0007] 一种生物降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的方法，所述的方法是利用蜡状芽孢杆菌降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮。

[0008] 具体的，所述的方法是将番茄红素溶液加入发酵培养基中，再加入蜡状芽孢杆菌种子液，蜡状芽孢杆菌降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮。

[0009] 优选的，所述的方法是将番茄红素溶液加入发酵培养基中，至番茄红素的终浓度≤500mg/L，再加入蜡状芽孢杆菌种子液，蜡状芽孢杆菌降解番茄红素生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮。

[0010] 所述的番茄红素溶液的制备方法为：将200mg番茄红素分散在2g吐温80中，得到番茄红素分散液，再将番茄红素分散液溶解在400mL二氯甲烷中，溶解完全后将二氯甲烷减压蒸出，减压蒸出后的残留物溶解在10mL乙醇中即得。

[0011] 所述的蜡状芽孢杆菌种子液与发酵培养基的体积比为1-2:100。

[0012] 所述的发酵培养基的配方为：酵母粉3g、蛋白胨10g、NaCl 10g、葡萄糖1g、蒸馏水1L；pH 6.5-7.5。

[0013] 所述的蜡状芽孢杆菌降解番茄红素的条件为：30-37℃、150-200r/min摇床培养65-75h。

[0014] 优选的，所述的蜡状芽孢杆菌降解番茄红素的条件为：35℃、150r/min摇床培养72h。

[0015] 本发明利用的番茄红素降解生成6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮的路径图见图1。

[0016] 本发明的有益效果：

[0017] 1、6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮是重要的香味物质，广泛使用在日化香精和烟用香精中，在烟草中添加少量的6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮就能够很大程度上提升烟草品质。本发明首次采用蜡状芽孢杆菌降解番茄红素，生成香味物质6-甲基-5-庚烯-2-酮和异辛二烯酮，开辟了微生物降解番茄红素生成香味物质的新途径，具有反应条件温和、易分离、绿色环保等特点。

[0018] 2、本发明的发酵培养基是通过反复筛选，最终得到的最佳发酵培养基。本发明的最佳发酵培养基，能够提高蜡状芽孢杆菌的活性，从而提高番茄红素的降解率。采用本发明的发酵培养基，使番茄红素降解率从最初的48.3％提高到74.8％，与初始的发酵培养基相比提高了54.9％。

[0019] 3、番茄红素溶液的浓度太高，会对微生物有毒害作用，影响微生物的生长及对番茄红素的降解效果，因此本发明通过对比不同底物浓度的降解效果，发现番茄红素在发酵培养基中的浓度为300～500mg/L时，番茄红素降解最佳。

[0020] 4、实验证明，蜡状芽孢杆菌在35℃、pH 7.0、150r/min、番茄红素终浓度300mg/L的条件下降解番茄红素，其细胞生物量在72h时OD600达到最高值3.972；番茄红素含量随着时间变化而减小，番茄红素的降解率随着时间变化而增大，在72h时番茄红素的降解率达到74.8％。

[0021] 5、本发明的方法简单、操作方便、生产成本低，易于工业化推广，具有良好的社会和经济效益。

附图说明

[0022] 图1为番茄红素降解路径图。

[0023] 图2为番茄红素的标准曲线图。

[0024] 图3为番茄红素浓度的筛选图。

[0025] 图4为蜡状芽孢杆菌的生长曲线图。

[0026] 图5为发酵降解过程中番茄红素含量的变化图。

[0027] 图6为番茄红素降解产物GC-MS分析总离子流图。

[0028] 图7为图6中降解产物I的质谱图。

[0029] 图8为图6中降解产物II的质谱图。

具体实施方式

[0030] 以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

[0031] 本发明所采用的生物降解番茄红素的菌种为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其菌种编号为【CICC 10040】，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

[0032] 蜡状芽孢杆菌种子液的制备方法：种子液培养基为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，蒸馏水1L，pH＝7.0-7.2，将每5mL的种子液培养基装到试管中，密封后在121℃的高温下灭菌20min，冷却至室温待用。挑选单菌落接种到种子液培养基中，放置于35℃、150r/min的摇床中进行发酵培养，反应至菌液浓度测得OD600值为3.5～4.0时，将种子液放置在4℃冰箱中备用。

[0033] 实施例1

[0034] 首先配置用于番茄红素降解的发酵培养基：酵母粉3g、蛋白胨10g、NaCl 10g、葡萄糖1g、蒸馏水1L，调节pH至7.0，将每100mL的发酵培养基装在250mL的三角瓶中，密封后在121℃的高温下灭菌20min，冷却至室温待用。

[0035] 番茄红素溶液的配制：将200mg的番茄红素分散在2g吐温80中，得到番茄红素分散液，再将番茄红素分散液溶解在400mL二氯甲烷中，溶解完全后将二氯甲烷减压蒸出，减压蒸出后的残留物溶解在10mL乙醇中；将番茄红素溶液过0.45μm的有机滤膜，除去内部的杂菌，即得。

[0036] 生物降解过程：将番茄红素溶液分别加入到多个发酵培养基中，至番茄红素的终浓度分别为100、200、300、400、500、600mg/L。再分别接种1.0mL蜡状芽孢杆菌种子液到发酵培养基中，放置于35℃、150r/min的摇床中进行发酵培养。反应72h后测量发酵液中的菌体浓度以及番茄红素降解量。

[0037] 发酵液中菌体浓度的测定方法为，取1mL发酵液稀释3倍，用紫外分光光度计测量稀释后的发酵液(菌液)在600nm时的OD值，再乘以稀释倍数(同时设置有未加番茄红素的培养基作为对照)。

[0038] 发酵液中番茄红素降解量的测定方法如下：

[0039] 发酵液在避光条件下，高速离心(4℃，6500r/min，30min)，将分离出的上清取出来，加入等体积二氯甲烷反复萃取3次，得到番茄红素发酵提取物，加入无水Na2SO4干燥过夜，真空浓缩，蒸干溶剂，再加2mL甲醇，过0.45μm的有机滤膜，除去内部的杂菌后，进行HPLC分析(实验组)，并以等体积不接蜡状芽孢杆菌培养基作为对照。

[0040] HPLC分析的条件：色谱柱选择C18柱(4.6mm×250mm，粒径为5μm)，柱温为30℃，流动相为甲醇：水(1:99体积比)，流速为0.6mL/min，波长为460nm，进样量为5μL。

[0041] 番茄红素标准曲线的绘制：分别以甲醇配制0、100、200、300、400、500、600mg/L的番茄红素标准溶液，根据建立的色谱条件进行HPLC分析后，以峰面积为纵坐标(Y)，横坐标(X)代表质量浓度，制作出标准曲线(图2)。

[0042] 发酵液中番茄红素浓度的计算方法：根据标准曲线峰可知，面积(Y)与浓度(X)的回归方程为Y＝13.217X+91.159，相关系数R2＝0.9976，表明在0～600mg/L浓度范围内，番茄红素浓度与峰面积线性关系良好。

[0043] 番茄红素降解率计算公式：

[0044]

[0045] 式中：C实验，实验组中番茄红素的浓度，单位mg/L；C对照，对照组中番茄红素的浓度，单位mg/L。

[0046] 番茄红素降解量计算公式：

[0047] 番茄红素降解量＝番茄红素降解率*番茄红素加入时的浓度

[0048] 番茄红素浓度对降解效果的影响如图3所示。在发酵培养基中番茄红素的浓度大于500mg/L时，发酵液的OD600值和番茄红素降解量明显下降，说明番茄红素的浓度太高会对微生物具有毒害作用，反而影响其生长和番茄红素降解效果，当番茄红素在发酵培养基中的浓度为300～500mg/L时，番茄红素降解量基本不变，蜡状芽孢杆菌在100mL发酵液中可降解的番茄红素终浓度为224.4mg/L，故在100mL发酵液中加入的番茄红素溶液的量以番茄红素终浓度300mg/L为宜。

[0049] 本发明利用蜡状芽孢杆菌降解番茄红素，每隔12小时取样并测量培养基中的菌体浓度以及剩余番茄红素的浓度，降解效果如图4、5所示，蜡状芽孢杆菌在35℃、pH为7.0、150r/min、接种量1.0％、番茄红素终浓度300mg/L的条件下降解番茄红素的细胞生物量在
72h时OD600达到最高值3.972，并在随后一段时间基本维持不变；番茄红素含量随着时间变化而减小，番茄红素的降解率随着时间变化而增大，在72h时番茄红素的降解率达到
74.8％，随后一段时间基本维持不变。

[0050] 实施例2

[0051] 对本发明蜡状芽孢杆菌发酵降解番茄红素的降解产物进行测定，具体方法为：

[0052] 发酵液在避光条件下，高速离心(4℃，6500r/min，30min)，将分离出的上清液取出来，加入等体积二氯甲烷反复萃取3次，得到番茄红素发酵提取物，加入无水Na2SO4干燥过夜，真空浓缩至1mL，进行GC-MS定性分析。

[0053] 气相条件：色谱柱：HP-5(30m×0.25mm；0.25μm)；升温程序：初始温度45℃，保持5min，以4℃/min升到110℃，保留5min，以1℃/min升到150℃，保留5min，以3℃/min升到200℃，以5℃/min升到280℃，保留5min；进样口温度：270℃；传输线温度：270℃；分流比：1:1；
载气：He气；流速：1mL/min。

[0054] 质谱条件：电离方式EI，电离电压70eV；离子源温度230℃；质量扫描范围：30-550amu。

[0055] 结果见图6-8。图6为GC-MS分析的总离子流图，从图6中可以看出，番茄红素经蜡状芽孢杆菌降解后的主要降解产物有两种。图7-8为图6中检测到的主要降解产物的质谱图，结果表明，降解产物I为6-甲基-5-庚烯-2-酮，降解产物II为异辛二烯酮。根据上述GC-MS分析检测结果，降解番茄红素的过程主要分为两步，第一步，番茄红素在双加氧酶的作用下，通过5-6位或5’-6’位断键，进而形成6-甲基-5-庚烯-2-酮。第二步，刚形成的6-甲基-5-庚烯-2-酮在脱氢酶的作用下，发生脱氢反应生成异辛二烯酮。