基于手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的方法

摘要

本发明提供一种基于手性高效液相色谱‑质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的方法，具体步骤包括：1)样品的准备；2)确定手性色谱分离条件；3)确定质谱条件；4)光学异构体含量测定。本发明选择手性高效液相色谱‑质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量。本发明具有操作简单，定量准确、批量成本低，特别适用于临床药物检测/监测的需要，为体内/外布新洛尔光学异构体的检测提供了一条新的思路和方法。

权利要求

1.一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)样品的准备：将生物样品或生物样品的匀浆液与乙腈混合以沉淀蛋白，通过离心分离上清液，将上清液吹干，得到待分析样品，或将非生物样品用乙腈溶解并定容后，得到待分析样品；

2)确定手性色谱分离条件：根据(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的分离度大于等于1.5的要求确定手性高效液相色谱分离条件；

3)确定质谱条件：基于多反应监测扫描模式确定质谱/质谱的工作条件；

所述质谱/质谱的工作条件包括：采用三重四级杆质谱；母离子和子离子为364.4和

246.2；锥孔电压为40-55V；碰撞能量为23-34eV；驻留时间为0.15-0.17s；ESI离子源温度为

120-150℃；干燥气的温度为350-450℃，干燥气的流速为600-900L/h；毛细管电压为2.5-

3.5KV；

4)光学异构体含量测定：对待分析样品进行手性高效液相色谱-质谱/质谱分析，根据分析结果计算待分析样品中的(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的含量；

所述手性高效液相色谱采用反相涂敷型或键合型手性色谱柱，手性填料包括多糖衍生物类填料；

所述手性高效液相色谱的分离条件为：流动相为甲醇或乙腈与水、易挥发性缓冲盐以及易挥发性酸的混合溶液，混合溶液中所述缓冲盐的浓度为1-10mM，所述酸的质量分数为

0.1-0.5％，甲醇或乙腈与水的体积比为1～9:1；柱温为10-40℃；进样量为1-10μL；流动相流速为0.1-1mL/min，等度洗脱。

2.根据权利要求1所述一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的方法，其特征在于：所述生物样品选自血浆、组织液、淋巴液、脑脊液、尿液、汗液或生物组织。

3.根据权利要求1所述一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的方法，其特征在于：所述步骤1)中，沉淀蛋白所用乙腈的体积为生物样品或所述匀浆液体积的至少4倍。

4.根据权利要求1所述一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的方法，其特征在于：所述非生物样品包括布新洛尔的制剂。

5.根据权利要求1所述一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的方法，其特征在于：所述缓冲盐包括甲酸铵、乙酸铵、碳酸铵或碳酸氢铵，所述酸包括甲酸、乙酸或三氟乙酸。

6.根据权利要求1所述一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的方法，其特征在于：所述定量检测的方法为外标法，标准曲线的范围为

0.5-200ng/mL。

说明书

基于手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光

学异构体含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱技术检测和监测生物样品中(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔光学异构体含量的方法，属于药物分析领域。

背景技术

[0002] 布新洛尔(Bucindolol，CAS:71119-11-4)，又名布辛都罗，化学名称为2-[2-羟基-3-[2-(吲哚-3-基)-1,1-二甲基乙基胺]丙氧基]腈苯。布新洛尔有一个手性中心，两个光学异构体，即(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔，是一种非选择性的具有高度亲和力且无内源性拟交感作用的β-受体阻滞剂，可作为吲哚类抗高血压药物使用，主要作用于植物神经系统。
布新洛尔对映体构型如下：

[0003]

[0004] 布新洛尔具有β-受体阻滞作用，又有血管扩张作用，是一种非选择性β-受体阻滞药物，通过抑制肾上腺素和去甲肾上腺素的影响，从而导致心率和血压下降，其抗压效果比肼苯哒嗪高2.5倍，比拉贝洛尔高18倍，为氯苯甲噻二嗪的38倍。此外，布新洛尔通过结合肾小球旁β2受体，抑制肾素的生产，从而抑制血管紧张素II和醛固酮的产生，因此可以抑制血管收缩和水保性。

[0005] 最新的研究表明，布新洛尔通过损害AV节点传导和减少窦率也可以增加血浆甘油三酯和降低高密度脂蛋白胆固醇水平，非常有望开发成为一类降脂药物。但是，有可能导致的心房纤维性颤动和血栓栓塞性中风的副作用限制了其进一步的应用。而该类副反应，非常可能是由于不同的对映异构体所引起的。同时，根据新药申报及临床药物管理的规定，不同的光学异构体应按照不同的化学实体对待。此外，在生物体内，布新洛尔光学异构体之间可能存在手性转化。因此，同时建立(R)和(S)-布新洛尔体内/外药物浓度的分析方法是非常必要的。

[0006] 反相手性高效液相色谱-质谱/质谱技术结合了手性色谱柱对光学异构体的分离能力和质谱/质谱技术的高灵敏度，可以较好的解决手性药物的光学异构体的体内/外检测问题。然而，针对不同的分离对象，需要对进样量、柱温、洗脱剂、流速、等大量条件和母离子/子离子选择、碰撞能量、锥孔电压等参数进行优化和筛选，既要保证光学异构体的分离还要达到微量或痕量药物的检测要求，难度极大，因此，目前为止还未见到有关基于反相手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的研究和专利文献报道。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的方法，特别适合临床药物检测/监测的应用。

[0008] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

[0009] 1)样品的准备：将生物样品或生物样品的匀浆液与乙腈混合以沉淀蛋白，通过离心分离上清液，将上清液吹干，得到待分析样品，或将非生物样品用乙腈溶解并定容后，得到待分析样品；

[0010] 2)确定手性色谱分离条件：根据(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的分离度大于等于1.5的要求确定手性高效液相色谱分离条件；

[0011] 3)确定质谱条件：基于多反应监测扫描模式(MRM)确定质谱/质谱的工作条件；

[0012] 4)光学异构体含量测定：对待分析样品进行手性高效液相色谱-质谱/质谱分析，根据分析结果计算待分析样品中的(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的含量。

[0013] 所述生物样品选自血浆、组织液、淋巴液、脑脊液、尿液、汗液或生物组织，如肝脏、肾脏、心脏、胰脏、大脑等。

[0014] 所述步骤1)中，沉淀蛋白所用乙腈的体积为生物样品或所述匀浆液体积的至少4倍。

[0015] 所述非生物样品包括布新洛尔的制剂，如片剂、散剂、胶囊剂等。

[0016] 所述手性高效液相色谱采用反相涂敷型或键合型手性色谱柱，手性填料包括多糖衍生物类填料。

[0017] 所述手性高效液相色谱的分离条件为：流动相为甲醇或乙腈与水、易挥发性缓冲盐以及易挥发性酸的混合溶液，混合溶液中所述缓冲盐的浓度为1-10mM，所述酸的质量分数为0.1-0.5％，甲醇或乙腈与水的体积比为1～9:1；柱温为10-40℃；进样量为1-10μL；流动相流速为0.1-1mL/min，等度洗脱。

[0018] 所述缓冲盐包括甲酸铵、乙酸铵、碳酸铵或碳酸氢铵，所述酸包括甲酸、乙酸或三氟乙酸。

[0019] 所述质谱/质谱的工作条件包括：采用三重四级杆质谱；母离子和子离子为364.4和246.2；锥孔电压为40-55V；碰撞能量为23-34eV。

[0020] 所述质谱/质谱的工作条件还包括：驻留时间为0.15-0.17s；ESI离子源温度为120-150℃；干燥气的温度为350-450℃，干燥气的流速为600-900L/h；毛细管电压为2.5-
3.5KV

[0021] 所述定量检测的方法为外标法(即配制(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的标准溶液，制作标准曲线，据此计算待分析样品中的(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的含量)，标准曲线的范围为0.5-200ng/mL。

[0022] 本发明的有益效果体现在：

[0023] 1)光学异构体的分析灵敏度高、检出限低。对于类似的具有手性醇羟基的光学异构体的分析，现有方法是利用手性HPLC实现的，但是限于方法本身的限制，灵敏度较差，其最低检出限为μg/mL，无法实现微量和痕量样品的分析；本发明中采用三重四级杆中的MRM扫描模式，在保证光学异构体分离的同时，极大的提高了灵敏度(ng/mL)。首次实现了布新洛尔的临床检测/监测需要。

[0024] 2)可同时实现(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的检测。对于生物样品中药物浓度的检测，现有方法是采用HPLC或UPLC-MS/MS的方法，但是该方法无法对布新洛尔的光学异构体进行分离测定，只能得到一个总的布新洛尔的浓度，不能更准确的反映光学异构体之间的转化；本发明巧妙的利用反相手性色谱解决了这一技术难题，首次实现了体内布新洛尔对映异构体的定量分析。为布新洛尔光学异构体的体内检测提供了技术支持，为研究手性药物的体内转化提供了新的思路。

[0025] 3)可实现自动化的检测，符合临床大样本量监测的需要：本发明利用HPLC的自动进样功能、可实现无人值守；极大的节省了人力物力，满足多样品，大数据处理的需要。

[0026] 进一步的，本发明优化了质谱/质谱(MS/MS)条件，包括母/子离子选择，碰撞能量，锥孔电压等以提高灵敏度，扩大定量检测范围，最低检出限为0.5ng/mL。

附图说明

[0027] 图1为实施例4中布新洛尔片的对映异构体检测谱图((R)：8.42min，(S)：11.98min)。

具体实施方式

[0028] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

[0029] 实施例1血浆中外消旋布新洛尔的浓度检测

[0030] 基于手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的方法，以外消旋布新洛尔为例，但本发明的保护范围不局限于该实验，具体步骤如下：1)样品的准备；2)确定手性色谱分离条件；3)确定质谱条件；4)光学异构体含量测定。

[0031] 一、样品准备

[0032] ①采集生物样品：取已注射外消旋布新洛尔的SD大鼠血浆100μL(采血时间点1.5h)；

[0033] ②向上述生物样品中加入400μL乙腈，旋混30s后，12500转/分离心10min，取上清液室温下氮气吹干，得待分析样品，-80℃冻存；

[0034] 二、确定手性色谱分离条件

[0035] 上述待分析样品加入200μL的流动相中复溶，采用Waters TQD Xevo分析(R)和(S)-布新洛尔，条件如下：

[0036] 色谱柱：大赛璐 OJ-3R色谱柱(150mm*2.1mm*3μm)。

[0037] 色谱条件：

[0038] ①自动进样，体积5μL；

[0039] ②流动相是乙腈:水＝90:10(体积比)的混合液(含质量分数0.1％的甲酸和10mM的甲酸铵)，流速为0.3mL/min，等度洗脱；

[0040] ③柱温箱温度为25℃；

[0041] 该条件下(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的保留时间分别为：16.51和18.02min，分离度为2.1。

[0042] 三、确定质谱条件

[0043] 采用Waters TQD的多反应监测扫描模式(MRM)，条件如下：

[0044] 母离子和子离子分别为364.4和246.2；

[0045] 锥孔电压为48V；

[0046] 碰撞能量为28eV；

[0047] 驻留时间为0.161s；

[0048] ESI离子源温度为150℃；

[0049] N2(干燥气)的温度及流速为450℃和900L/h；

[0050] 毛细管电压为3.5KV。

[0051] 该条件下100ng/mL的(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的S/N分别为1952:1和1766:1。

[0052] 四、光学异构体含量测定

[0053] 数据采集和处理采用Mass Lynx software(Version 4.1)，定量计算采用Target LynxTM software。

[0054] 配制外消旋布新洛尔的标准溶液(溶剂为体积分数20％的乙腈水溶液)，浓度分别为：0.5ng/mL，1ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，80ng/mL，150ng/mL，200ng/mL；上述标准溶液样品与待分析样品采用本实施例中的色谱和质谱条件分析，Target LynxTM software自动计算待分析样品中(R)-和(S)-布新洛尔的含量。根据该含量换算得出血药浓度。

[0055] 该实施例中，(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的保留时间分别为：16.51和18.02min；其血药浓度分别为98.5ng/mL和54.9ng/mL；表明(R)和(S)-布新洛尔间存在吸收、分布和代谢的差异。

[0056] 实施例2尿液中(R)-布新洛尔的浓度检测

[0057] 除以下条件外，其他条件与实施例1相同：

[0058] ①采集生物样品：取已注射(R)-布新洛尔的SD大鼠尿液100μL(24h的总尿液)；

[0059] ②色谱柱：大赛璐 IC色谱柱(150mm*4.6mm*5μm)；

[0060] ③流动相是甲醇:水＝90:10(体积比)的混合液(含质量分数0.5％的乙酸和1mM的乙酸铵)，流速为1mL/min，等度洗脱；

[0061] ④自动进样，体积10μL；

[0062] ⑤柱温箱温度为40℃；

[0063] ⑥锥孔电压为40V；

[0064] ⑦碰撞能量为23eV；

[0065] ⑧驻留时间为0.15s；

[0066] ⑨ESI离子源温度为125℃；

[0067] ⑩N2(干燥气)的温度及流速为350℃和700L/h；毛细管电压为2.5KV。

[0068] 该实施例中，(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的保留时间分别为：5.43和5.98min；其尿药浓度分别为18.8ng/mL和2.6ng/mL；表明(R)-布新洛尔在体内能够部分转化为(S)-布新洛尔，存在体内手性转化现象。

[0069] 实施例3肝脏中(S)-布新洛尔的浓度检测

[0070] 除以下条件外，其他条件与实施例1相同：

[0071] ①采集生物样品：取已注射(S)-布新洛尔的SD大鼠肝脏0.1g(给药后12小时断颈处死，迅速解剖取出肝脏)；

[0072] ②制备匀浆液：向生物样品中加入缓冲溶液0.5mL，4℃匀浆，离心后取上清液100μL；

[0073] 向上述匀浆液中加入400μL乙腈，旋混30s后，12500转/分离心10min，取上清液室温下氮气吹干，得待分析样品；

[0074] ③色谱柱：大赛璐 IA色谱柱(150mm*4.6mm*5μm)；

[0075] ④流动相是乙腈:水＝70:30(体积比)的混合液(含质量分数0.5％的三氟乙酸和5mM的碳酸氢铵)，流速为0.5mL/min，等度洗脱；

[0076] ⑤柱温箱温度为10℃；

[0077] ⑥锥孔电压为55V；

[0078] ⑦碰撞能量为34eV；

[0079] ⑧驻留时间为0.17s；

[0080] ⑨ESI离子源温度为135℃；

[0081] ⑩N2(干燥气)的温度及流速为400℃和800L/h；毛细管电压为3KV。

[0082] 该实施例中，(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的保留时间分别为：8.82和9.57min；其肝脏药物浓度分别为2.3ng/mL和47.8ng/mL；表明(S)-布新洛尔在肝脏中能够部分转化为(R)-布新洛尔，存在体内手性转化现象。

[0083] 实施例4布新洛尔口服片的光学异构体含量检测

[0084] 除以下条件外，其他条件与实施例1相同：

[0085] ①取非生物样品布新洛尔片(购于上海柘智生物科技有限公司，10mg/片)一片，溶解于1mL乙腈(超声助溶)，离心后取上清液100μL；即非生物样品可直接用乙腈溶解、定容后进行分析；

[0086] ②色谱柱：大赛璐 IB色谱柱(150mm*4.6mm*5μm)；

[0087] ③流动相是乙腈:水＝50:50(体积比)的混合液(含质量分数0.1％的三氟乙酸和5mM的碳酸氢铵)，流速为0.5mL/min，等度洗脱；

[0088] ④自动进样，体积1μL；

[0089] ⑤柱温箱温度为40℃；

[0090] ⑥锥孔电压为50V。

[0091] 该实施例中，(R)-布新洛尔和(S)-布新洛尔的保留时间分别为：8.42和11.98min，参见图1。

[0092] 本发明所针对的是布新洛尔的光学纯异构体的检测，不同来源的样品(包括生物样品)，受样品中其他内源性物质的干扰，其色谱分离条件、质谱检测参数等均存在不同，据此得出本发明中的条件范围。

[0093] 本发明选择反相手性高效液相色谱-质谱/质谱技术定量检测布新洛尔光学异构体含量的方法，解决了在实际生产科研、临床中布新洛尔光学异构体的检测/监测所存在的问题，诸如，灵敏度较低以及无法同时检测各光学异构体等。本发明为体内/外布新洛尔光学异构体的检测/监测提供了一条新的思路和方法，可应用于针对光学纯布新洛尔在体内/外发生消旋化或部分消旋化而可能引起的药物不良反应问题的科学以及临床研究中，特别适用于临床药物检测/监测的需要，同时，为同类手性药物的转化研究提供技术支持和实验参考。