一种甘肃道地药材铁棒锤的炮制工艺及其质量检测方法

摘要

本发明属于中药炮制领域，涉及一种甘肃道地药材铁棒锤的炮制工艺及其质量检测方法。本发明提供了一种铁棒锤炮制品，该铁棒锤炮制品是采用如下方法制备：取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润12～36 h，焖润后晾干，加8～12倍量的中砂，在255～265℃下，炒制5～8 min，冷却，即得铁棒锤炮制品。本发明还提供采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品中3种成分含量的方法，可以有效控制铁棒锤炮制品的质量。

权利要求

1.一种铁棒锤炮制品，其特征在于，该铁棒锤炮制品是采用如下方法制备：取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润12～36 h，焖润后晾干，加8～12倍量的中砂，在

255～265℃下，炒制5～8 min，冷却，即得。

2.根据权利要求1所述的铁棒锤炮制品，其特征在于，该铁棒锤炮制品是采用如下方法制备：取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得。

3.一种铁棒锤炮制品的检测方法，该铁棒锤炮制品是采用如下方法制备的：取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润12～36 h，焖润后晾干，加8～12倍量的中砂，在255～265℃下，炒制5～8 min，冷却，即得铁棒锤炮制品；其特征在于，采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量，测定步骤为：（1）色谱条件：Syncronis C色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动性进行梯度洗脱，洗脱顺序：0～15min，甲醇保持在15%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液保持在

85%；16～20min，甲醇从15%线性上升为20%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从85%线性下降至

80%；21～30min，甲醇从20%线性上升为40%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从80%线性下降至

60%；0～20min时，检测波长235nm，检测新乌宁碱、3-乙酰乌头碱；21～30min时，检测波长

365nm，检测12-表乙酰去氢乌头碱，柱温30～40℃，流速0.5～1.5mL·min-1，进样量5～20μL；

（2）混合对照品溶液的制备：取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成含新乌宁碱，3-乙酰乌头碱，12-表乙酰去氢乌头碱的混合对照品溶液，即得；

（3）供试品溶液的制备：精密称定所述铁棒锤炮制品粉末，置具塞锥形瓶中，精密加入

65～75%甲醇，密塞，称定质量，加热回流，放冷，再称定质量，用65～75%甲醇补足减失的质量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

（4）测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，测定。

4.如权利要求3所述的铁棒锤炮制品的检测方法，该铁棒锤炮制品是采用如下方法制备的：取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；其特征在于，采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量，测定步骤为：（1）色谱条件：Syncronis C色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动性进行梯度洗脱，洗脱顺序：0～15min，甲醇保持在15%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液保持在

85%；16～20min，甲醇从15%线性上升为20%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从85%线性下降至

80%；21～30min，甲醇从20%线性上升为40%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从80%线性下降至

60%；0～20min时，检测波长235nm，检测新乌宁碱、3-乙酰乌头碱；21～30min时，检测波长

365nm，检测12-表乙酰去氢乌头碱，柱温36℃，流速1.0mL·min-1，进样量20μL；

（2）混合对照品溶液的制备：取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成每1mL含新乌宁碱0.750mg，3-乙酰乌头碱0.800mg，

12-表乙酰去氢乌头碱0.220mg的混合对照品溶液，即得；

（3）供试品溶液的制备：精密称定所述铁棒锤炮制品粉末0.8g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定质量，加热回流1h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

（4）测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定。

5.一种铁棒锤炮制品橡胶膏剂，其特征在于，该铁棒锤炮制品橡胶膏剂是采用如下方法制备：（1）取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润12～36 h，焖润后晾干，加8～12倍量的中砂，在255～265℃下，炒制5～8 min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

（2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

（3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成小块，即得。

6.如权利要求5所述的铁棒锤炮制品橡胶膏剂，其特征在于，该铁棒锤炮制品橡胶膏剂是采用如下方法制备：（1）取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

（2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

（3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶、松香、羊毛脂、凡士林、液体石蜡、氧化锌、汽油，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成小块，即得。

7.一种铁棒锤炮制品橡胶膏剂在制备治疗哮喘药物中的应用，其特征在于，该铁棒锤炮制品橡胶膏剂是采用如下方法制备：（1）取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

（2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

（3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶、松香、羊毛脂、凡士林、液体石蜡、氧化锌、汽油，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成小块，即得；

采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品橡胶膏剂中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量，测定步骤为：（1）色谱条件：Syncronis C色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动性进行梯度洗脱，洗脱顺序：0～15min，甲醇保持在15%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液保持在

85%；16～20min，甲醇从15%线性上升为20%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从85%线性下降至

80%；21～30min，甲醇从20%线性上升为40%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从80%线性下降至

60%；0～20min时，检测波长235nm，检测新乌宁碱、3-乙酰乌头碱；21～30min时，检测波长

365nm，检测12-表乙酰去氢乌头碱，柱温36℃，流速1.0mL·min-1，进样量20μL；

（2）混合对照品溶液的制备：取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成每1mL含新乌宁碱0.750mg，3-乙酰乌头碱0.800mg，

12-表乙酰去氢乌头碱0.220mg的混合对照品溶液，即得；

（3）供试品溶液的制备：取所述铁棒锤炮制品橡胶膏剂1片，精密称定，剪成1cm×1cm的碎片，置50mL圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定质量，加热回流1h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

（4）测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定。

8.一种铁棒锤炮制品橡胶膏剂在制备治疗关节炎物中的应用，其特征在于，该铁棒锤炮制品橡胶膏剂是采用如下方法制备：（1）取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

（2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

（3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶、松香、羊毛脂、凡士林、液体石蜡、氧化锌、汽油，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成小块，即得；

采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品橡胶膏剂中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量，测定步骤为：（1）色谱条件：Syncronis C色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动性进行梯度洗脱，洗脱顺序：0～15min，甲醇保持在15%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液保持在

85%；16～20min，甲醇从15%线性上升为20%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从85%线性下降至

80%；21～30min，甲醇从20%线性上升为40%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从80%线性下降至

60%；0～20min时，检测波长235nm，检测新乌宁碱、3-乙酰乌头碱；21～30min时，检测波长

365nm，检测12-表乙酰去氢乌头碱，柱温36℃，流速1.0mL·min-1，进样量20μL；

（2）混合对照品溶液的制备：取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成每1mL含新乌宁碱0.750mg，3-乙酰乌头碱0.800mg，

12-表乙酰去氢乌头碱0.220mg的混合对照品溶液，即得；

（3）供试品溶液的制备：取所述铁棒锤炮制品橡胶膏剂1片，精密称定，剪成1cm×1cm的碎片，置50mL圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定质量，加热回流1h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

（4）测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定。

说明书

一种甘肃道地药材铁棒锤的炮制工艺及其质量检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药炮制领域，涉及一种甘肃道地药材铁棒锤的炮制工艺及其质量检测方法。

背景技术

[0002] 铁棒锤是为毛茛科乌头属植物铁棒锤Aconitum pendulum Busch [A.szecheny -ianum Gay.]和伏毛铁棒锤A.flavum Hand.-Mazz.[A.anthora L.var.gilvum Maxim.]的块根。铁棒锤为甘肃省道地药材，药性：苦、辛，温。有大毒。具有活血祛瘀，祛风除湿，消肿止痛之功效。主治跌打损伤。骨折淤肿疼痛，风湿腰痛，痈肿恶疮，无名肿毒，瘰疬未溃者，毒蛇咬伤，冻疮。

[0003] 目前，铁棒锤的炮制方式多采用砂烫法，铁棒锤主要药效成分为生物碱类，其中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱为主要生物碱，现有研究表明，新乌宁碱毒性较大，3-乙酰乌头碱和12-表乙酰去氢乌头碱毒性较小，并且有较强的生物活性，研究表明，加热炮制可降低新乌宁碱的含量，但随着加热炮制，其生物活性成分3-乙酰乌头碱和12-表乙酰去氢乌头碱也在降低，这是业界的一个难题。此外，现有对铁棒锤炮制过程进行研究，描述了炮制参数，但经验性太强，炮制过程难以把握，生产参数也不明确，并且许多报道中对温度的测量及过程控制多传承经验操作，不具有可控性。

[0004] 基于此，本发明的发明人作为甘肃省铁棒锤药材研究的重要单位甘肃中医药大学的科研人员，对铁棒锤已经进行了多年的研究，发明人经过反复的实验研究，确定了铁棒锤的炮制工艺，为其生产和质量控制提供准确的实验依据。

[0005] 并且，在对铁棒锤多年的持续研究中意外发现，铁棒锤对哮喘具有一定的治疗效果，但是科研人员研究发现，只有采用特定的炮制方法对铁棒锤进行炮制后，对哮喘有一定的治疗效果，生铁棒锤、炒铁棒锤等其他铁棒锤炮制品基本无效，发明人对此课题进行了多年的研究，发明了一种铁棒锤的炮制品药物制剂，该药物对哮喘具有非常好的治疗效果，在进行一系列科学、规范的实验研究后，得到了本发明的技术方案。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种铁棒锤炮制品。

[0007] 本发明的另一目的是提供该铁棒锤炮制品的制备方法。

[0008] 本发明的还提供该铁棒锤炮制品的质量检测方法。

[0009] 本发明的还提供该铁棒锤炮制品橡胶膏剂的制备方法

[0010] 本发明的还提供该铁棒锤炮制品橡胶膏剂在制备治疗哮喘药物中的应用。

[0011] 本发明的目的是通过以下方式实现的：

[0012] 一种铁棒锤炮制品，该铁棒锤炮制品是采用如下方法制备：取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润12～36 h，焖润后晾干，加8～12倍量的中砂，在255～265℃下，炒制5～8 min，冷却，即得铁棒锤炮制品。

[0013] 所述的铁棒锤炮制品，优选为，采用如下方法制备：取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品。

[0014] 一种铁棒锤炮制品的检测方法，该铁棒锤炮制品是采用如下方法制备的：取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润12～36 h，焖润后晾干，加8～12倍量的中砂，在255～265℃下，炒制5～8 min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0015] 采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量，测定步骤为：

[0016] （1）色谱条件：Syncronis C色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动性进行梯度洗脱，洗脱顺序：0～15min，甲醇保持在15%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液保持在85%；16～20min，甲醇从15%线性上升为20%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从85%线性下降至80%；21～30min，甲醇从20%线性上升为40%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从80%线性下降至60%；0～20min时，检测波长235nm，检测新乌宁碱、3-乙酰乌头碱；21～30min时，检测波长365nm，检测12-表乙酰去氢乌头碱，柱温30～40℃，流速0.5～1.5mL·min-1，进样量5～20μL；

[0017] （2）混合对照品溶液的制备：取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成含新乌宁碱，3-乙酰乌头碱，12-表乙酰去氢乌头碱的混合对照品溶液，即得；

[0018] （3）供试品溶液的制备：精密称定铁棒锤炮制品粉末，置具塞锥形瓶中，精密加入65～75%甲醇，密塞，称定质量，加热回流，放冷，再称定质量，用65～75%甲醇补足减失的质量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

[0019] （4）测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，测定。

[0020] 所述的铁棒锤炮制品的检测方法，优选为，该铁棒锤炮制品是采用如下方法制备的：取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0021] 优选为，采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量，测定步骤为：

[0022] （1）色谱条件：Syncronis C色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动性进行梯度洗脱，洗脱顺序：0～15min，甲醇保持在15%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液保持在85%；16～20min，甲醇从15%线性上升为20%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从85%线性下降至80%；21～30min，甲醇从20%线性上升为40%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从80%线性下降至60%；0～20min时，检测波长235nm，检测新乌宁碱、3-乙酰乌头碱；21～30min时，检测波长365nm，检测12-表乙酰去氢乌头碱，柱温36℃，流速1.0mL·min-1，进样量20μL；

[0023] （2）混合对照品溶液的制备：取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成每1mL含新乌宁碱0.750mg，3-乙酰乌头碱0.800mg，12-表乙酰去氢乌头碱0.220mg的混合对照品溶液，即得；

[0024] （3）供试品溶液的制备：精密称定本发明铁棒锤炮制品粉末0.8g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定质量，加热回流1h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

[0025] （4）测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定。

[0026] 一种铁棒锤炮制品橡胶膏剂，该铁棒锤炮制品橡胶膏剂是采用如下方法制备：

[0027] （1）取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润12～36 h，焖润后晾干，加8～12倍量的中砂，在255～265℃下，炒制5～8 min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0028] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0029] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成小块，即得。

[0030] 所述的铁棒锤炮制品橡胶膏剂，优选为，该铁棒锤炮制品橡胶膏剂是采用如下方法制备：

[0031] （1）取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0032] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0033] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶、松香、羊毛脂、凡士林、液体石蜡、氧化锌、汽油，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成小块，即得。

[0034] 一种铁棒锤炮制品橡胶膏剂在制备治疗哮喘药物中的应用，该铁棒锤炮制品橡胶膏剂是采用如下方法制备：

[0035] （1）取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0036] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0037] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶、松香、羊毛脂、凡士林、液体石蜡、氧化锌、汽油，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成小块，即得；

[0038] 采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品橡胶膏剂中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量，测定步骤为：

[0039] （1）色谱条件：Syncronis C色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动性进行梯度洗脱，洗脱顺序：0～15min，甲醇保持在15%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液保持在85%；16～20min，甲醇从15%线性上升为20%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从85%线性下降至80%；21～30min，甲醇从20%线性上升为40%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从80%线性下降至60%；0～20min时，检测波长235nm，检测新乌宁碱、3-乙酰乌头碱；21～30min时，检测波长-1365nm，检测12-表乙酰去氢乌头碱，柱温36℃，流速1.0mL·min ，进样量20μL；

[0040] （2）混合对照品溶液的制备：取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成每1mL含新乌宁碱0.750mg，3-乙酰乌头碱0.800mg，12-表乙酰去氢乌头碱0.220mg的混合对照品溶液，即得；

[0041] （3）供试品溶液的制备：取铁棒锤炮制品橡胶膏剂1片，精密称定，剪成1cm×1cm的碎片，置50mL圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定质量，加热回流1h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

[0042] （4）测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定。

[0043] 一种铁棒锤炮制品橡胶膏剂在制备治疗关节炎物中的应用，该铁棒锤炮制品橡胶膏剂是采用如下方法制备：

[0044] （1）取铁棒锤药材，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0045] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0046] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶、松香、羊毛脂、凡士林、液体石蜡、氧化锌、汽油，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成小块，即得；

[0047] 采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品橡胶膏剂中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量，测定步骤为：

[0048] （1）色谱条件：Syncronis C色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动性进行梯度洗脱，洗脱顺序：0～15min，甲醇保持在15%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液保持在85%；16～20min，甲醇从15%线性上升为20%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从85%线性下降至80%；21～30min，甲醇从20%线性上升为40%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从80%线性下降至60%；0～20min时，检测波长235nm，检测新乌宁碱、3-乙酰乌头碱；21～30min时，检测波长365nm，检测12-表乙酰去氢乌头碱，柱温36℃，流速1.0mL·min-1，进样量20μL；

[0049] （2）混合对照品溶液的制备：取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成每1mL含新乌宁碱0.750mg，3-乙酰乌头碱0.800mg，12-表乙酰去氢乌头碱0.220mg的混合对照品溶液，即得；

[0050] （3）供试品溶液的制备：取铁棒锤炮制品橡胶膏剂1片，精密称定，剪成1cm×1cm的碎片，置50mL圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定质量，加热回流1h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

[0051] （4）测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定。

[0052] 通过如下实验研究验证本发明的技术效果：

[0053] 实验一：铁棒锤炮制品橡胶膏剂对关节炎治疗作用的实验研究

[0054] 1 材料与方法

[0055] 1.1 实验动物

[0056] SD大鼠60只，雄性，体重（100±20）g，甘肃中医药大学医学实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001011；实验设施合格证号：SYXK（甘）2011-0001-0000314，饲养于甘肃中医药大学医学实验中心。

[0057] 1.2 实验药物

[0058] 1.2.1 铁棒锤炮制品橡胶膏剂A

[0059] 处方：铁棒锤药材1000g

[0060] 制备方法：（1）取铁棒锤药材1000g，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0061] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0062] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶10kg、松香10kg、羊毛脂3kg、凡士林1.0kg、液体石蜡0.5kg、氧化锌10kg、汽油30kg，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成5cm×7cm的小块1000块，即得。

[0063] 1.2.2 铁棒锤炮制品橡胶膏剂B

[0064] 处方：铁棒锤药材1000g

[0065] 制备方法：（1）取铁棒锤药材1000g，切成片状，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0066] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0067] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶10kg、松香10kg、羊毛脂3kg、凡士林1.0kg、液体石蜡0.5kg、氧化锌10kg、汽油30kg，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成5cm×7cm的小块1000块，即得。

[0068] 1.2.3 铁棒锤炮制品橡胶膏剂C

[0069] 处方：铁棒锤药材1000g

[0070] 制备方法：（1）取铁棒锤药材1000g，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在220℃下，炒制3min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0071] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0072] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶10kg、松香10kg、羊毛脂3kg、凡士林1.0kg、液体石蜡0.5kg、氧化锌10kg、汽油30kg，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成5cm×7cm的小块1000块，即得。

[0073] 1.2.4 铁棒锤炮制品橡胶膏剂D

[0074] 处方：铁棒锤药材1000g

[0075] 制备方法：（1）取铁棒锤药材1000g，切成片状，用黄酒焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在300℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0076] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0077] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶10kg、松香10kg、羊毛脂3kg、凡士林1.0kg、液体石蜡0.5kg、氧化锌10kg、汽油30kg，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成5cm×7cm的小块1000块，即得。

[0078] 1.3 造模

[0079] 取适量的牛Ⅱ型胶原（北京博蕾德生物科技有限公司）溶于0.01mol/L的乙酸溶液中（1ml乙酸溶液中溶解2mg胶原），在4℃下过夜充分溶解后加入等量福氏不完全佐剂，在冰浴下充分乳化制成乳剂。在腹腔麻醉下大鼠背部皮内多点注射胶原乳剂1.5ml/100g。

[0080] 1.4 分组与治疗

[0081] 造模结束后即随机将大鼠分为5组，每组12只，分别为：铁棒锤炮制品橡胶膏剂A组、铁棒锤炮制品橡胶膏剂B组、铁棒锤炮制品橡胶膏剂C组、铁棒锤炮制品橡胶膏剂D组、空白基质对照组。

[0082] 敷贴组参照“大鼠穴位图谱”取身柱、至阳及命门穴，每穴敷贴1cm×1cm大小的药物橡胶膏剂贴片；空白基质对照组的贴片除不含药物外，其余成分与实验药物橡胶膏剂组相同，取穴及贴片面积同敷贴组。各组大鼠均从造模后第12天开始治疗，橡胶膏剂贴片，每日1次，每次敷贴12小时，连续治疗12天。

[0083] 1.5 足跖肿胀度测定

[0084] 采用自制的容积测量器，根据大鼠足跖的体积变化观察其足跖肿胀度。各组大鼠分别在造模后第12天（治疗前）、造模后第18天（治疗6天后）及造模后第24天（治疗12天后）测定左、右后足跖的体积，并计算每只大鼠后足跖的平均肿胀度。

[0085] 1.6 关节炎指数测定

[0086] 采用Wood氏关节炎评分标准，根据各大鼠关节红肿程度及累及关节数，记分比较。具体描述如下。

[0087] 0分：正常；1分：红肿涉及1个趾关节；2分：红肿涉及2个及以上趾关节或整个足跖轻度红肿；3分：足跖红肿较严重；4分：足跖重度红肿，缺乏弹性。各大鼠4只足跖中每只足跖都记0～4分，计算总积分。每天观察记录1次。

[0088] 1.7 PGE2浓度的测定

[0089] 各大鼠分别在造模前、造模后第15天及造模后第29天眼眶取血约1.5mL，离心取血清。最后一次取完血后各大鼠脱颈椎处死，在踝关节上1cm处剪下左、右后足跖，剥除皮肤，称重后剪成小块，按1mL/300mg的剂量加入生理盐水，制成匀浆，37℃温浴15分钟后，离心取上清液。按照试剂盒的说明，用放射免疫法分别测定血清及足跖匀浆液中PGE2的浓度。

[0090] 1.8 脾脏指数的测定　各组大鼠在处死后摘取脾脏，称重，计算脾脏指数：脾脏指数=脾脏重量（mg）/体重（g）。

[0091] 1.9 统计学处理　所有数据资料均为计量资料，用均数±标准差（ ±s）表示。使用SPSS10.0统计软件处理，用t检验进行各组间的两两比较，以P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有非常显著性差异。

[0092] 2 结果

[0093] 2.1 对胶原诱导型关节炎大鼠足跖平均肿胀度的影响

[0094] 本实验结果见表1，结果显示，铁棒锤炮制品橡胶膏剂A敷贴对胶原诱导型关节炎大鼠的足跖肿胀的炎症反应具有明显的抑制作用，并且铁棒锤炮制品橡胶膏剂A组的作用效果明显优于铁棒锤炮制品橡胶膏剂B组、C组和D组。

[0095] 表1  各组大鼠不同时期的足跖平均肿胀度比较（ ±s）

[0096]

[0097] 与同期空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；

[0098] 2.2 对胶原诱导型关节炎大鼠关节炎指数的影响

[0099] 本实验结果见表2，结果显示，铁棒锤炮制品橡胶膏剂A敷贴对胶原诱导型关节炎大鼠的关节炎指数具有明显的抑制作用，并且铁棒锤炮制品橡胶膏剂A组的作用效果明显优于铁棒锤炮制品橡胶膏剂B组、C组和D组。

[0100] 表2 各组大鼠不同时期的关节炎指数的比较（ ±s）

[0101]

[0102] 与同期空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；

[0103] 2.3 对胶原诱导型关节炎大鼠足跖炎症组织中PGE2的影响

[0104] 本实验结果见表3，结果显示，铁棒锤炮制品橡胶膏剂A敷贴可显著降低胶原诱导型关节炎大鼠两后足跖炎症组织中的PGE2浓度，提示该疗法可能通过抑制PGE2的产生而有效地控制局部炎症，并且铁棒锤炮制品橡胶膏剂A组的作用效果明显优于铁棒锤炮制品橡胶膏剂B组、C组和D组。

[0105] 表3  各组大鼠不同时期足跖炎症组织中PGE2浓度的比较（ ±s，pg/mL）[0106]

[0107] 与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；

[0108] 2.4 对胶原诱导型关节炎大鼠脾脏指数的影响

[0109] 本实验结果见表4，结果显示，胶原诱导型关节炎动物模型的脾脏有不同程度的肿大。在本实验中，铁棒锤炮制品橡胶膏剂A组大鼠的脾脏指数均明显小于空白基质对照组，表明铁棒锤炮制品橡胶膏剂A可抑制脾脏的肿大，进而提示该疗法对体内亢进的免疫反应具有抑制作用，并且铁棒锤炮制品橡胶膏剂A组的作用效果明显优于铁棒锤炮制品橡胶膏剂B组、C组和D组。

[0110] 表4  各组大鼠治疗后脾脏指数的比较（ ±s）

[0111]

[0112] 与空白组比较**P<0.01

[0113] 3 结论

[0114] 实验研究表明，铁棒锤炮制品橡胶膏剂A对关节炎具有显著的治疗作用，并且铁棒锤炮制品橡胶膏剂A的作用效果明显优于铁棒锤炮制品橡胶膏剂B、C和D。说明只有在本发明提供的特定的炮制方法下制备的铁棒锤炮制品橡胶膏剂对关节炎才具有特别突出的治疗效果。

[0115] 实验三：本发明橡胶膏剂贴敷治疗豚鼠哮喘的实验研究

[0116] 1 材料与方法

[0117] 实验动物：健康豚鼠60只（雌雄各半）体重300±30g。甘肃中医药大学医学实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001011；实验设施合格证号：SYXK（甘）2011-0001-0000314，饲养于甘肃中医药大学医学实验中心。

[0118] 1.1 铁棒锤炮制品橡胶膏剂A

[0119] 处方：铁棒锤药材1000g

[0120] 制备方法：（1）取铁棒锤药材1000g，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0121] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0122] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶10kg、松香10kg、羊毛脂3kg、凡士林1.0kg、液体石蜡0.5kg、氧化锌10kg、汽油30kg，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成5cm×7cm的小块1000块，即得。

[0123] 1.2 铁棒锤炮制品橡胶膏剂B

[0124] 处方：铁棒锤药材1000g

[0125] 制备方法：（1）取铁棒锤药材1000g，切成片状，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0126] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0127] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶10kg、松香10kg、羊毛脂3kg、凡士林1.0kg、液体石蜡0.5kg、氧化锌10kg、汽油30kg，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成5cm×7cm的小块1000块，即得。

[0128] 1.3 铁棒锤炮制品橡胶膏剂C

[0129] 处方：铁棒锤药材1000g

[0130] 制备方法：（1）取铁棒锤药材1000g，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在220℃下，炒制3min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0131] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0132] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶10kg、松香10kg、羊毛脂3kg、凡士林1.0kg、液体石蜡0.5kg、氧化锌10kg、汽油30kg，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成5cm×7cm的小块1000块，即得。

[0133] 1.4 铁棒锤炮制品橡胶膏剂D

[0134] 处方：铁棒锤药材1000g

[0135] 制备方法：（1）取铁棒锤药材1000g，切成片状，用黄酒焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在300℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0136] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0137] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶10kg、松香10kg、羊毛脂3kg、凡士林1.0kg、液体石蜡0.5kg、氧化锌10kg、汽油30kg，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成5cm×7cm的小块1000块，即得。

[0138] 1.5 桂龙咳喘宁胶囊：桂龙药业（安徽）有限公司生产，国药准字Z20053135。

[0139] 1.6 试剂与仪器：

[0140] 卵蛋白干粉制剂（武汉博士德生物工程有限公司生产），IL-4放免试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司生产），IgG放免试剂盒（上海沪宇生物科技有限公司生产），CX5生化分析仪（美国贝克曼公司生产，甘肃省人民医院核放射科提供），CW-20D超声雾化仪（德国百瑞公司制造），FJ-2008全自动C免疫计数仪（世联博研(北京)科技有限公司制造）。

[0141] 2 实验方法动物分组：

[0142] 2.1 分组

[0143] 参照“大鼠穴位图谱”，选用身柱、至阳及命门穴。将84只豚鼠以平衡饲料适应性的喂养6天，依据“数字随机表分组法”分为：铁棒锤炮制品橡胶膏剂A组、铁棒锤炮制品橡胶膏剂B组、铁棒锤炮制品橡胶膏剂C组、铁棒锤炮制品橡胶膏剂D组、空白对照组、模型对照组、桂龙咳喘宁对照组，共7组，每组12只。

[0144] 2.2 造模

[0145] 除空白对照组外，给铁棒锤炮制品橡胶膏剂A组、铁棒锤炮制品橡胶膏剂B组、铁棒锤炮制品橡胶膏剂C组、铁棒锤炮制品橡胶膏剂D组、模型对照组、桂龙咳喘宁对照组，造模。给每只豚鼠的腹腔内注射10%卵蛋白生理盐水1mL进行致敏，6天重复一次。12天后将豚鼠置雾化箱中，以恒压400mmHg雾化吸入1%卵蛋白生理盐水15min。观察至豚鼠出现张口喘息，肚腹鼓张为止，即造模成功。

[0146] 2.3 给药：

[0147] 铁棒锤炮制品橡胶膏剂A组：豚鼠，用2%硫代硫酸钠在其身柱、至阳及命门穴部位进行脱毛，脱毛面积2cm×2cm左右。用75%酒精消毒后，将铁棒锤炮制品橡胶膏剂A敷于脱毛处。18h后将本发明橡胶膏剂取掉。每天1次，共贴敷6天。

[0148] 铁棒锤炮制品橡胶膏剂B组：豚鼠，用2%硫代硫酸钠在其身柱、至阳及命门穴部位进行脱毛，脱毛面积2cm×2cm左右。用75%酒精消毒后，将铁棒锤炮制品橡胶膏剂B敷于脱毛处。18h后将本发明橡胶膏剂取掉。每天1次，共贴敷6天。

[0149] 铁棒锤炮制品橡胶膏剂C组：豚鼠，用2%硫代硫酸钠在其身柱、至阳及命门穴部位进行脱毛，脱毛面积2cm×2cm左右。用75%酒精消毒后，将铁棒锤炮制品橡胶膏剂C敷于脱毛处。18h后将本发明橡胶膏剂取掉。每天1次，共贴敷6天。

[0150] 铁棒锤炮制品橡胶膏剂D组：豚鼠，用2%硫代硫酸钠在其身柱、至阳及命门穴部位进行脱毛，脱毛面积2cm×2cm左右。用75%酒精消毒后，将铁棒锤炮制品橡胶膏剂D敷于脱毛处。18h后将本发明橡胶膏剂取掉。每天1次，共贴敷6天。

[0151] 桂龙咳喘宁对照组：豚鼠，用桂龙咳喘宁胶囊去胶囊，内装药粉以1.0 g/kg/d的用量，用蒸馏水按1：8的比例调成水糊状，进行灌胃治疗。

[0152] 空白组、模型组动物除每天抓取刺激外，不作任何处理。

[0153] 标本采集及检测方法EOS检测：对每组豚鼠，均采用毛细取穴管吸取豚鼠尾尖血液20μL，加入0.38mL伊红-甲醛稀释液中，轻轻摇匀，静置5min，采用常规计数法检测。

[0154] IgG、IL-4检测：对每组豚鼠，用3.5%苯巴比妥钠0.1g/kg腹腔注射麻醉，眼球静脉采血6mL，分装3个试管。各2mL待凝固后分离血清，在-20℃保存，按照试剂盒说明方法和要求操作，采用放免法分低温冰箱检测IgG、IL-4。

[0155] 统计学处理：应用SPSS11.0系统软件进行处理，所有数据用均数±标准差（±s）表示，各组间比较用方差分析。

[0156] 3 实验结果

[0157] 实验结果见表5。可以看出，造模后模型组动物的EOS计数和IL-4的含量显著上升（P<0.05，P<0.01），IgG明显下降（P<0.05），说明造模成功。

[0158] 经过治疗后，铁棒锤炮制品橡胶膏剂A组与模型组比较，EOS显著降低（P<0.01），IgG显著增高（P<0.01），均有非常显著性差异；IL-4有明显下降（P<0.05）。铁棒锤炮制品橡胶膏剂B组、C组、D组与模型组比较，EOS没有显著降低，IgG没有显著增高，IL-4也没有明显下降。

[0159] 表5 各组豚鼠血中EOS和血清总IgG、IL-4的结果比较（ ±s）

[0160]

[0161] 注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；

[0162] 模型组的比较，#P<0.05，##P<0.01。

[0163] 4 结论

[0164] 本实验结果证实，铁棒锤炮制品橡胶膏剂A能明显降低哮喘豚鼠血中EOS计数，并能提高血清IgG的含量，降低IL-4含量，充分说明铁棒锤炮制品橡胶膏剂A能提高机体的免疫功能，有较好的化痰平喘作用，其疗效明显优于铁棒锤炮制品橡胶膏剂B组、C组和D组。说明只有在本发明提供的特定的炮制方法下制备的铁棒锤炮制品橡胶膏剂对哮喘才具有特别突出的治疗效果。

[0165] 实验四：铁棒锤炮制品橡胶膏剂经皮肤给药的安全性研究

[0166] 为了确保铁棒锤炮制品橡胶膏剂临床经皮肤给药的安全性，发明人进行相关实验评价铁棒锤炮制品橡胶膏剂的安全性。

[0167] 1 材料

[0168] 1.1 仪器

[0169] TCS-30电子台秤（厦门懿恒电子称重有限公司）；TP-2101电子天平（厦门懿恒电子称重有限公司）。

[0170] 1.2 药物与试剂

[0171] 铁棒锤炮制品橡胶膏剂：

[0172] 处方：铁棒锤药材1000g

[0173] 制备方法：（1）取铁棒锤药材1000g，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0174] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0175] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶10kg、松香10kg、羊毛脂3kg、凡士林1.0kg、液体石蜡0.5kg、氧化锌10kg、汽油30kg，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成5cm×7cm的小块1000块，即得。

[0176] 1.3 动物

[0177] 普通级新西兰家兔，♀♂各半，体质量2.0～2.5kg，甘肃中医药大学医学实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001011；实验设施合格证号：SYXK（甘）2011-0001-0000314，饲养于甘肃中医药大学医学实验中心。

[0178] 普通级FMMU白化豚鼠，♀♂各半，实验开始时平均体质量为270g，甘肃中医药大学医学实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001011；实验设施合格证号：SYXK（甘）2011-0001-0000314，饲养于甘肃中医药大学医学实验中心。

[0179] 2方法

[0180] 2.1急性毒性实验

[0181] 取家兔20只，♀♂各半，随机分为完整皮肤组和破损皮肤组，每组10只。给药前24h，用电推剪在家兔背部脱毛，脱毛面积约9cm×9cm，去毛后检查去毛皮肤是否受伤并剔除受伤家兔。破损皮肤组兔背部脱毛区用75％乙醇消毒，然后用一次性注射器针头在脱毛区划“井”字切口，以不损伤皮下组织并有渗血为标准。各组家兔贴对应贴剂24h后，用温水洗净残留药物，即刻开始观察家兔皮肤、眼睛、黏膜、呼吸、饮食、大小便、自主活动、行为改变等指标；当出现毒理反应，则观察毒性反应的严重程度和消失情况。连续观察12天，每天观察2次，并于第0、1、6、12天测量体质量。如有死亡或濒死家兔，或出现肉眼可见的病变时，则及时进行解剖和病理组织学检查。

[0182] 2.2单次皮肤原发性刺激实验

[0183] 取家兔20只，♀♂各半，随机分为完整皮肤组和破损皮肤组，每组10只。各组家兔均采用同体自身左右侧对比法，右侧给予凡士林（0.5g/只），左侧给予对应药物（2cm×2cm/只），单次给药，固定6h后去除药物，用温水洗净残留药物。于实验开始前和观察期结束时记录家兔体质量和去除药物第1、24、48、72h后涂药部位的红斑与水肿情况。

[0184] 红斑评分：无红斑计0分，轻度红斑（呈淡红色）计1分，中度红斑（呈鲜红色）计2分，重度红斑（呈暗红色）计3分，严重红斑（紫红色红斑到轻度焦痂形成）计4分；水肿评分：无水肿计0分，轻度水肿（勉强可见）计1分，中度水肿（皮肤明显隆起）计2分，重度水肿（皮肤隆起1mm，轮廓清楚）计3分，严重水肿（皮肤隆起＞1mm并有扩大）计4分。观察各组家兔红斑与水肿积分的平均值，按皮肤刺激强度评价标准，进行刺激强度评价，总分为0～8分，其中0～
0.49分为无刺激性、0.5～2.99分为轻度刺激性、3.0～5.99分为中度刺激性、6.0～8.0分为强刺激性。

[0185] 2.3皮肤致敏实验

[0186] FMMU豚鼠，♀♂各半，随机分为完整皮肤组和破损皮肤组，每组10只。于第0、6、12d进行诱导接触，给药部位为豚鼠左侧肋腹部去毛区皮肤；于第24d行激发接触，给药部位为豚鼠右侧肋腹部去毛区皮肤，给药量和诱导接触保持一致。观察第0、24、48、72h后给药局部皮肤红斑、水肿情况，同时观察动物有无哮喘、站立不稳或休克等全身过敏反应。红斑、水肿评价同“2.2”项下方法，过敏反应发生率＝组内出现皮肤红斑、水肿或全身过敏反应的动物数/本组动物总数×100％。过敏反应发生率为0～10％时评价为无致敏性、10％～30％时评价为轻度致敏性、30％～60％时评价为中度致敏性、60％～80％时评价为高度致敏性、80％～100％时评价为极度致敏性。

[0187] 2.4统计学方法

[0188] 体质量数据采用SPSS18.0统计软件进行处理。

[0189] 3 结果

[0190] 3.1 急性毒性实验结果

[0191] 观察期间，各组家兔饮食饮水正常，均未见竖毛、分泌物及排泄物、眼睑异常。个别家兔可见轻微红痕，疑为贴剂自身黏性和人为撕扯所致，3d左右即可消退。破损皮肤各组兔结痂外均未见异常，精神状态良好，家兔外观及行为活动正常，破损皮肤在6天左右均可自行愈合，实验结束时无家兔死亡。第0、1、6、12天各组家兔体质量比较，差异无统计学意义。

[0192] 3.2单次皮肤原发性刺激实验结果

[0193] 铁棒锤炮制品橡胶膏剂破损皮肤组家兔在去除药物1、24h后表现出轻度刺激性，去除药物48h后刺激性消失。铁棒锤炮制品橡胶膏剂完整皮肤组家兔在去除药物1、24、48、72h后，皮肤刺激强度平均值为0分，评价为无刺激性。详见表6。

[0194] 表6 各组家兔单次皮肤原发性刺激实验结果

[0195]

[0196] 3.3皮肤致敏实验结果

[0197] 铁棒锤炮制品橡胶膏剂完整皮肤组及铁棒锤炮制品橡胶膏剂破损皮肤组豚鼠激发部位皮肤均未出现红斑、水肿，无哮喘、站立不稳或休克等全身过敏反应，过敏反应发生率均为0，均评价为未见皮肤过敏反应。结果表明，铁棒锤炮制品橡胶膏剂对豚鼠无皮肤致敏作用。

[0198] 4 结论

[0199] 铁棒锤炮制品橡胶膏剂对皮肤无毒性、无刺激性、无致敏性，表明其使用安全、无毒副作用。综上所述，铁棒锤炮制品橡胶膏剂经皮肤给药安全性较好。

[0200] 实验五：HPLC同时测定本发明铁棒锤炮制品中3种成分的含量

[0201] 本发明在现有技术研究的基础上，采用双波长切换法同时测定本发明铁棒锤炮制品中的新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱的含量，建立专属性较强的检测方法，为全面控制本发明铁棒锤炮制品的质量提供保证。

[0202] 1 仪器与试药

[0203] Agilent 1200系列高效液相色谱仪，包括G1322A型在线脱气机、G1311A型四元泵、G1316A型柱温箱、G1314A可变波长检测器（VWD），BS124S型电子分析天平（Sartorius）。

[0204] 新乌宁碱（广州隽沐生物科技有限公司，批号151023，151102，经HPLC纯度检查，用归一化法计算，纯度≥99%），3-乙酰乌头碱对照品（武汉斯坦德化工科技有限公司，批号151203、151228，经HPLC纯度检查，纯度≥99%），12-表乙酰去氢乌头碱对照品（南京卡塞斯医药科技有限公司，批号150926、151021，经HPLC纯度检查，纯度≥99%），甲醇（色谱级，TEDIA公司），水为双蒸水，其他试剂位分析纯。

[0205] 铁棒锤炮制品：取铁棒锤药材1000g，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品。

[0206] 2 方法与结果

[0207] 2.1 色谱条件

[0208] 色谱条件：Syncronis C色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动性进行梯度洗脱，洗脱顺序：0～15min，甲醇保持在15%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液保持在85%；16～20min，甲醇从15%线性上升为20%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从85%线性下降至
80%；21～30min，甲醇从20%线性上升为40%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从80%线性下降至
60%；检测波长235nm（0～20min，检测新乌宁碱、3-乙酰乌头碱）和365nm（21～30min，检测
12-表乙酰去氢乌头碱），柱温36℃，流速1.0mL·min-1，进样量20μL。

[0209] 2.2 溶液的制备

[0210] 2.2.1 混合对照品溶液的制备

[0211] 取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成每1mL含新乌宁碱0.750mg，3-乙酰乌头碱0.800mg，12-表乙酰去氢乌头碱0.220mg的混合对照品溶液，即得。

[0212] 2.2.2 供试品溶液的制备

[0213] 取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成每1mL含新乌宁碱0.750mg，3-乙酰乌头碱0.800mg，12-表乙酰去氢乌头碱0.220mg的混合对照品溶液，即得。

[0214] 2.3 方法学研究

[0215] 2.3.1 系统适应性试验

[0216] 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各20μL注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进样测定，见附图1和附图2。其中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱的保留时间分别为8.15，22.85，46.64min，分离度良好，不受其他组分的干扰。

[0217] 2.3.2 线性关系考察

[0218] 精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL混合对照品溶液，置于10mL量瓶中，用双蒸水稀释定容，制得6个不同质量浓度的对照品溶液。取上述对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，测定峰面积，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，对照品质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。结果见表7。

[0219] 表7  线性关系

[0220]

[0221] 2.3.3 精密度考察

[0222] 精密吸取同一供试品溶液按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱的峰面积RSD分别为0.26%，0.29%，0.32%，表明仪器的精密度良好。

[0223] 2.3.4 稳定性考察

[0224] 按2.1项下色谱条件精密吸取同一供试品溶液于0，3，6，9，12，15h进样分析，记录峰面积，结果新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱的峰面积RSD为1.65%，1.38%，1.39%，表明供试品溶液在15h内稳定。

[0225] 2.3.5重复性考察

[0226] 取同一批号的本发明铁棒锤炮制品粉末6份，按2.2.2项下分别制得供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，结果新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱的峰面积RSD分别为1.41%，1.32%，1.45%，表明重复性良好。

[0227] 2.3.6回收率试验

[0228] 精密称取已知含量的本发明铁棒锤炮制品粉末6份，每份0.5g，分别精密加入混和对照品储备液1.0mL，按2.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积，结果新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱的平均回收率分别为98.23%，101.25%，102.34%，回收率RSD分别为1.65%，1.48%，1.52%，实验结果见表8。

[0229] 表8 铁棒锤炮制品中各成分加样回收试验

[0230]

[0231] 2.4样品含量测定

[0232] 分别取3批样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，采用外标法计算新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱的含量。结果见表9。

[0233] 表 9  本发明铁棒锤炮制品样品含量测定（n=3）    mg·g-1

[0234]

[0235] 3讨论与结论

[0236] 3.1 检测波长的选择

[0237] 为了实现新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱的同时测定，分别对3个对照品溶液在200～700nm进行紫外扫描，其中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱在233，240nm有最大吸收，但12-表乙酰去氢乌头碱的最大吸收波长在365nm，难以选择单一波长对这3个化合物进行紫外检测。故根据出峰时间，变换检测波长进行测定，兼顾到各成分的最大吸收，提高检测灵敏度。

[0238] 3.2流动相的选择

[0239] 实验考察甲醇-水、甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%乙酸水4种流动相，结果以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液系统的洗脱效果最佳，并尝试了该流动相的多种线性梯度洗脱，得到的色谱峰峰形和分离度都较好，基线稳定。

[0240] 本实验建立的方法能同时测定本发明铁棒锤炮制品中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱含量，该方法简便、可靠，重复性好，可全面评价制剂的质量。通过检测不同批次生产的本发明铁棒锤炮制品，发现3种有效成分含量的一致性较好，这更说明测定它们的含量无论是对于控制生产工艺还是保障药品质量都具有十分重要的意义。

[0241] 实验六：各组铁棒锤炮制品中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱的含量测定

[0242] 1 待测样品

[0243] （1）铁棒锤炮制品A：取铁棒锤药材100g，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品A，粉碎成细粉，备用。

[0244] （2）铁棒锤炮制品B：取铁棒锤药材100g，切成片状，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品B，粉碎成细粉，备用。

[0245] （3）铁棒锤炮制品C：取铁棒锤药材100g，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在220℃下，炒制3min，冷却，即得铁棒锤炮制品C，粉碎成细粉，备用。

[0246] （4）铁棒锤炮制品D：取铁棒锤药材100g，切成片状，用黄酒焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在300℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品D，粉碎成细粉，备用。

[0247] 2 测定方法

[0248] 采用本发明实验四提供的高效液相色谱法，同步测定各组铁棒锤炮制品中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱的含量。

[0249] 3 测定结果

[0250] 测定结果，见表10。

[0251] 表10  样品含量测定结果    mg·g-1

[0252]

[0253] 4 讨论

[0254] 从表10中可以看出，铁棒锤炮制品A中的毒性较高的新乌宁碱的含量明显低于铁棒锤炮制品B、C和D，而其含有的药效活性成分3-乙酰乌头碱和12-表乙酰去氢乌头碱的含量明显高于其他铁棒锤炮制品，这可能也是本铁棒锤炮制品A在治疗关节炎、哮喘方面的效果优于其他铁棒锤炮制品，且其毒性又大幅度降低的原因。

[0255] 附图说明：

[0256] 图1：混合对照品高效液相色谱图

[0257] 图2：铁棒锤炮制品供试品高效液相色谱图

[0258] 其中：1号峰为新乌宁碱色谱峰、2号峰为3-乙酰乌头碱色谱峰、3号峰为12-表乙酰去氢乌头碱色谱峰

[0259] 具体实施方式：

[0260] 实施例1：铁棒锤炮制品

[0261] 处方：铁棒锤药材1000g

[0262] 制备方法：取铁棒锤药材1000，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品。

[0263] 采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量，测定步骤为：

[0264] 采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量，测定步骤为：

[0265] （1）色谱条件：Syncronis C色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动性进行梯度洗脱，洗脱顺序：0～15min，甲醇保持在15%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液保持在85%；16～20min，甲醇从15%线性上升为20%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从85%线性下降至80%；21～30min，甲醇从20%线性上升为40%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从80%线性下降至60%；0～20min时，检测波长235nm，检测新乌宁碱、3-乙酰乌头碱；21～30min时，检测波长365nm，检测12-表乙酰去氢乌头碱，柱温36℃，流速1.0mL·min-1，进样量20μL；

[0266] （2）混合对照品溶液的制备：取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成每1mL含新乌宁碱0.750mg，3-乙酰乌头碱0.800mg，12-表乙酰去氢乌头碱0.220mg的混合对照品溶液，即得；

[0267] （3）供试品溶液的制备：精密称定本发明铁棒锤炮制品粉末0.8g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定质量，加热回流1h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

[0268] （4）测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定。

[0269] （5）测定结果：每克铁棒锤炮制品中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量分别为1.12mg、2.33mg、0.31mg。

[0270] 实施例2：铁棒锤炮制品橡胶膏剂

[0271] 处方：铁棒锤药材1000g

[0272] 制备方法：

[0273] （1）取铁棒锤药材1000g，切成片状，用米醋焖润24h，焖润后晾干，加10倍量的中砂，在260℃下，炒制6min，冷却，即得铁棒锤炮制品；

[0274] （2）取步骤（1）的铁棒锤炮制品，粉碎成细粉，加水搅拌制成相对密度为1.10的流浸膏；

[0275] （3）取步骤（2）的流浸膏，加入橡胶膏剂的常规基质，该常规基质为橡胶10kg、松香10kg、羊毛脂3kg、凡士林1.0kg、液体石蜡0.5kg、氧化锌10kg、汽油30kg，混匀，制成涂料，进行涂膏，切段，盖衬，切成5cm×7cm的小块1000块，即得；

[0276] 采用高效液相色谱法同时测定铁棒锤炮制品橡胶膏剂中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量，测定步骤为：

[0277] （1）色谱条件：Syncronis C色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动性进行梯度洗脱，洗脱顺序：0～15min，甲醇保持在15%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液保持在85%；16～20min，甲醇从15%线性上升为20%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从85%线性下降至80%；21～30min，甲醇从20%线性上升为40%，0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液从80%线性下降至60%；0～20min时，检测波长235nm，检测新乌宁碱、3-乙酰乌头碱；21～30min时，检测波长365nm，检测12-表乙酰去氢乌头碱，柱温36℃，流速1.0mL·min-1，进样量20μL；

[0278] （2）混合对照品溶液的制备：取新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成每1mL含新乌宁碱0.750mg，3-乙酰乌头碱0.800mg，12-表乙酰去氢乌头碱0.220mg的混合对照品溶液，即得；

[0279] （3）供试品溶液的制备：取铁棒锤炮制品橡胶膏剂1片，精密称定，剪成1cm×1cm的碎片，置50mL圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定质量，加热回流1h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

[0280] （4）测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定；

[0281] （5）测定结果：每片铁棒锤炮制品橡胶膏剂中新乌宁碱、3-乙酰乌头碱、12-表乙酰去氢乌头碱成分的含量分别为1.05mg、2.20mg、0.24mg。