本发明提供一种高纯度枸杞酸的制备方法，该方法包括(1)提取、(2)过100目筛结合离心过滤、(3)浓缩、(4)浓缩液酸化、(5)通过阳离子树脂、(6)通过弱阴离子树脂、(7)碱化、(8)强碱性阴离子树脂HCO3‑化、(9)强阴离子树脂交换、(10)脱除钠离子、(11)通过弱阴离子树脂、(12)浓缩、(13)凝胶柱层析、(14)再浓缩、(15)将步骤(14)得到的浓缩物重复进行步骤(13)过交联葡聚糖凝胶柱和(16)浓缩干燥等步骤，得到高纯度枸杞酸。用本发明方法制得的枸杞酸经HPLC鉴别纯度达95％～98％。本发明方法宜于工业化生产，具有较大的应用价值。
1.枸杞酸的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(1)提取：将枸杞原料用蒸馏水冷浸膨胀后，继续加8-12倍重量水加热提取，提取次数为1-3次；
(2)过100目筛结合离心过滤：将上述浸泡的液体先通过100目筛去除残渣，滤液经过离心后取得清液；
(3)浓缩：所得的清液浓缩到原体积的1/3-1/4；
(4)浓缩液酸化：用酸化液将步骤(3)的溶液调到pH为3；
(5)通过阳离子树脂：浓缩液以1个柱体积量/小时的流速通过强阳离子树脂，收集全部通过的液体；
(6)通过弱阴离子树脂：将步骤(5)所得料液以1个柱体积量/小时的流速通过弱阴离子树脂，收集全部通过的液体；
(7)碱化：将步骤(6)通过的液体用碱液调节到pH为9.5；
(8)强碱性阴离子树脂HCO3-化：用0.8M的NaHCO3溶液通过备用的强碱性阴离子树脂，以
1个柱体积量/小时的流速通过，并静置2h后用蒸馏水洗到中性；
(9)强阴离子树脂交换：将步骤(7)所得到的清液通过步骤(8)HCO3-化的强阴离子树脂，以1个柱体积量/小时的流速通过，先后采用2-3个柱体积蒸馏水、2-3个柱体积的0.05～
0.4M浓度NaHCO3水溶液作为洗脱剂，蒸馏水洗脱可将多糖大分子物质除去，洗脱液用紫外实时监测，观察260nm处的吸光值，收集NaHCO3洗脱液中吸光值较高的洗脱液；
(10)脱除钠离子：将步骤(9)得到的洗脱液通过氢型强酸阳离子树脂脱钠离子，以1个柱体积量/小时的流速通过，收集脱除钠离子的料液；
(11)通过弱阴离子树脂：将步骤(10)得到的清液通过弱阴离子树脂，以1个柱体积量/小时的流速通过，收集全部的通过液，检测pH值；
(12)浓缩：将步骤(11)得到的液料真空浓缩至膏状，浓缩温度在50～60℃之间，压力在
0.05Mpa-0.08Mpa，浓缩物料最终的水分含量≤20％；此时浓缩物的枸杞酸含量已经可以达到14％-16％；
(13)凝胶柱层析：用1:2料液比的蒸馏水溶解步骤(12)得到的膏状物，过交联葡聚糖凝胶柱，流速控制在1～2ml/min，用蒸馏水洗脱，每15ml收集一个试管，HPLC检测，集合枸杞酸含量较高的馏分，收集的枸杞酸含量>30％；
(14)再浓缩：真空浓缩步骤(13)得到的枸杞酸高含量馏分，浓缩至膏状物，浓缩温度在
50～60℃之间，压力在0.05Mpa-0.08Mpa，浓缩物料最终的含水量≤20％；
(15)将步骤(14)得到的浓缩物重复进行步骤(13)过交联葡聚糖凝胶柱，流速控制在1～2ml/min，收集枸杞酸含量较高的馏分，枸杞酸含量>60％，HPLC检测；再重复此步骤操作；
得到最后收集的高含量枸杞酸溶液，枸杞酸含量为95％～98％；
(16)浓缩干燥：将最后收集的高纯度枸杞酸溶液真空50℃～55℃浓缩至干，得到高纯度枸杞酸。
2.根据权利要求1所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)提取：将枸杞原料用蒸馏水冷浸膨胀后，继续加10倍重量水加热提取2次。
3.根据权利要求1所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的酸化液选自
0.1M～1M浓度的HCL、柠檬酸、醋酸、磷酸或甘氨酸溶液。
4.根据权利要求1所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)或(10)中的强酸阳离子树脂选自型号732、D001、D002、HZ001、HZ002、HZ016、JK006、JK008或HD-8树脂。
5.根据权利要求4所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)或(10)中的强酸阳离子树脂为732树脂。
6.根据权利要求1所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)或(11)中弱碱性阴离子树脂选自型号D301、D315、D345或D 335树脂。
7.根据权利要求6所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)或(11)中弱碱性阴离子树脂为D315树脂。
8.根据权利要求1所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中碱化液为0.1M～1M的NaOH溶液或者NaHCO3溶液。
9.根据权利要求1所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(8)或(9)中强碱阴离子树脂为型号711、717、D296、HZ202、D201、D293或D202树脂。
10.根据权利要求9所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(8)或(9)中强碱阴离子树脂为D201树脂。
11.根据权利要求1所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(9)中的NaHCO3溶液浓度为0.05M～0.4M。
12.根据权利要求11所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(9)中的NaHCO3溶液浓度为0.1M浓度。
13.根据权利要求1所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(13)或(15)中葡聚糖凝胶柱中充填物为型号Sephadex LH-20、Sephadex G-15、Sephadex G-25、Sephadex G-
50、Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150或Sephadex G-200。
14.根据权利要求13所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(13)或(15)中葡聚糖凝胶柱中充填物为型号Sephadex LH-20。
15.根据权利要求1所述枸杞酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(14)的重复次数为1次～5次。
枸杞酸的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物提取物制备方法，具体涉及一种高纯度枸杞酸的制备方法。
背景技术
[0002] 枸杞在中国资源丰富，且作为滋补保健类药品已经有非常悠久的历史。枸杞产品因具有清肝润肺、滋肾益气、祛风明目等作用及调节免疫力，延缓衰老等功能深受人们喜爱，并且广泛用到食品、化妆品和医药行业中。枸杞中含有大量的营养功效成分，其中枸杞酸(AA2βG)是目前唯一一种从天然资源(枸杞果实)中发现的新型稳定的VC衍生物。国内外学者通过体内外实验研究表明AA2βG具有一定的清除自由基和抗氧化能力。目前有研究通过化学法合成和酶法合成过枸杞酸，但工艺复杂、不稳定。本申请人曾发明一种制备含枸杞酸的枸杞提取物的方法，并申请了中国专利(申请号2012105328009，一种制备高纯度枸杞酸的方法)，并提出将枸杞酸作为主要指标确保枸杞加工产品的质量。本发明人进一步研究了枸杞酸提取工艺，设计提高提取选择性的新方法，具有重要的意义。
发明内容
[0003] 本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计更有效地提取制备高纯度枸杞酸的方法。
[0004] 本发明提供一种高纯度枸杞酸的制备方法，该方法包括下列步骤：
[0005] (1)提取：将枸杞原料用蒸馏水冷浸膨胀后，继续加8-12倍重量水加热提取，提取次数为1-3次；优选10倍重量的水及提取2次。(2)过100目筛结合离心过滤：将上述浸泡的液体先通过100目筛去除残渣，滤液经过离心后取得清液；
[0006] (3)浓缩：所得的清液浓缩到原体积的1/3-1/4；
[0007] (4)浓缩液酸化：用酸化液将步骤(3)的溶液调到pH为3；
[0008] (5)通过阳离子树脂：浓缩液以1个柱体积量/小时的流速通过强阳离子树脂，收集全部通过的液体；
[0009] (6)通过弱阴离子树脂：将步骤(5)所得料液以1个柱体积量/小时的流速通过弱阴离子树脂，收集全部通过的液体；
[0010] (7)碱化：将步骤(6)通过的液体用碱液调节到pH为9.5；
[0011] (8)强碱性阴离子树脂HCO3-化：用0.8M的NaHCO3溶液通过备用的强碱性阴离子树脂，以1个柱体积量/小时的流速通过，并静置2h后用蒸馏水洗到中性；
[0012] (9)强阴离子树脂交换：将步骤(7)所得到的清液通过步骤(8)HCO3-化的强阴离子树脂，以1个柱体积量/小时的流速通过，先后采用2-3个柱体积蒸馏水、2-3个柱体积的0.05～0.4M浓度NaHCO3水溶液作为洗脱剂，蒸馏水洗脱可将多糖等大分子物质除去。洗脱液用紫外实时监测，观察260nm处的吸光值，收集NaHCO3洗脱液中吸光值较高的洗脱液；
[0013] (10)脱除钠离子：将步骤(9)得到的洗脱液通过氢型强酸阳离子树脂脱钠离子，以1个柱体积量/小时的流速通过，收集脱除钠离子的料液；
[0014] (11)通过弱阴离子树脂：将步骤(10)得到的清液通过弱阴离子树脂，以1个柱体积量/小时的流速通过，收集全部的通过液，检测pH值；
[0015] (12)浓缩：将步骤(11)得到的液料真空浓缩至膏状，浓缩温度在50～60℃之间，压力在0.05Mpa-0.08Mpa，浓缩物料最终的水分含量≤20％；此时浓缩物的枸杞酸含量已经可以达到15％左右；
[0016] (13)凝胶柱层析：用1:2料液比的蒸馏水溶解步骤(12)得到的膏状物，过交联葡聚糖凝胶柱，流速控制在1～2ml/min，用蒸馏水洗脱，每15ml收集一个试管，HPLC检测，集合枸杞酸含量较高的馏分，收集的枸杞酸含量>30％；
[0017] (14)再浓缩：真空浓缩步骤(13)得到的枸杞酸高含量馏分，浓缩至膏状物，浓缩温度在50～60℃之间，压力在0.05Mpa-0.08Mpa，浓缩物料最终的含水量≤20％；
[0018] (15)将步骤(14)得到的浓缩物重复进行步骤(13)过交联葡聚糖凝胶柱，流速控制在1～2ml/min，收集枸杞酸含量较高的馏分(枸杞酸含量>60％)，HPLC检测；再重复此步骤操作；得到最后收集的高含量枸杞酸溶液，枸杞酸含量>98％；
[0019] (16)浓缩干燥：将最后收集的高含量枸杞酸溶液真空50℃～55℃浓缩至干，得到高纯度枸杞酸。
[0020] 本发明可用中国宁夏、新疆、甘肃瓜州、甘肃靖远、青海等产地的枸杞为原料。
[0021] 本发明方法所述步骤(4)的酸化液选自0.1～1M浓度的HCL、柠檬酸、醋酸、磷酸或甘氨酸溶液。
[0022] 所述步骤(5)或(10)中的强酸阳离子树脂选自型号732、D001、D002、HZ001、HZ002、HZ016、JK006、JK008或HD-8树脂，优选732树脂。
[0023] 所述步骤(6)或(11)中弱碱性阴离子树脂选自型号D301、D315、D345或D 335树脂，优选D315树脂。
[0024] 所述步骤(7)中碱化液为0.1～1M的NaOH溶液或者NaHCO3溶液。
[0025] 所述步骤(8)或(9)中强碱阴离子树脂选自型号711、717、D296、HZ202、D201、D293或D202树脂，优选D201树脂。
[0026] 所述步骤(9)中的NaHCO3溶液浓度为0.05～0.4M，优选0.1M浓度。
[0027] 所述步骤(13)或(15)中葡聚糖凝胶柱中充填物选自型号Sephadex LH-20、Sephadex G-15、Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150或Sephadex G-200，优选Sephadex LH-20。
[0028] 所述步骤(14)的重复次数为1～5次，每重复一次相应的枸杞酸浓度提高一个梯度，根据枸杞酸浓度要求决定重复次数。(第一次收集的枸杞酸浓度>30％；第二次>60％,第三次>80％,第四次>95％,第五次>98％)
[0029] 使用本发明方法制得的枸杞酸经HPLC鉴别纯度最高可达95％～98％。
[0030] 本发明利用提取、离子交换、凝胶层析等纯化方法可制备了各种纯度的枸杞酸，枸杞酸纯度可自动调节，由高效液相色谱检测枸杞酸纯度最高可达95％～98％。本发明方法宜于工业化生产，具有较大的应用价值。
附图说明
[0031] 图1本发明制得的15％左右含量的枸杞酸HPLC检测图(实例1)
[0032] 图2本发明制得的高纯度枸杞酸HPLC检测图(实例1)
[0033] 图3本发明制得的高纯度枸杞酸HPLC检测图(实例2)
具体实施方式
[0034] 实例1
[0035] 取1公斤甘肃瓜州枸杞干果，先加入5公斤蒸馏水在搅拌机中浸泡20min后搅碎，再继续加蒸馏水至10公斤，60℃搅拌提取1h后取清液，渣继续加10公斤蒸馏水，60℃搅拌提取1h后取清液，将两次滤液收集合并，冷却到室温25℃后，先用100目筛将残渣滤去，过滤清液用高速离心机8000h/min转15min，取上清液18.2L，料液用旋转蒸发仪50～55℃、小于
0.08Mpa条件下真空浓缩到小体积(为原来体积的1/4)，得到4.8L的料液。用1M的HCl溶液调料液pH到3。调好的清液迅速通入到已经洗干净的(H+型)732树脂柱中，控制流速为1柱体积/小时，并用1柱体积蒸馏水替换掉柱内残留料液，流出液直到紫外检测260nm处有峰出现时收集通过液。通过液继续通过洗净的(OH-型)D315树脂，控制流速为1柱体积/小时，并用1柱蒸馏水替换掉柱内残留料液，流出液直到紫外检测260nm处有峰出现时收集通过液。收集全部的通过液6.5L，此时通过液pH试纸检测应为中性。浓缩，旋转蒸发仪50～55℃下真空浓缩到3.8L。用1M的NaOH溶液调节通过液pH到9.5后，迅速通过已经前处理成(HCO3-型)的D201树脂，控制流速为1柱体积/小时，之后用2倍柱体积的蒸馏水等速洗脱，继续用2倍柱体积0.1M浓度NaHCO3溶液洗脱，并用1柱体积蒸馏水替换掉柱内残留料液，收集NaHCO3溶液洗脱液，流出液直到紫外检测260nm处有峰出现时开始收集，得到8L的洗脱液，洗脱液迅速倒入洗净的强酸阳离子732树脂中(H+型)，搅拌1h直至肉眼观察不到气泡，之后过100目筛除去树脂，过滤液继续通过强酸阳离子732树脂中(H+型)，控制流速为1柱体积/小时，并用1柱蒸馏水替换掉柱内残留料液，流出液直到紫外检测260nm处有峰出现时开始收集。通过液继续通过洗净的弱碱阴离子树脂D315(OH-型)，控制流速为1柱体积/小时，并用1柱体积蒸馏水替换掉柱内残留料液，流出液直到紫外检测260nm处有峰出现时开始收集。收集全部的通过液9.3L，此时通过液pH试纸检测应为中性。真空旋转蒸发仪50～55℃下浓缩到至干，得到
15.1g浓缩粉末，此时用HPLC检测枸杞酸含量可以达到14.42％。称取3g浓缩粉末溶于6ml蒸馏水，充分溶解后过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH20，控制流速1.3ml/min。紫外260nm实时检测，收集260nm处枸杞酸高度集中的馏分。将收集的馏分50～55℃下浓缩到小体积浆状物质，加0.5ml的蒸馏水溶解后继续过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH20，控制流速1.3ml/min。重复过Sephadex LH20柱3～4次后将收集的馏分50～55℃浓缩至干，得固体0.34g。
[0036] HPLC纯度鉴定为97.1％(见图2)。
[0037] 实例2
[0038] 取1公斤甘肃瓜州枸杞干果，先加入5公斤蒸馏水在搅拌机中浸泡20min后搅碎，加至10公斤蒸馏水，80℃搅拌提取1h后取清液，渣继续加10公斤，80℃搅拌提取1h后取清液，将两次滤液收集合并。提取液处理，冷却到室温(25℃)后，先用100目筛将残渣滤去，过滤清液用高速离心机8000h/min转15min，取上清液，上清液称量有19.6L，料液用旋转蒸发仪50～55℃、小于0.08Mpa条件下真空浓缩到小体积(为原来的1/4)，得到5.1L的料液。用1M的HCl溶液调料液pH到3。调好的清液迅速通入到已经洗干净的(H+型)D002树脂柱中，控制流速为1柱体积/小时，并用1柱体积蒸馏水替换掉柱内残留料液，流出液直到紫外检测260nm处有峰出现时收集通过液。通过液继续通过洗净的(OH-型)D345树脂，控制流速为1柱体积/小时，并用1柱蒸馏水替换掉柱内残留料液，流出液直到紫外检测260nm处有峰出现时收集通过液。收集全部的通过液7.3L，此时通过液pH试纸检测应为中性。可以适当浓缩到小体积，旋转蒸发仪50～55℃下真空浓缩到4.3L。用1M的NaOH溶液调节通过液pH到9.5后，迅速通过已经前处理成(HCO3-型)的717树脂，控制流速为1柱体积/小时，之后用2倍柱体积的蒸馏水等速洗脱，继续用2倍柱体积0.2M浓度NaHCO3溶液洗脱，并用1柱体积蒸馏水替换掉柱内残留料液，收集NaHCO3溶液洗脱液，流出液直到紫外检测260nm处有峰出现时开始收集，+得到9L的洗脱液，洗脱液迅速倒入到洗净的强酸阳离子D002树脂中(H型)，搅拌1h直至肉眼观察不到气泡，之后过100目筛除去树脂，过滤液继续通过强酸阳离子D002树脂中(H+型)，控制流速为1柱体积/小时，并用1柱蒸馏水替换掉柱内残留料液，流出液直到紫外检测
260nm处有峰出现时开始收集。通过液继续通过洗净的弱碱阴离子树脂D345(OH-型)，控制流速为1柱体积/小时，并用1个柱体积的蒸馏水替换掉柱内残留料液，流出液直到紫外检测
260nm处有峰出现时开始收集。收集全部的通过液10.1L，此时通过液PH试纸检测应为中性。
真空旋转蒸发仪50～55℃下浓缩到至干，得到16.1g浓缩粉末，此时用HPLC检测枸杞酸含量可以达到12.31％。称取3g浓缩粉末溶于6ml蒸馏水，充分溶解后过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH50，控制流速1.3ml/min。紫外260nm实时检测，收集260nm处枸杞酸高度集中的馏分。将收集的馏分50～55℃下浓缩到小体积浆状物质，加0.5ml的蒸馏水溶解后继续过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH50，控制流速1.3ml/min。重复过Sephadex G50柱3～4次后将收集的馏分50～55℃浓缩至干，得固体0.41g。
[0039] HPLC纯度鉴定为98.0％(见图3)。
