在果蝇细胞中高表达人GAD65蛋白的基因序列和蛋白制备方法

摘要

本发明提供一种高表达人GAD65蛋白的基因序列和蛋白制备方法,真核宿主为果蝇S2细胞。通过探讨密码子使用种属偏好性，对人GAD65的原始基因序列进行密码子优化，得到一个可提高重组蛋白表达效率的全新GAD65基因序列，如SEQ NO.1所示。本发明提供了承载人全新GAD65序列的果蝇细胞高表达载体，包含如SEQ NO.1所示的GAD65基因序列。GAD65含有StrepII标签，通过一步亲和层析纯化即可获得高纯度、高免疫原性的GAD65蛋白，大大提高了重组蛋白的得率并降低了成本。本发明改变了传统的用酵母或昆虫杆状病毒表达系统获得人GAD65的方法，首次利用果蝇S2细胞这一高密度连续培养体系大量表达GAD65，通过StrepII标签快速制备高纯度、低成本并具有良好免疫原性的人GAD65蛋白。

权利要求

1.编码在果蝇细胞中高表达的人GAD65蛋白的基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.人GAD65蛋白的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述基因的如SEQ ID NO.1所示的序列联合StrepII标签克隆到表达载体中，再和抗性质粒同时转染到果蝇细胞中表达，将得到GAD65-StrepII标签融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为pAc5.1/V5-HisA。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗性质粒为pCoBlast抗性载体。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述果蝇细胞为S2。

6.根据权利要求2或3或4或5所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)根据种属偏好性表达，运用软件对人GAD65的ORF序列进行密码子优化；

(2)人工合成全序列；

(3)引物和酶切位点设计：

根据合成的序列和StrepII标签设计引物，并加入KpnI和NotI酶切位点，引物如下所示：forward primer：

5'-CGGGGTACCCAAACATGTGGTCGCATCCGCAGTTCGAGAAGGCCTCGCCAGGAAGCGG-3'；

reverse primer：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATTACAGGTCCTGGCCCAGG-3’；

(4)PCR扩增获得目的GAD65-StrepII片段；

(5)对目的片段和载体进行双酶切；

(6)酶切后的目的片段和载体在T4连接酶作用下连接；

(7)重组转化:将重组表达载体转染细菌感受态细胞；

(8)测序验证后大量抽提表达GAD65-StrepII的载体；

(9)将GAD65-StrepII载体与pCoBlast抗性载体共转染果蝇细胞表达蛋白；

(10)步骤(9)获得的蛋白经过纯化后获得高纯度GAD65蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(5)中的载体为pAc5.1/V5-HisA。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(6)利用连接酶进行重组连接：连接片段100ng，加入50ng酶切后的pAc5.1/V5-His A质粒，5μl 2×反应buffer和1μl T4连接酶，补足水到10μl；在22℃连接1h，转化感受态细胞。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(9)的具体过程：选取培养好的健康的S2细胞，将3×106个细胞接种在60mm组织培养皿中，培养基为针对S2细胞的Sf-900II SFM Medium，每皿加入3ml的培养基，28℃无菌条件下在恒温培养箱中进行培养；

使用磷酸钙转染试剂盒K2780-01进行细胞转染:①在无菌1.5ml的离心管中依次加入双蒸水233μl，氯化钙240mM 36μl，1μg/μl GAD65-StrepII-pAc5.1/V5-His A质粒19μl，0.5μg/μl pCoBlast质粒2μl；

②缓慢混合1min后转移到含有200μl的2×HEPES HBS的离心管中，混匀；

③将混合物在室温放置30-40min；

④缓慢将混合物加入到细胞培养基中，缓慢旋转培养皿以充分混匀；

⑤在28℃的恒温培养箱中培养1天；

⑥对细胞培养基进行换液；

⑦将培养基连同细胞一起吸入15ml的离心管中；

⑧1000rpm离心3min后，去除上清，并加入1ml新鲜培养基到15ml的离心管中；

⑨将混合物重新加入到新的离心管中；

⑩用2ml培养基重新清洗一次；

用2ml培养基悬浮细胞，并转到培养皿中培养；

28℃培养两天后加入20μg/ml Blasticidin筛选克隆建立稳定转染细胞系。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(9)转染后的细胞培养在含20μg/ml Blasticidin的Sf-900II SFM Medium中，分为10个细胞三角培养瓶，每瓶200ml培养基培养；细胞培养物收集裂解后，再通过StrepII标签亲和纯化色谱靶向获得。

说明书

在果蝇细胞中高表达人GAD65蛋白的基因序列和蛋白制备

方法

技术领域：

[0001] 本发明属于人GAD65蛋白高效表达和制备技术领域，具体涉及承载GAD65果蝇细胞高表达基因序列和GAD65高效制备技术。

[0002] 研究背景：

[0003] 谷氨酸脱羧酶(Glutamic Acid Decarboxylase,GAD65)是一种重要的胰岛自身抗原，其蛋白制品可广泛应用但不局限于胰岛自身抗体(谷氨酸脱羧酶抗体,GADA)检测，抗原特异性T淋巴细胞检测和增殖，以及自身免疫糖尿病预防及治疗。

[0004] 外源蛋白的表达往往与多种因素相关，包括转录和翻译的效率。在果蝇细胞中表达人GAD65蛋白，种属间密码子利用度的差异往往会降低外源蛋白的表达水平。本发明通过探讨密码子使用种属偏好性，分析并合成在昆虫S2细胞中表达人GAD65蛋白的最佳序列，最终提高重组蛋白的表达效率。

[0005] 通过培养细胞，获得重组蛋白的表达仍然是大量生产蛋白质的重要方法之一。细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞以及目前已经开展的昆虫细胞的相关研究都各有其限制。在细菌中表达的重组蛋白缺乏正确折叠和翻译后修饰，往往导致重组蛋白的免疫原性较低。酵母表达外源蛋白的翻译后加工与哺乳动物有所不同，且不易进行高密度发酵。在昆虫Sf9，Sf21和High five细胞中可运用昆虫杆状病毒系统表达外源蛋白，但细胞感染后会被裂解，不能稳定连续培养，蛋白批间差异较大。哺乳动物细胞中表达外源蛋白成本高且表达量低。本发明运用果蝇S2细胞表达人GAD65蛋白，蛋白的翻译后加工与哺乳动物中非常相似，并且可高密度连续培养，大大降低成本并为后续纯化工艺的批间一致性提供保障。

[0006] 纯化重组蛋白的常用标签为6His、GST标签等，但往往纯化后蛋白纯度不高，需要借助后续的分子筛、离子交换、疏水层析等手段将目标蛋白纯度提升至90％以上。在本发明中借助StrepII标签介导的亲和层析，可以通过一步亲和层析获得重组GAD65蛋白(纯度90％以上且具有良好的免疫原性)，大大提高了重组蛋白的得率。
发明内容：

[0007] 本发明目的是提供在果蝇细胞中高表达的人GAD65蛋白基因序列和GAD65蛋白高效制备的方法，该改造后的基因序列能够大大提高人GAD65蛋白的表达水平。高密度培养后的昆虫细胞裂解后通过一步亲和层析即可获得纯度90％以上的重组GAD65蛋白，有效降低成本和纯化过程中的损耗。纯化的GAD65蛋白经ELISA验证具有良好的免疫原性。

[0008] 本发明在果蝇细胞中高表达的人GAD65蛋白的基因序列，如SEQ NO.1所示。

[0009] SEQ NO.2所示的序列为本发明如SEQ NO.1所示的人GAD65基因序列改造前的序列。

[0010] 人GAD65蛋白的制备方法，将SEQ NO.1所示的序列联合StrepII标签克隆到表达载体中，再和抗性质粒同时转染到果蝇细胞中表达，将得到GAD65-StrepII标签融合蛋白。

[0011] 所述的表达载体为pAc5.1/V5-His A。

[0012] 所述亲和纯化标签为StrepII标签；所述的抗性质粒为pCoBlast抗性载体。

[0013] 所述果蝇细胞为S2。

[0014] 具体包括以下步骤：

[0015] (1)根据种属偏好性表达，运用OptimumGene软件对人GAD65的ORF序列进行密码子优化；

[0016] (2)人工合成全序列；

[0017] (3)引物和酶切位点设计：

[0018] 根据合成的序列和StrepII标签设计引物，并加入KpnI和NotI酶切位点，引物如下所示：

[0019] forward primer：

[0020] 5'-CGGGGTACCCAAACATGTGGTCGCATCCGCAGTTCGAGAAGGCCTCGCCAGGAAGCGG-3'；

[0021] reverse primer：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATTACAGGTCCTGGCCCAGG-3’；

[0022] (4)PCR扩增获得目的GAD65-StrepII片段；

[0023] (5)对目的片段和载体进行双酶切；

[0024] (6)酶切后的目的片段和载体在T4连接酶作用下连接；

[0025] (7)重组转化:将重组表达载体转染细菌感受态细胞；

[0026] (8)测序验证后大量抽提表达GAD65-StrepII的载体

[0027] (9)将GAD65-StrepII载体与pCoBlast抗性载体共转染果蝇细胞表达蛋白[0028] (10)步骤(9)获得的蛋白经过纯化后获得高纯度GAD65蛋白

[0029] 步骤(5)中的载体为pAc5.1/V5-His A。

[0030] 步骤(6)利用连接酶进行重组连接：连接片段100ng，加入50ng pAc5.1/V5-His A质粒， 5μl 2×反应buffer和1μl T4连接酶，补足水到10μl；在22℃连接1h，转化感受态细胞。

[0031] 步骤(9)的具体过程：

[0032] 选取培养好的健康的S2细胞，将3×106个细胞接种在60mm组织培养皿中，培养基为针对S2细胞的Sf-900 II SFM Medium，每皿加入3ml的培养基，28℃无菌条件下在恒温培养箱中进行培养；

[0033] 使用磷酸钙转染试剂盒K2780-01进行细胞转染：

[0034] ①在无菌1.5ml的离心管中依次加入双蒸水233μl，氯化钙240mM 36μl，1μg/μl GAD65-StrepII-pAc5.1/V5-His A质粒19μl，0.5μg/μl pCoBlast质粒2μl；

[0035] ②缓慢混合1min后转移到含有200μl的2×HEPES HBS的离心管中，混匀；

[0036] ③将混合物在室温放置30-40min；

[0037] ④缓慢将混合物加入到细胞培养基中，缓慢旋转培养皿以充分混匀；

[0038] ⑤在28℃的恒温培养箱中培养1天；

[0039] ⑥对细胞培养基进行换液：

[0040] ⑦将培养基连同细胞一起吸入15ml的离心管中；

[0041] ⑧1000rpm离心3min后，去除上清，并加入1ml新鲜培养基到15ml的离心管中；

[0042] ⑨将混合物重新加入到新的离心管中；

[0043] 用2ml培养基重新清洗一次；

[0044] 用2ml培养基悬浮细胞，并转到培养皿中培养；

[0045] 28℃培养两天后加入20μg/ml Blasticidin筛选克隆建立稳定转染细胞系。

[0046] 步骤(9)转染后的细胞培养在含20μg/ml Blasticidin的Sf-900 II SFM Medium中，分为10个细胞三角培养瓶，每瓶200ml培养基培养；细胞培养物收集裂解后，再通过一步StrepII标签亲和纯化色谱靶向获得。

[0047] 本发明GAD65高表达优化策略及实验验证

[0048] 种属偏好性表达研究

[0049] 首先通过OptimumGene算法，根据序列的开放阅读框，对序列采用专有算法优化，针对 mRNA结构替换了密码子和可优化等方面的参数，筛选了表达克隆密码子优化的基因。软件根据翻译选择(选择的压力存在于翻译基因过程中，即密码子偏好性不同位点(同义，非同义和基因区内)的多态性和分歧之间的关系、构成基因的G、C含量、基因长度、物种的tRNAs的丰度、氨基酸保守性、编码基因在基因组DNA的位置、密码子碱基组成的上下文关系等7个因素构建偏好性表达序列，对人GAD65密码子进行优化。优化后密码子适应指数(Codon Adaptation Index,CAI)从0.63上升到0.96，优化密码子频率(Frequency of Optimal Codons,FOP)大幅提高，GC含量从48.22％优化至61.93％(图1)。

[0050] 实验验证

[0051] Western blotting结果显示，序列改造后的GAD65蛋白表达水平明显高于原始序列(图2)。证明密码子偏好性优化可显著提高重组人GAD65蛋白的表达量。通过一步亲和层析即可获得高纯度GAD65蛋白(图3)，并且蛋白具有良好的免疫原性(图4)。

附图说明

[0052] 图1.GAD65基因序列密码子针对果蝇宿主改造后大幅优化；

[0053] 优化后密码子适应指数(A)、优化密码子频率(C)和GC含量(E)较优化前(B,D,F)有大幅提高。

[0054] 图2.密码子优化可大幅提高果蝇S2细胞中人GAD65蛋白的产量；

[0055] 携带GAD65密码子优化后序列或原始序列的质粒转染果蝇S2细胞，检测细胞裂解物中GAD65和actin的表达水平。

[0056] 图3.一步亲和层析获得高纯度重组GAD65蛋白；

[0057] A,western blotting验证纯化前后的GAD65蛋白；

[0058] B,考马斯亮蓝染色检测纯化后GAD65蛋白纯度；

[0059] C,LC/MS质谱对蛋白N端测序所获序列；

[0060] D,质谱所获序列与NCBI数据库中GAD65蛋白序列完全吻合。

[0061] 图4.纯化的人GAD65蛋白具有良好的免疫原性；

[0062] 纯化的GAD65或商业化GAD65蛋白包被96孔板，ELISA检测阴性血清和低、中、高滴度GADA血清。纯化的GAD65蛋白不仅能够区分GADA阴性和阳性血清，而且能有效区分GADA低、中、高滴度血清。

[0063] 图5.pAc5.1/V5-His A和pCoBlast质粒(Life Technologies)图谱。具体实施方式：

[0064] 以下具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。

[0065] (一)实施例1：构建GAD65-StrepII标签蛋白表达载体

[0066] 1.运用OptimumGene对人GAD65的蛋白编码序列进行密码子优化；

[0067] 2.设计引物和酶切位点

[0068] 根据优化后的序列和StrepII标签序列设计引物，并加入KpnI、NotI酶切位点。引物如下所示：

[0069] P1:

[0070] 5'-CGGGGTACCCAAACATGTGGTCGCATCCGCAGTTCGAGAAGGCCTCGCCAGGAAGCG G-3'[0071] P2：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATTACAGGTCCTGGCCCAGG-3’

[0072] 根据原始序列和StrepII标签序列设计引物，并加入KpnI、NotI酶切位点。引物如下所示：P3:

[0073] 5'-CGGGGTACCCAAACATGTGGTCGCATCCGCAGTTCGAGAAGGCTAGCCCAGGCTCCGGATTTTG-3'

[0074] P4:5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATTATAAATCTTGTCCAAGGC-3’

[0075] 3.PCR扩增获得目的片段

[0076] 合成的DNA用PCR扩增获得目的片段，具体操作如下：

[0077]

[0078] 反应条件：94℃变性5min，之后进入40个循环，循环条件为94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min。在40个循环之后，72℃最终延伸10min。PCR的产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

[0079] 4.PCR产物胶回收

[0080] (1)在PCR反应之后，使用凝胶电泳除去PCR模板，以及其它不需要的产物；

[0081] (2)准备500ml 1×TAE(10ml的50倍TAE稀释到500ml的双蒸水中)；

[0082] (3)配制1％的琼脂糖凝胶。加热至将近沸腾时候，混匀后继续加热，直到肉眼看不到漂浮的颗粒为止(在微波炉上高火加热1-2min即可)。小心拿出装有琼脂糖凝胶的三角瓶，当温度冷却到50℃时，加入3μl溴化乙锭，导入成胶模具并插入大齿梳子；

[0083] (4)按比例在样品中加入样品1/6体积的上样染料；

[0084] (5)上样染料和样品混匀上样，小心点样到琼脂糖凝胶上，90伏特的电泳大约30min；

[0085] (6)凝胶成像，然后切出和预测大小位置一致的条带，放入2ml Eppendorf离心管(EP管)中。切割时使用紫外线灯来定位目的条带；

[0086] (7)凝胶切除后需要立即称重，并去除空2ml的EP管的重量，并记好标签；

[0087] (8)使用上海生工生物有限公司的胶回收提取试剂盒回收样品带；

[0088] (9)在离心管中加入600μl binding Buffer，放入55℃恒温干燥箱进行溶解。每隔1min轻轻摇晃离心管。大约10min后胶块完全溶解；

[0089] (10)溶解后的溶液用移液枪加入到试剂盒提供的过滤管中，放置2min；

[0090] (11)高速冷冻离心，10000rpm离心1min；

[0091] (12)弃去液体，加入wash buffer 600μl，高速冷冻离心机10000r/min离心1min；

[0092] (13)重复12步骤一次；

[0093] (14)弃去液体，13000rpm离心2min；

[0094] (15)将滤膜套入到离心管中，在滤膜中央加入30μl双蒸水以溶解DNA，放置2min后，13000rpm离心1min。离心管中剩余的液体即含有回收的DNA片段。

[0095] 5.双酶切

[0096] 对PCR产物和pAc5.1/V5-His A质粒载体进行双酶切反应：胶回收片段2.0μg或载体2.0μg，加入10×buffer 5μl，两种酶各1μl，补足无菌双蒸水至反应体系50μl。37℃反应2小时，并采用凝胶电泳回收酶切片段。回收后的片段通过测序验证以确定为目标片段。

[0097] 6.利用连接酶进行重组连接

[0098] 连接片段100ng，加入50ng pAc5.1/V5-His A质粒，5μl 2×反应buffer和1μl T4连接酶，补足水到10μl；在22℃连接1h，用于转化感受态细胞。

[0099] 7.转化实验

[0100] 取出贮存在-80℃的DH5α大肠杆菌，在冰上解冻。每个离心管中有100μl的感受态细胞。对于每一个转化反应，吸取5μl的质粒到装有感受态细胞的离心管中，并在冰上孵育20-25min，使得DNA吸附到细胞表面。准备42℃水浴。当感受态细胞预备好后，在42℃水浴中热激90s。随后立即放入冰浴中，冰上2min后加入1ml的LB培养基，并且振荡混匀，让细 胞从热休克恢复并重新开始生长。37℃摇床上培养45-60min，液体会出现浑浊。涂布100μl到含有氨苄青霉素的平板上。在37℃恒温培养箱中培养过夜。培养过夜后的单菌落用枪头小心挑到含有800μl LB培养基的EP管中。37℃摇床上培养4小时，随后采用PCR技术检测是否有目的片段。鉴定为阳性的送上海生工生物有限公司测序。

[0101] 8.质粒大量抽提

[0102] (1)过夜培养100ml细菌；

[0103] (2)重悬细菌在10ml P1缓冲液中。确保核糖核酸酶A已被添加到缓冲液P1中；

[0104] (3)加入10ml缓冲液P2，轻轻颠倒混合4-6次，不要漩涡震荡，因为这将导致基因组DNA的断裂。如有必要，继续颠倒EP管直到溶液变粘和透明，不要让裂解反应时间超过5min；

[0105] (4)加入10ml缓冲液P3，并立即轻轻颠倒试管4-6次，冰上20分钟，紧凑的白色沉淀就会形成；

[0106] (5)4度≥20,000g离心30分钟，将上清转移至QIAGEN-tip 500；

[0107] (6)2次30ml QC溶液洗涤；

[0108] (7)加15ml QF溶液洗脱DNA,加入10.5ml的异丙醇；

[0109] (8)4度≥15,000g离心30分钟；

[0110] (9)将上清倒掉，加入5ml 70％乙醇洗涤DNA,4度≥15,000g离心30分钟；

[0111] (10)倒掉上清，残余溶液风干后加入双蒸水溶解DNA。

[0112] (二)实施例2：昆虫S2细胞中人GAD65的重组表达及鉴定

[0113] 1.果蝇S2细胞复苏和传代

[0114] 从液氮罐中取出冻存的细胞株在室温下解冻；用70％乙醇擦拭并消毒细胞瓶外侧，转移细胞液到4ml室温下的完全培养基中，重悬细胞并在1000g离心2-3分钟，去除培养基中的DMSO.接种细胞到5ml新鲜完全培养基中28℃，无CO2培养箱中培养细胞到密度6～20x106cells/ml。

[0115] 细胞密度到达5x106cells/ml时，细胞成簇状生长，这并不影响细胞的生长，传代过程中可吹打开成团细胞。按1：2至1：5比例传代细胞。28℃培养细胞直至密度达到6～20x106cells/ml。

[0116] 2.重组载体转染果蝇细胞

[0117] 参照DES果蝇表达系统和磷酸钙转染试剂盒(K2780-01)的操作方案进行(Life technology公司)，具体操作如下:

[0118] (1)选取培养好的健康的S2细胞，将3×106的细胞种在60mm组织培养皿中。培养基为针对S2细胞的Sf-900II SFM，每皿加入3ml的培养基。28℃无菌条件下在恒温培养箱中进行培养。

[0119] (2)在无菌1.5ml的离心管中依次加入双蒸水233μl，氯化钙240mM 36μl，1μg/μl GAD65-StrepII-pAc5.1/V5-His A质粒19μl，0.5μg/μl pCoBlast质粒2μl；

[0120] (3)缓慢混合1min后转移到含有200μl的2×HEPES HBS的离心管中，混匀；

[0121] (4)将混合物在室温放置30-40min；

[0122] (5)缓慢将混合物加入到细胞培养基中，缓慢旋转培养皿以充分混匀；

[0123] (6)在28℃的恒温培养箱中培养1天；

[0124] (7)对细胞培养基进行换液；

[0125] (8)28℃培养两天后加入20μg/ml Blasticidin筛选克隆建立稳定转染细胞系。

[0126] 3.重组蛋白的小量表达和鉴定

[0127] 用杀稻瘟菌素筛选稳定表达细胞株并培养3或4周后，离心收集细胞裂解。运用western blotting比较密码子优化前后GAD65蛋白的表达水平(图2)。

[0128] (1)western blotting分离胶的制备

[0129] ①玻璃板用肥皂和水清洗干净，然后用乙醇再清洗一次。并组装好；

[0130] ②首先配制6％的分离胶10ml。加入配制好的分离胶(包含0.008ml TEMED和0.1ml10％APS)。将分离胶倒入两玻璃板中间，并密封胶，在分离胶的上面倒入异丁醇以使分离胶的顶端平整。密封10min后准备倒入浓缩胶。

[0131] (2)western blotting浓缩胶的制备

[0132] ①倒出分离胶上端的异丁醇。并用水清洗掉异丁醇。用滤纸擦干内表面；

[0133] ②在浓缩胶中加入APS/TEMED，混匀，然后倒在分离胶的上面；

[0134] ③垂直插入梳子，然后在梳子两侧倒入少许浓缩胶，以完全密封梳子的两侧，并去除气泡；

[0135] ④等待20-30min以使得浓缩胶重复凝集。

[0136] (3)western blotting凝胶电泳

[0137] ①将制胶模具放入电泳仪，倒入Tris-甘氨酸电泳缓冲液；

[0138] ②小心除去电泳槽周围的气泡；

[0139] ③小心拔出梳子，并用注射器去除孔周围的气泡；

[0140] ④样品和loading buffer共同加热煮沸以变性5min；

[0141] ⑤一开始用20mA的电流进行预电泳。当染色条带跑到分离胶时候，将电流转到30mA。当显色带跑到快到凝胶底端时停止电泳；

[0142] ⑥凝胶用考马斯亮蓝进行染色。将凝胶放入考马斯亮蓝中，染色1h。之后，加入脱色剂(40％乙醇、10％乙酸和50％双蒸水)，分三次脱色，每次1h。脱色完后，拍照观察。

[0143] (4)转膜

[0144] ①将凝胶拿出，放入转膜仪。在转膜仪上倒入转膜液体(本实验所用转膜为湿转技术)。在底层铺设6层滤纸，中间放上醋酸纤维薄膜，上层放凝胶，之后，上层再铺上6层滤纸；

[0145] ②以电流0.25A、250V电压转膜40min；

[0146] ③转好后的膜小心取出。用TBST溶液小心清洗3次，每次5min。随后进入后续操作。

[0147] (5)抗体孵育及显色

[0148] ①首先用脱脂牛奶封闭。加入5％的脱脂牛奶，封闭30min；

[0149] ②将醋酸纤维薄膜用封膜机封闭好；

[0150] ③在封闭袋中加入1ml 1:1000稀释后的GAD65抗体或actin抗体进行孵育，-4℃下孵育过夜；

[0151] ④醋酸纤维薄膜用TBST清洗三次，每次10min；

[0152] ⑤在封闭袋中加入1ml 1:5000稀释后的羊抗兔IgG二抗，室温1个小时；

[0153] ⑥醋酸纤维薄膜用TBST清洗三次，每次10min；

[0154] ⑦采用HRP法进行显色。A、B液混合后，放入醋酸纤维薄膜以化学显色。

[0155] 4.重组蛋白的大量表达、纯化和鉴定

[0156] 在摸索完蛋白纯化的最佳条件之后，将稳定表达GAD65的S2细胞培养在10个三角细胞培养瓶，每瓶200ml培养基里。将细胞培养物收集裂解后通过StrepII标签亲和纯化色谱靶向获得GAD65。亲和层析使用GE  Healthcare公司StrepTrap  HP分离柱(GE Healthcare，28-9075-47)。其原理是StrepTactin可以和StrepII标签特异性结合，使蛋白固定到固相载体上，洗脱杂质后用2.5mM的脱硫生物素洗脱目标蛋白。纯化后蛋白用western blotting、考马斯亮 蓝染色和LC/MS质谱鉴定(图3)。

[0157] 5.蛋白浓度的测定

[0158] 蛋白浓度测定采用二辛可宁酸(BCA)法，按照试剂盒说明书进行(Pierce,23227)。

[0159] 样品在562nm处读取吸光值，首先制备吸光度与蛋白质的标准曲线，并确定拟合曲线公式。

[0160] 根据样品的稀释倍数，确定原始蛋白浓度。

[0161] (三)实施例3：纯化GAD65蛋白的免疫原性

[0162] GAD65的部分抗原表位为空间构象型表位，纯化后的GAD65蛋白必须能正确折叠并形成正确空间构象才能被GADA自身抗体识别。为确定纯化的GAD65蛋白具有很好的免疫原性，我们选取国际上市售最好的GAD65蛋白做对照。纯化的GAD65和商业化GAD65蛋白包被96孔板过夜，洗涤后用1％BSA封闭1小时，然后加入阴性血清，GADA低、中、高滴度血清哺育，洗涤后加入生物素化的GAD65(RSR)，哺育1小时后加入POD偶联的Streptavidin，洗涤后加入底物TMB显示，2M H2SO4终止反应。纯化的GAD65蛋白具有良好的免疫原性，不仅能够区分GADA阴性和阳性血清，而且能有效区分GADA低、中、高滴度的血清(图4)。

[0163] SEQ NO.1(GAD65优化后序列，优化密码子以下划线标示)：

[0164] ATGGCCTCGCCAGGAAGCGGATTCTGGTCCTTCGGATCGGAGGATGGAAGCGGCGACTCCGAGAACCCAGGAACCGCCCGCGCCTGGTGCCAGGTGGCCCAGAAGTTCACCGGCGGCATCGGCAATAAGCTGTGCGCCCTGCTGTACGGCGATGCCGAGAAGCCCGCCGAGTCGGGAGGAAGCCAGCCACCACGCGCCGCCGCCCGCAAGGCCGCCTGCGCCTGCGATCAGAAGCCATGCAGCTGCTCCAAGGTGGACGTGAACTACGCCTTCCTGCACGCCACCGATCTGCTGCCAGCCTGCGACGGAGAGCGCCCAACCCTGGCCTTCCTGCAGGATGTGATGAATATCCTGCTGCAGTACGTGGTGAAGAGCTTCGATCGCTCCACCAAGGTCATCGACTTCCACTACCCCAACGAGCTGCTGCAGGAGTACAATTGGGAGCTGGCCGACCAGCCACAGAACCTGGAGGAGATCCTGATGCACTGCCAGACCACCCTGAAGTACGCCATCAAGACCGGCCACCCGCGCTACTTCAATCAGCTGAGCACCGGACTGGATATGGTGGGACTGGCCGCCGACTGGCTGACCTCCACCGCCAACACCAATATGTTCACCTACGAGATCGCCCCCGTGTTCGTGCTGCTGGAGTACGTGACCCTGAAGAAGATGCGCGAGATCATCGGATGGCCAGGAGGATCGGGCGACGGAATCTTCAGCCCAGGAGGAGCCATCTCCAACATGTACGCCATGATGATCGCCCGCTTCAAGATGTTCCCGGAGGTGAAGGAGAAGGGAATGGCCGCCCTGCCACGCCTGATCGCCTTCACCTCCGAGCACTCGCACTTCAGCCTGAAGAAGGGAGCCGCCGCCCTGGGAATCGGAACCGATAGCGTGATCCTGATCAAGTGCGACGAGCGCGGCAAGATGATCCCGAGCGATCTGGAGCGCCGCATCCTGGAGGCCAAGCAGAAGGGCTTCGTGCCATTCCTGGTGTCGGCCACCGCCGGAACCACCGTGTACGGAGCCTTCGATCCACTGCTGGCCGTGGCCGACATCTGCAAGAAGTACAAGATCTGGATGCACGTGGACGCCGCCTGGGGAGGAGGACTGCTGATGAGCCGCAAGCACAAGTGGAAGCTGTCGGGAGTGGAGCGCGCCAACAGCGTGACCTGGAATCCCCACAAGATGATGGGCGTGCCGCTGCAGTGCTCCGCCCTGCTGGTGCGCGAGGAGGGACTGATGCAGAACTGCAATCAGATGCACGCCTCCTACCTGTTCCAGCAGGATAAGCACTACGACCTGTCGTACGATACCGGCGACAAGGCCCTGCAGTGCGGACGCCACGTGGATGTGTTCAAGCTGTGGCTGATGTGGCGCGCCAAGGGAACCACCGGATTCGAGGCCCACGTGGACAAGTGCCTGGAGCTGGCCGAGTACCTGTACAACATCATCAAGAATCGCGAGGGCTACGAGATGGTGTTCGATGGCAAGCCACAGCACACCAACGTGTGCTTCTGGTACATCCCACCCTCCCTGCGCACCCTGGAGGACAATGAGGAGCGCATGTCCCGCCTGTCCAAGGTGGCCCCCGTGATCAAGGCCCGCATGATGGAGTACGGCACCACCATGGTGTCCTACCAGCCACTGGGCGATAAGGTGAACTTCTTCCGCATGGTCATCTCGAATCCCGCCGCCACCCACCAGGATATCGACTTCCTGATCGAGGAGATCGAGCGCCTGGGCCAGGACCTGTAA[0165] SEQ NO.2(GAD65原始序列)：

[0166]ATGGCATCTCCGGGCTCTGGCTTTTGGTCTTTCGGGTCGGAAGATGGCTCTGGGGATTCCGAGAATCCCGGCACAGCGCGAGCCTGGTGCCAAGTGGCTCAGAAGTTCACGGGCGGCATCGGAAACAAACTGTGCGCCCTGCTCTACGGAGACGCCGAGAAGCCGGCGGAGAGCGGCGGGAGCCAACCCCCGCGGGCCGCCGCCCGGAAGGCCGCCTGCGCCTGCGACCAGAAGCCCTGCAGCTGCTCCAAAGTGGATGTCAACTACGCGTTTCTCCATGCAACAGACCTGCTGCCGGCGTGTGATGGAGAAAGGCCCACTTTGGCGTTTCTGCAAGATGTTATGAACATTTTACTTCAGTATGTGGTGAAAAGTTTCGATAGATCAACCAAAGTGATTGATTTCCATTATCCTAATGAGCTTCTCCAAGAATATAATTGGGAATTGGCAGACCAACCACAAAATTTGGAGGAAATTTTGATGCATTGCCAAACAACTCTAAAATATGCAATTAAAACAGGGCATCCTAGATACTTCAATCAACTTTCTACTGGTTTGGATATGGTTGGATTAGCAGCAGACTGGCTGACATCAACAGCAAATACTAACATGTTCACCTATGAAATTGCTCCAGTATTTGTGCTTTTGGAATATGTCACACTAAAGAAAATGAGAGAAATCATTGGCTGGCCAGGGGGCTCTGGCGATGGGATATTTTCTCCCGGTGGCGCCATATCTAACATGTATGCCATGATGATCGCACGCTTTAAGATGTTCCCAGAAGTCAAGGAGAAAGGAATGGCTGCTCTTCCCAGGCTCATTGCCTTCACGTCTGAACATAGTCATTTTTCTCTCAAGAAGGGAGCTGCAGCCTTAGGGATTGGAACAGACAGCGTGATTCTGATTAAATGTGATGAGAGAGGGAAAATGATTCCATCTGATCTTGAAAGAAGGATTCTTGAAGCCAAACAGAAAGGGTTTGTTCCTTTCCTCGTGAGTGCCACAGCTGGAACCACCGTGTACGGAGCATTTGACCCCCTCTTAGCTGTCGCTGACATTTGCAAAAAGTATAAGATCTGGATGCATGTGGATGCAGCTTGGGGTGGGGGATTACTGATGTCCCGAAAACACAAGTGGAAACTGAGTGGCGTGGAGAGGGCCAACTCTGTGACGTGGAATCCACACAAGATGATGGGAGTCCCTTTGCAGTGCTCTGCTCTCCTGGTTAGAGAAGAGGGATTGATGCAGAATTGCAACCAAATGCATGCCTCCTACCTCTTTCAGCAAGATAAACATTATGACCTGTCCTATGACACTGGAGACAAGGCCTTACAGTGCGGACGCCACGTTGATGTTTTTAAACTATGGCTGATGTGGAGGGCAAAGGGGACTACCGGGTTTGAAGCGCATGTTGATAAATGTTTGGAGTTGGCAGAGTATTTATACAACATCATAAAAAACCGAGAAGGATATGAGATGGTGTTTGATGGGAAGCCTCAGCACACAAATGTCTGCTTCTGGTACATTCCTCCAAGCTTGCGTACTCTGGAAGACAATGAAGAGAGAATGAGTCGCCTCTCGAAGGTGGCTCCAGTGATTAAAGCCAGAATGATGGAGTATGGAACCACAATGGTCAGCTACCAACCCTTGGGAGACAAGGTCAATTTCTTCCGCATGGTCATCTCAAACCCAGCGGCAACTCACCAAGACATTGACT TCCTGATTGAAGAAATAGAACGCCTTGGACAAGATTTATAA。