色霉素A2、A3的生物合成及提纯工艺

摘要

本发明公开了一种色霉素A2、A3的生物合成及提取纯化工艺，包括下述步骤：1）SrcmRI基因过表达工程菌SR1的构建；2）SrcmRII基因敲除工程菌SR2的构建；3）SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除工程菌SR3的构建；4）将步骤1）‑3）构建的工程菌在液体培养基中的发酵及产物萃取获得色霉素提取液；5）将步骤1）‑3）构建的工程菌在固体培养基上的培养及产物萃取获得色霉素提取液；6）将步骤4）或步骤5）中的色霉素提取液进行纯化和分析获得最终产物色霉素A2和色霉素A3。本发明通过基因工程菌的构建形成；产量高，副产物少，产物提纯工艺简单；操作过程易控制，无污染，生产成本低。

权利要求

1.一种色霉素A2、A3的生物合成及提纯工艺，其特征在于：其包括下述步骤：

1）SrcmRI基因过表达工程菌SR1的构建；

2）SrcmRII基因敲除工程菌SR2的构建；

3）SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除工程菌SR3的构建；

4）将步骤1）-3）构建的工程菌在液体培养基中的发酵及产物萃取获得色霉素提取液；

5）将步骤1）-3）构建的工程菌在固体培养基上的培养及产物萃取获得色霉素提取液；

6）将步骤4）或步骤5）中的色霉素提取液进行纯化和分析获得最终产物色霉素A2和色霉素A3；

所述步骤1）的具体工程如下：以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组D N A 为 模 板 ，使 用 引 物 1 4 - 2 - S A R P - F - X b a I - N d e I :  5’-AATCTAGAGGAGGAGCCCATATGAGCTCCGACAGCGACTGCA-3’ 和引物14-2-SARP-R-XbaI: 5’-AATCTAGATCAGCCGGCCCGGCGCTGCC-3’，通过聚合酶链式反应扩增激活基因SrcmRI片段，扩增反应的条件为98℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 30秒，30个循环，利用限制性核酸内切酶HindIII和XbaI将上述扩增得到的基因片段连接到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pSET152的XbaI位点，即得所需的SrcmRI基因过表达质粒pZJ183，将该pZJ183质粒通过原生质体转化导入链霉菌roseiscleroticus野生型菌株，即得所需的重组工程菌株SR1；

所述步骤2）的具体工程如下：以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组D N A 为 模板 ，使 用左 臂 引 物 P a d R o u t -l e f t - F - E c o R I :  5’-AAAGAATTCTACTCGCCGGAGTGCGCACGGTCGAA-3’、PadRout-left-R-XbaI:  5’-AAATCTAGACTTCTTCGCGCAGCTTGCGCAGCT-3’和右臂引物PadRout-right-F-XbaI: 5’-AAATCTAGACGTACCGCTGTCGCCGCGAT-3’、PadRout-right-R-HindIII: 5’-AAAAAGCTTATGATCTCGATCATCGAGCG-3’，通过聚合酶链式反应扩增一个包含有无功能∆SrcmRII基因的2.3 kb片段，扩增反应的条件为98℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 100秒，30个循环；将上述扩增得到的片段克隆到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139的EcoRI/HindIII位点，即得所需的SrcmRII基因敲除质粒pZJ196，通过接合作用将基因敲除质粒pZJ196导入到链霉菌roseiscleroticus野生型菌株，将包含基因敲除质粒pZJ196的链霉菌roseiscleroticus菌株在MS固体培养基上28℃下培养20天，再分别挑取单菌落到3 mL的TSBY液体培养基中，在28℃下培养5天，然后取50 μL培养液涂布到ISP4固体培养基上；在37℃下培养5天，长出的菌株即为所需的单交换突变株，将上述筛选得到的单交换突变株接种到不含有安普霉素的TSBY固体培养基上，在28℃下培养3代，然后挑选相同克隆分别接种到含有安普霉素的TSBY固体培养基与不含有安普霉素的TSBY固体培养基上，在37℃下培养5天，筛选出不能在含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长，但能够在不含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长的菌落，即为所需的双交换突变工程菌株SR2。

2.根据权利要求1所述的一种色霉素A2、A3的生物合成及提纯工艺，其特征在于：所述步骤3）的具体工程如下：将步骤1）所得的SrcmRI基因过表达质粒pZJ183通过接合作用导入到步骤2）所得的双交换突变株SR2中，即得所需的同时具有SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除的突变工程菌株SR3。

3. 根据权利要求1所述的一种色霉素A2、A3的生物合成及提纯工艺，其特征在于：所述步骤4）的具体工程如下：将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株、SR1、SR2与SR3分别接种到装有500 mL YEME液体培养基的2 L三角瓶中，在28℃、250 rpm下培养2-5天；将上述液体培养液于3000×g下离心，分离发酵液和菌体细胞；用500 mL乙酸乙酯萃取发酵液，重复萃取三次，菌体细胞用500 mL甲醇萃取三次，合并来源于发酵液和菌体细胞的萃取液，利用旋转蒸发仪进行减压蒸馏浓缩，浓缩后的产物溶解于10 mL甲醇获得色霉素提取液。

4. 根据权利要求1所述的一种色霉素A2、A3的生物合成及提纯工艺，其特征在于：所述步骤5）的具体工程如下：将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株、SR1、SR2与SR3分别接种到YEME固体培养基上，在28℃下培养7天；各取500 g上述固体培养基，捣碎至固形物尺寸小于0.5 cm，然后加入500 mL配比为89:10:1的乙酸乙酯-甲醇-甲酸萃取液，在28℃，200 rpm下震荡30分钟，收集萃取液，再用500 mL乙酸乙酯萃取固体残留物二次，合并萃取液；上述萃取液体在25℃，4000 rpm下离心5分钟，收集上清液，旋转蒸发仪进行减压蒸馏浓缩，浓缩后的产物溶解于3 mL甲醇获得色霉素提取液。

5. 根据权利要求3或者4所述的一种色霉素A2、A3的生物合成及提纯工艺，其特征在于：所述步骤6）的具体工程如下：将步骤4）或步骤5）获得的色霉素提取液在HPLC上用5 μm,

4.6×250 mm的Agilent eclipse plus C18色谱柱分离，用流速为1 mL/min的包含0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱，在45分钟内，乙腈-水的体积比由10:90逐渐提高到90:10，收集25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟的产物流出液，即为分离得到纯的化合物；对上述两个化合物进行核磁共振和质谱分析，证实这两个化合物分别是色霉素A3、色霉素A2。

说明书

色霉素A2、A3的生物合成及提纯工艺

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种色霉素A2、A3的生物合成及提取纯化工艺。

背景技术

[0002] 色霉素(Chromomycin)是一种糖基化聚酮化合物，属于金霉酸家族的成员。色霉素和金霉酸类其它大多数抗生素一样，已被研究证实具有良好的抗细菌、抗真菌以及抗癌活性。通过与位于DNA上富含GC的核苷酸序列相互作用，色霉素能够抑制依赖DNA的RNA聚合酶，并抑制mRNA的合成，从而抑制癌细胞的分裂增殖。特别是对像脑癌、睾丸癌等病毒性肿瘤，色霉素具有显著的抑制效果。此外，近期研究也发现，色霉素能够刺激K562细胞进行红系分化，在神经疗法上能够抑制神经细胞凋亡，并具备抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的抗病毒活性。色霉素原产自灰色链霉菌7号，也是目前工业生产所采用的主要菌种。色霉素A3现已实现商业化生产，而色霉素A2与A4则是其生产过程中的副产物。产量较低、纯度不足是目前色霉素生产的最主要问题，这也导致其售价居高不下。本发明通过过表达激活基因SrcmRI，同时敲除抑制基因SrcmRII构建的工程菌实现色霉素A2、A3的高产，获得产物的纯度相较于传统生产方式更高，并且能够显著降低生产成本。

发明内容

[0003] 本发明为了解决上述现有技术中存在的缺陷和不足，提供了一种基于基因工程菌的色霉素A2、A3的高效生物合成及提取工艺。

[0004] 本发明的技术方案：一种色霉素A2、A3的生物合成及提纯工艺，包括下述步骤：

[0005] (1)SrcmRI基因过表达工程菌SR1的构建

[0006] 以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组DNA为模板，使用引物14-2-SARP-F-XbaI-NdeI:5’-AATCTAGAGGAGGAGCCCATATGAGCTCCGACAGCGACTGCA-3’和引物14-2-SARP-R-XbaI:5’-AATCTAGATCAGCCGGCCCGGCGCTGCC-3’，通过聚合酶链式反应扩增激活基因SrcmRI片段，扩增反应的条件为98℃15秒，60℃15秒，72℃30秒，30个循环，利用限制性核酸内切酶HindIII和XbaI将上述扩增得到的基因片段连接到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pSET152的XbaI位点，即得本发明所需的SrcmRI基因过表达质粒pZJ183。参照《微生物学实验》(第4版)介绍的方法，将该pZJ183质粒通过原生质体转化导入链霉菌roseiscleroticus野生型菌株，即得本发明所需的重组工程菌株SR1。

[0007] (2)SrcmRII基因敲除工程菌SR2的构建

[0008] 以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组DNA为模板，使用左臂引物PadRout-left-F-EcoRI:5’-AAAGAATTCTACTCGCCGGAGTGCGCACGGTCGAA-3’、PadRout-left-R-XbaI:5’-AAATCTAGACTTCTTCGCGCAGCTTGCGCAGCT-3’和右臂引物PadRout-right-F-XbaI:5’-AAATCTAGACGTACCGCTGTCGCCGCGAT-3’、PadRout-right-R-HindIII:5’-AAAAAGCTTATGATCTCGATCATCGAGCG-3’，通过聚合酶链式反应扩增一个包含有无功能ΔSrcmRII基因的2.3kb片段，扩增反应的条件为98℃15秒，60℃15秒，72℃100秒，30个循环。
将上述扩增得到的片段克隆到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139的EcoRI/HindIII位点，即得本发明所需的SrcmRII基因敲除质粒pZJ196。参照《微生物学实验》(第4版)介绍的方法，通过接合作用将基因敲除质粒pZJ196导入到链霉菌roseiscleroticus野生型菌株，将包含基因敲除质粒pZJ196的链霉菌roseiscleroticus菌株在MS固体培养基上28℃下培养
20天，再分别挑取单菌落到3mL的TSBY液体培养基中，在28℃下培养5天，然后取50μL培养液涂布到ISP4固体培养基上。在37℃下培养5天，长出的菌株即为本发明所需的单交换突变株。将上述筛选得到的单交换突变株接种到不含有安普霉素的TSBY固体培养基上，在28℃下培养3代，然后挑选相同克隆分别接种到含有安普霉素的TSBY固体培养基与不含有安普霉素的TSBY固体培养基上，在37℃下培养5天，筛选出不能在含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长，但能够在不含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长的菌落，即为本发明所需的双交换突变工程菌株SR2。

[0009] (3)SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除工程菌SR3的构建

[0010] 将上述SrcmRI基因过表达质粒pZJ183通过接合作用导入到双交换突变株SR2中，即得本发明所需的同时具有SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除的突变工程菌株SR3。

[0011] (4)工程菌在液体培养基中的发酵及产物萃取

[0012] 将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株、SR1、SR2与SR3分别接种到装有500mL YEME液体培养基的2L三角瓶中，在28℃、250rpm下培养2-5天。将上述液体培养液于3000×g下离心，分离发酵液和菌体细胞。用500mL乙酸乙酯萃取发酵液，重复萃取三次，菌体细胞用500mL甲醇萃取三次，合并来源于发酵液和菌体细胞的萃取液，利用旋转蒸发仪进行减压蒸馏浓缩，浓缩后的产物溶解于10mL甲醇。

[0013] (5)工程菌在固体培养基上的培养及产物萃取

[0014] 将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株、SR1、SR2与SR3分别接种到YEME固体培养基上，在28℃下培养7天。各取500g上述固体培养基，捣碎至固形物尺寸小于0.5cm，然后加入500mL乙酸乙酯-甲醇-甲酸(89:10:1)萃取液，在28℃，200rpm下震荡30分钟，收集萃取液，再用500mL乙酸乙酯萃取固体残留物二次，合并萃取液。上述萃取液体在25℃，4000rpm下离心5分钟，收集上清液，旋转蒸发仪进行减压蒸馏浓缩，浓缩后的产物溶解于3mL甲醇。

[0015] (6)色霉素的纯化和分析

[0016] 将上述(5)或(6)中的提取溶液在HPLC上用Agilent eclipse plus C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)分离，用流速为1mL/min的包含0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱，在45分钟内，乙腈-水的体积比由10:90逐渐提高到90:10，收集25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟的产物流出液，即为分离得到纯的化合物；对上述两个化合物进行核磁共振和质谱分析，证实这两个化合物分别是色霉素A3、色霉素A2。

[0017] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

[0018] (1)本发明通过基因工程菌的构建形成一套高产色霉素A2及A3的方法；

[0019] (2)本发明所采用的色霉素生产方法产量高，副产物少，产物提纯工艺简单；

[0020] (3)本发明操作过程易控制，无污染，生产成本低。

附图说明

[0021] 图1为色霉素A2的结构图；

[0022] 图2为色霉素A3的结构图；

[0023] 图3为使用液相色谱纯化色霉素A2及A3的检测结果图；

[0024] 图4为色霉素A2及A3的质谱检测结果图。

具体实施方式

[0025] 下面结合实施例、附图和表格对本发明作进一步详细的说明，但并不是对本发明保护范围的限制。

[0026] 实施例1

[0027] SrcmRI基因过表达工程菌SR1的构建

[0028] 以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组DNA为模板，使用引物14-2-SARP-F-XbaI-NdeI:5’-AATCTAGAGGAGGAGCCCATATGAGCTCCGACAGCGACTGCA-3’和引物14-2-SARP-R-XbaI:5’-AATCTAGATCAGCCGGCCCGGCGCTGCC-3’，通过聚合酶链式反应扩增激活基因SrcmRI片段，扩增反应的条件为98℃15秒，60℃15秒，72℃30秒，30个循环，利用限制性核酸内切酶HindIII和XbaI将上述扩增得到的基因片段连接到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pSET152的XbaI位点，即得本发明所需的SrcmRI基因过表达质粒pZJ183。参照《微生物学实验》(第4版)介绍的方法，将该pZJ183质粒通过原生质体转化导入链霉菌roseiscleroticus野生型菌株，即得本发明所需的重组工程菌株SR1。

[0029] 上述链霉菌roseiscleroticus野生型菌株购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，编号为ATCC 53903。pSET152质粒载体购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；DNA聚合酶、限制性核酸内切酶HindIII和XbaI购自宝生物工程(大连)有限公司；引物14-2-SARP-F-XbaI-NdeI和14-2-SARP-R-XbaI订购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

[0030] 实施例2

[0031] SrcmRII基因敲除工程菌SR2的构建

[0032] 以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组DNA为模板，使用左臂引物PadRout-left-F-EcoRI:5’-AAAGAATTCTACTCGCCGGAGTGCGCACGGTCGAA-3’、PadRout-left-R-XbaI:5’-AAATCTAGACTTCTTCGCGCAGCTTGCGCAGCT-3’和右臂引物PadRout-right-F-XbaI:5’-AAATCTAGACGTACCGCTGTCGCCGCGAT-3’、PadRout-right-R-HindIII:5’-AAAAAGCTTATGATCTCGATCATCGAGCG-3’，通过聚合酶链式反应扩增一个包含有无功能ΔSrcmRII基因的2.3kb片段，扩增反应的条件为98℃15秒，60℃15秒，72℃100秒，30个循环。
参照《微生物学实验》(第4版)介绍的方法，通过接合作用将基因敲除质粒pZJ196导入到链霉菌roseiscleroticus野生型菌株，将包含基因敲除质粒pZJ196的链霉菌
roseiscleroticus菌株在MS固体培养基上培养20天，再分别挑取单菌落到3mL的TSBY液体培养基中，在28℃下培养5天，然后取50μL培养液涂布到ISP4固体培养基上。在37℃下培养5天，长出的菌株即为本发明所需的单交换突变株。将上述筛选得到的单交换突变株接种到不含有安普霉素的TSBY固体培养基上，在28℃下培养3代，然后挑选相同克隆分别接种到含有安普霉素的TSBY固体培养基与不含有安普霉素的TSBY固体培养基上，在37℃下培养5天，筛选出不能在含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长，但能够在不含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长的菌落，即为本发明所需的双交换突变工程菌株SR2。

[0033] 所述MS固体培养基中各组分用量占MS固体培养基质量用量的百分比分别为：硝酸钾0.19％；硝酸铵0.165％；磷酸二氢钾0.017％；七水硫酸镁0.037％；二水氯化钙0.044％；碘化钾0.000083％；硼酸0.00062％；四水硫酸锰0.00223％；七水硫酸锌0.00086％；二水钼酸钠0.000025％；五水硫酸铜0.0000025％；氯化钴0.0000025％；乙二胺四乙酸二钠
0.00373％；七水硫酸亚铁0.00278％；肌醇0.01％；甘氨酸0.0002％；盐酸硫胺素
0.00001％；盐酸吡哆醇0.00005％；烟酸0.00005％；蔗糖3％；琼脂0.7％；灭菌；所述TSBY液体培养基中各组分用量占TSBY培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨1.5％；大豆蛋白胨0.5％；氯化钠0.5％；pH 7.2；根据所需灭菌后添加安普霉素50μg/mL；所述TSBY固体培养基中各组分用量占TSBY培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨1.5％；大豆蛋白胨
0.5％；氯化钠0.5％；琼脂2％；pH 7.2；根据所需灭菌后添加安普霉素50μg/mL；所述ISP4固体培养基中各组分用量占ISP4固体培养基质量用量的百分比分别为：可溶性淀粉1％；磷酸氢二钾0.1％；七水硫酸镁0.1％；氯化钠0.1％；硫酸铵0.2％；碳酸钙0.2％；七水硫酸亚铁
0.0001％；七水氯化锰0.0001％；琼脂2％；灭菌后添加安普霉素50μg/mL；

[0034] 上述pKC1139质粒载体购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；DNA聚合酶、限制性核酸内切酶HindIII和XbaI购自宝生物工程(大连)有限公司；引物PadRout-left-F-EcoRI，PadRout-left-R-XbaI，PadRout-right-F-XbaI和PadRout-right-R-HindIII订购自生工生物工程(上海)股份有限公司。上述的配制培养基所用的化学试剂购自杭州华东医药集团有限公司，生化试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

[0035] 实施例3

[0036] SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除工程菌SR3的构建

[0037] 将上述SrcmRI基因过表达质粒pZJ183通过接合作用导入到双交换突变株SR2中，即得本发明所需的同时具有SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除的突变工程菌株SR3。

[0038] 实施例4

[0039] 工程菌SR3在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0040] 将SR3接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养2天。取500mL的上述液体培养液于3000×g下离心，分离发酵液和菌体细胞。用等量乙酸乙酯进行3小时的发酵液萃取，重复操作三次，菌体细胞用500mL甲醇萃取三次，合并来源于发酵液和菌体细胞的萃取液，利用旋转蒸发仪进行减压蒸馏浓缩，浓缩后的产物溶解于10mL甲醇。

[0041] 将上述溶液在HPLC上用Agilent eclipse plus C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)分离，用流速为1mL/min的包含0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱，在45分钟内，乙腈-水的体积比由10:90逐渐提高到90:10，收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到110.2mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到137.5mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2；色霉素A2及A3的结构如图1所示；色霉素A2及A3的核磁共振数据如表1所示；使用液相色谱纯化目标化合物过程的检测结果如图2所示；色霉素A2及A3的质谱检测结果如图3所示。

[0042] 所述YEME液体培养基中各组分用量分别是：(以总体积1L为例)酵母提取物3g；细菌蛋白胨5g；麦芽浸粉3g；葡萄糖10g；蔗糖340g；灭菌。

[0043] 上述的配制培养基所用的化学试剂购自杭州华东医药集团有限公司，生化试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

[0044] 实施例5

[0045] 工程菌SR3在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0046] 将SR3接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养3天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到144.8mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到158.3mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0047] 实施例6

[0048] 工程菌SR3在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0049] 将SR3接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养4天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到145.1mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到156.1mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0050] 实施例7

[0051] 工程菌SR3在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0052] 将SR3接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养5天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到142.2mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到157.1mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0053] 实施例8

[0054] 工程菌SR2在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0055] 将SR2接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养2天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到87.2mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到90.3mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0056] 实施例9

[0057] 工程菌SR2在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0058] 将SR2接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养3天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到101.3mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到108.2mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0059] 实施例10

[0060] 工程菌SR2在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0061] 将SR2接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养4天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到98.8mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到107.9mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0062] 实施例11

[0063] 工程菌SR2在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0064] 将SR2接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养5天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到100.3mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到108.6mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0065] 实施例12

[0066] 工程菌SR1在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0067] 将SR1接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养2天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到19.6mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到20.3mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0068] 实施例13

[0069] 工程菌SR1在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0070] 将SR1接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养3天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到33.1mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到35.9mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0071] 实施例14

[0072] 工程菌SR1在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0073] 将SR1接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养4天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到32.6mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到35.4mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0074] 实施例15

[0075] 工程菌SR1在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0076] 将SR1接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养5天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到33.4mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到36.2mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0077] 实施例16

[0078] 野生型菌株在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0079] 将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养2天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟流出液，最终未从链霉菌roseiscleroticus野生型菌株的液体培养物中得到色霉素A3或A2。

[0080] 实施例17

[0081] 野生型菌株在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0082] 将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养3天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟流出液，最终未从链霉菌roseiscleroticus野生型菌株的液体培养物中得到色霉素A3或A2。

[0083] 实施例18

[0084] 野生型菌株在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0085] 将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养4天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟流出液，最终未从链霉菌roseiscleroticus野生型菌株的液体培养物中得到色霉素A3或A2。

[0086] 实施例19

[0087] 野生型菌株在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析

[0088] 将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中，在28℃、250rpm下培养5天。发酵液提取、纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟流出液，最终未从链霉菌roseiscleroticus野生型菌株的液体培养物中得到色霉素A3或A2。

[0089] 实施例20

[0090] 工程菌SR3在固体培养基上培养及产物萃取、纯化和分析

[0091] 将SR3接种到YEME固体培养基上，在28℃下培养7天。各取500g上述固体培养基，捣碎至固形物尺寸小于0.5cm，然后加入500mL乙酸乙酯-甲醇-甲酸(89:10:1)萃取液，在28℃，200rpm下震荡30分钟，收集萃取液，再用500mL乙酸乙酯萃取固体残留物二次，合并萃取液。上述萃取液体在25℃，4000rpm下离心5分钟，收集上清液，旋转蒸发仪进行减压蒸馏浓缩，浓缩后的产物溶解于3mL甲醇。纯化操作同实施例5；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR3的固体培养物中分离得到198.3mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR3的固体培养物中分离得到231.8mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0092] 所述YEME固体液体培养基中各组分用量分别是：(以总体积1L为例)酵母提取物3g；细菌蛋白胨5g；麦芽浸粉3g；葡萄糖10g；蔗糖340g；琼脂20g；灭菌。

[0093] 实施例21

[0094] 工程菌SR2在固体培养基上培养及产物萃取、纯化和分析

[0095] 将SR2接种到YEME固体培养基上，在28℃下培养7天。萃取操作同实施例20，纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR2的固体培养物中分离得到218.6mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR2的培养物中分离得到122.5mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0096] 实施例22

[0097] 工程菌SR1在固体培养基上培养及产物萃取、纯化和分析

[0098] 将SR1接种到YEME固体培养基上，在28℃下培养7天。萃取操作同实施例20，纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟流出液，最终从工程菌SR1的固体培养物中分离得到43.9mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A3；
收集在29.4-30.3分钟流出液，最终从工程菌SR1的培养物中分离得到44.4mg/L纯的化合物；对该化合物进行了核磁共振和质谱分析，证明该化合物是色霉素A2。

[0099] 实施例23

[0100] 野生型菌株在固体培养基上培养及产物萃取、纯化和分析

[0101] 将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株接种到YEME固体培养基上，在28℃下培养7天。萃取操作同实施例20，纯化操作同实施例4；收集在25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟的流出液，最终未从链霉菌roseiscleroticus野生型菌株的固体培养物中分离得到色霉素A3或A2。

[0102] 附表1：色霉素A2、A3的1H NMR数据(300MHz)

[0103]

[0104]

[0105]

[0106]