光刺激装置以及光刺激方法

摘要

光刺激装置具备：物镜，与生物体对象物相对地配置；光源，输出经由物镜而被照射于生物体对象物的光；形状取得部，取得与生物体对象物中的伴有折射率差的形状相关的信息；全息图制作部，基于在形状取得部中取得的信息，制作用于修正起因于伴有折射率差的形状的像差的像差修正全息数据；空间光调制器，呈现基于像差修正全息数据的全息图并调制从光源输出的光。

权利要求

1.一种光刺激装置，其特征在于：

是通过照射光来刺激生物体对象物的光刺激装置，具备：

物镜，与所述生物体对象物相对地配置；

光源，输出经由所述物镜而被照射于所述生物体对象物的光；

形状取得部，取得与所述生物体对象物中的伴有折射率差的形状相关的信息；

全息图制作部，基于所述取得的信息，制作用于修正起因于伴有所述折射率差的形状的像差的像差修正全息数据；以及空间光调制器，呈现基于所述像差修正全息数据的全息图并调制从所述光源输出的光。

2.如权利要求1所述的光刺激装置，其特征在于：伴有所述折射率差的形状包含所述生物体对象物的表面形状。

3.如权利要求1或者2所述的光刺激装置，其特征在于：伴有所述折射率差的形状包含所述生物体对象物的表面正下方的结构。

4.如权利要求1或者2所述的光刺激装置，其特征在于：为了制作所述像差修正全息数据，所述全息图制作部基于所述信息来进行使用了几何光学、波动光学或者电磁场解析的波阵面计算。

5.如权利要求3所述的光刺激装置，其特征在于：为了制作所述像差修正全息数据，所述全息图制作部基于所述信息来进行使用了几何光学、波动光学或者电磁场解析的波阵面计算。

6.一种光刺激方法，其特征在于：

是通过照射光来刺激生物体对象物的光刺激方法，包含：

取得与所述生物体对象物中的伴有折射率差的形状相关的信息的步骤，所述生物体对象物与物镜相对；

基于所述取得的信息，制作用于修正起因于伴有所述折射率差的形状的像差的像差修正全息数据的步骤；以及将基于所述像差修正全息数据的全息图呈现于空间光调制器，由所述空间光调制器调制从光源输出的光，并向所述生物体对象物照射调制后的光。

7.如权利要求6所述的光刺激方法，其特征在于：伴有所述折射率差的形状包含所述生物体对象物的表面形状。

8.如权利要求6或者7所述的光刺激方法，其特征在于：伴有所述折射率差的形状包含所述生物体对象物的表面正下方的结构。

9.如权利要求6或者7所述的光刺激方法，其特征在于：在制作所述像差修正全息数据的步骤中，为了制作所述像差修正全息数据，基于所述信息来进行使用了几何光学、波动光学或者电磁场解析的波阵面计算。

10.如权利要求8所述的光刺激方法，其特征在于：在制作所述像差修正全息数据的步骤中，为了制作所述像差修正全息数据，基于所述信息来进行使用了几何光学、波动光学或者电磁场解析的波阵面计算。

说明书

光刺激装置以及光刺激方法

技术领域

[0001] 本发明涉及光刺激装置以及光刺激方法。

背景技术

[0002] 非专利文献1公开了通过将特定的波长的光刺激给予使由来于绿藻类的感光性的离子通道蛋白质即光敏感通道(ChR2)或嗜盐菌紫质(NpHR)表现出的哺乳类的神经细胞等，从而控制神经细胞的钠离子或氯离子的通道的开闭。

[0003] 现有技术文献

[0004] 非专利文献

[0005] 非专利文献1：E.S.Boyden  et  al.“Millisecond-timescale,geneticallytargetedoptical control of neural activity”,Nature Neuroscience,
1263-8,(2005)

发明内容

[0006] 发明所要解决的技术问题

[0007] 近年来，通过进行相对于哺乳类、其他动物、植物等生物体对象物的光刺激从而进行神经回路等内部器官的功能的调查或者使功能的获得或欠缺发生的光遗传学(optogenetics)正在被研究。光遗传学中的光刺激有必要在生物体内的所希望的位置上以毫秒级的时间精度来进行控制。

[0008] 然而，在多数情况下，生物体对象物的表面不是平坦的。因此，起因于生物体对象物的表面形状的像差会产生。另外，生物体对象物由血管及细胞组织等构成。因此，在生物体对象物，存在红血球或脂质之类的折射率分别不同的物质。因此，在生物体对象物的内部产生像差。这样，起因于生物体对象物中的伴有折射率差的形状，会产生像差。如果照射光受到这样的像差的影响的话，则照射光的聚光强度在生物体对象物内部的所希望的照射位置上变弱，或者聚光范围扩大。因此，产生限定在所希望的照射位置来进行光刺激变得困难等问题。

[0009] 本发明的一个方面是鉴于这样的问题而完成的发明，其目的在于，提供一种能够抑制生物体对象物的内部的照射光的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大的光刺激装置以及光刺激方法。

[0010] 解决问题的技术手段

[0011] 为了解决上述的问题，本发明的一个方面的光刺激装置，是通过照射光来刺激生物体对象物的装置，具备：物镜，与生物体对象物相对地配置；光源，输出经由物镜而被照射于生物体对象物的光；形状取得部，取得与生物体对象物中的伴有折射率差的形状相关的信息；全息图制作部，基于在形状取得部中取得的信息，制作用于修正起因于伴有折射率差的形状的像差的像差修正全息数据；空间光调制器，呈现基于像差修正全息数据的全息图并调制从光源输出的光。

[0012] 另外，本发明的一个方面的光刺激方法，是通过照射光来刺激生物体对象物的方法，包含：取得与生物体对象物中的伴有折射率差的形状相关的信息的步骤(形状取得步骤)，生物体对象物与物镜相对；基于在形状取得步骤中取得的信息，制作用于修正起因于伴有折射率差的形状的像差的像差修正全息数据的步骤(全息图制作步骤)；将基于像差修正全息数据的全息图呈现于空间光调制器，由空间光调制器调制从光源输出的光，并向生物体对象物照射调制后的光的步骤(光照射步骤)。

[0013] 在上述的光刺激装置以及光刺激方法中，取得与生物体对象物中的伴有折射率差的形状(例如表面形状或表面正下方的结构)相关的信息。然后，基于该信息，生成用于修正像差的像差修正全息数据。另外，由基于该数据的全息图调制照射光。由此，因为起因于生物体对象物中的伴有折射率差的形状的像差被适宜地修正，所以能够抑制生物体对象物的内部的照射光的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。

[0014] 另外，上述的光刺激装置以及光刺激方法中，伴有折射率差的形状也可以包含生物体对象物的表面形状。根据上述的光刺激装置以及光刺激方法，例如在这样的情况下，能够适宜地抑制生物体对象物的内部的照射光的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。

[0015] 另外，上述的光刺激装置以及光刺激方法中，伴有折射率差的形状也可以包含生物体对象物的表面正下方的结构。根据上述的光刺激装置以及光刺激方法，例如在这样的情况下，能够适宜地抑制生物体对象物的内部的照射光的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。

[0016] 另外，上述的光刺激装置中，全息图制作部也可以为了制作像差修正全息数据，基于信息，进行使用了几何光学、波动光学或者电磁场解析的波阵面计算。同样的，上述的光刺激方法中，也可以在全息图制作步骤中，基于信息，进行使用了几何光学、波动光学或者电磁场解析的波阵面计算，从而制作像差修正全息数据。

[0017] 发明的效果

[0018] 根据本发明的一个方面的光刺激装置以及光刺激方法，能够抑制生物体对象物的内部的照射光的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。

附图说明

[0019] 图1是表示第1实施方式所涉及的光刺激装置的结构的图。

[0020] 图2是表示光刺激装置的动作的流程图。

[0021] 图3是概略地表示像差的产生的情况的图。

[0022] 图4概念性地表示在没有被像差修正的平面波即照射光被物镜聚光的时候生物体对象物与其外侧的边界从相对于光轴垂直的平面倾斜的时候的照射光的情况。

[0023] 图5是用于说明计算光线集中于光轴上的任意的点的那样的波阵面的方法的图。

[0024] 图6概略地表示存在2个折射率的边界的情况。

[0025] 图7是表示使用反向传播解析求得的波阵面的图，通过浓淡表示相位。

[0026] 图8是从侧方看生物体对象物的图，并且概念性地表示照射光通过包含折射率互相不同的介质的内部结构并被聚光的情况。

[0027] 图9是表示第2实施方式的光刺激装置的结构的图。

[0028] 图10是表示光刺激装置的动作的流程图。

[0029] 图11是用于说明第1变形例的动作的图，并且是从光轴方向看生物体对象物的表面的图。

[0030] 图12是表示第1变形例的扫描的情况的图。

[0031] 图13是表示第2变形例所涉及的光刺激装置的结构的图。

[0032] 图14是表示第4变形例所涉及的光刺激装置的结构的图。

[0033] 图15是表示第5变形例所涉及的光刺激装置的照射光学单元以及形状测量单元的结构的图。

[0034] 图16是表示第6变形例所涉及的光刺激装置的结构的图。

具体实施方式

[0035] 以下，参照附图，对本发明的一个方面的光刺激装置以及光刺激方法的实施方式进行详细的说明。还有，在附图的说明中，将相同符号标注于相同要素，省略重复的说明。

[0036] (第1实施方式)

[0037] 图1是表示本发明的一个方面的一个实施方式所涉及的光刺激装置1A的结构的图。光刺激装置1A是用于通过照射光来刺激生物体对象物B的装置。如图1所示，光刺激装置1A具备照射光学单元10、形状测量单元20、照射光生成单元30以及控制单元40。

[0038] 照射光学单元10将来自后面所述的形状测量单元20以及照射光生成单元30的光照射于生物体对象物B并且向形状测量单元20输出来自生物体对象物B的光。照射光学单元10具有生物体对象物台11、物镜12、物镜移动机构13、分束器14以及反射镜15。

[0039] 生物体对象物台11是用于支撑生物体对象物B(或者容纳生物体对象物B的容器)的板状的构件。生物体对象物台11例如由透过照射光L1的材质构成，例如由玻璃或塑料等构成。例如，生物体对象物台11是载玻片、底皿(bottom dish)、微板(microplate)等。在本实施方式中，照射光L1被照射于生物体对象物台11的背面，并透过生物体对象物台11而被照射于生物体对象物B。

[0040] 物镜12以与生物体对象物B相对的方式被配置，并将照射光L1聚光于生物体对象物B的内部。还有，在下述的照射光生成单元30中观察来自生物体对象物B的光(例如荧光、高次谐波产生、反射光、透过光等。以下，称为被检测光)的情况下，也可以分别设置用于照射光L1的物镜和用于被检测光的物镜。例如，也可以为了照射光L1而使用数值孔径(NA)高的物镜并通过像差修正而被局部地聚光。另外，也可以为了被检测光而使用瞳孔大的物镜并取出更多的光。也可以以夹着生物体对象物B的方式配置用于照射光L1的物镜和用于被检测光的物镜，并将照射光L1的生物体对象物B中的透过光作为被检测光来取得。

[0041] 物镜移动机构13是用于在照射光L1的光轴方向上使物镜12移动的机构。物镜移动机构13例如由步进马达或者压电致动器等构成。

[0042] 分束器14对与照射光生成单元30之间的光路、以及与形状测量单元20之间的光路进行分割以及合成。具体来说，分束器14朝向物镜12反射从照射光生成单元30到达照射光学单元10的照射光L1。另外，分束器14透过来自形状测量单元20的光L32以及生物体对象物B中的光L32的反射光。分束器14例如可以由半反半透镜或分色镜构成。还有，反射镜15为了变更光L32的光轴方向而根据需要进行配置。

[0043] 形状测量单元20是本实施方式中的形状取得部。形状测量单元20包含检测器24，与物镜12光学结合。形状测量单元20取得与生物体对象物B的表面形状(伴随于生物体对象物B和周围(空气)所产生的折射率差的形状)相关的信息来作为与伴有生物体对象物B的折射率分布的形状相关的信息。形状测量单元20例如也可以是使用了迈克尔逊干涉仪的测量生物体对象物B的表面形状的干涉光测量单元。在此情况下，形状测量单元20如图1所示具有相干光源21、分束器22、参照光用镜23以及检测器24。

[0044] 相干光源21产生被照射于生物体对象物B的相干光L3。相干光源21例如可以由半导体激光元件构成。

[0045] 分束器22将来自相干光源21的相干光L3分支成参照光L31和朝着照射光学单元10的光L32。另外，分束器22使在参照光用镜23上反射的参照光L31反射并且使光L32的来自生物体对象物B表面的反射光透过。由此，分束器22合成这些光而生成干涉光L4。干涉光L4被输入到检测器24。还有，参照光用镜23既可以构成为能够相对于参照光L31的光轴方向移动，也可以被固定。

[0046] 检测器24检测由分束器22合成的干涉光L4，并输出检测信号S1。检测器24例如包含CCD图像传感器或CMOS图像传感器等二维光检测元件。

[0047] 还有，形状测量单元并不限于本实施方式的结构。例如，形状测量单元也可以具有Mirau型以及Riniku型等干涉测量方式。或者，形状测量单元可以具有共焦反射显微镜(confocal reflectance microscopy)，也可以具有共光路径干涉仪(common path interferometer)。根据这样的显微镜，能够使用对焦信息来适宜地测量生物体对象物B的表面形状。另外，形状测量单元也可以是使用瞬逝光(evanescent light)的单元。由此，生物体对象物B是否接地到生物体对象物台11这类的形状把握变得容易。

[0048] 照射光生成单元30生成被照射于生物体对象物B的照射光L1。本实施方式的照射光生成单元30具有激光光源31、光束扩展器32、空间光调制器(Spatial Light Modulator：SLM)33以及光扫描器35。

[0049] 激光光源31为本实施方式中的光照射部，相对于生物体对象物B，经由物镜12而照射光L5。激光光源31为输出经由物镜12而被照射于生物体对象物B的光L5的光源。激光光源31与物镜12光学结合。光L5例如是包含应该照射于生物体对象物B的波长的光的激光。激光光源31例如包含半导体激光元件来构成。光束扩展器32例如包含被排列配置于光L5的光轴上的多个透镜32a,32b来构成，调整相对于光L5的光轴垂直的截面的大小。

[0050] 空间光调制器33与激光光源31光学结合。空间光调制器33呈现包含用于修正起因于生物体对象物B的表面形状的像差的像差修正全息图的全息图。空间光调制器33通过调制来自激光光源31的光L5从而生成向生物体对象物B照射的照射光L1。还有，生物体对象物B的表面形状由上述的形状测量单元20测量。空间光调制器33可以是相位调制型，也可以是振幅(强度)调制型。另外，空间光调制器33也可以是反射型以及透过型中的任一种。还有，关于像差修正全息图的详细情况，在后面叙述。

[0051] 光扫描器35通过在垂直于照射光L1的光轴的面内使照射光L1的光轴移动从而扫描生物体对象物B上的照射光L1的照射位置。光扫描器35例如由检流计反射镜(galvanometer mirror)、共振镜、MEMS镜或者多棱镜(polygon mirror)构成。

[0052] 还有，本实施方式的照射光生成单元30除了上述的结构之外，还具有镜39a。镜39a为了使光扫描器35与照射光学单元10的分束器14光学结合而使照射光L1的光轴弯曲。另外，照射光生成单元30具备用于检测来自生物体对象物B的被检测光并制作图像的结构(光检测器等)。

[0053] 在物镜12与空间光调制器33的距离较长的情况下，也可以将至少一个4f光学系统设置于照射光L1以及被检测光L2的光轴上。作为一个例子，在图1中表示2个4f光学系统51以及52。4f光学系统51以及52具有向物镜12的后侧焦点传输在空间光调制器33中生成的照射光L1的波阵面的作用。还有，4f光学系统也可以包含远心中继光学系统。另外，在物镜12和空间光调制器33极为接近的情况下，也可以省去4f光学系统。

[0054] 控制单元40包含处理器(control processor)。控制单元40控制照射光学单元10、形状测量单元20以及照射光生成单元30。例如，控制单元40在照射光学单元10中使用物镜移动机构13来控制物镜12的光轴方向的位置。另外，控制单元40在与光轴方向交叉的方向上使支撑生物体对象物B的生物体对象物台11移动。另外，控制单元40进行形状测量单元20的相干光源21、检测器24以及参照光用镜23的控制。再有，控制单元40控制照射光生成单元30的激光光源31、空间光调制器33以及光扫描器35。本实施方式的控制单元40包含鼠标或键盘等的输入装置41以及计算机43来构成。

[0055] 另外，控制单元40构成本实施方式中的形状取得部的一部分。控制单元40与形状测量单元20的检测器24电性结合。控制单元40输入从形状测量单元20的检测器24输出的检测信号S1。控制单元40基于该检测信号S1使用运用了傅立叶变换的方法或λ/4相移干涉法，取得与生物体对象物B的表面形状相关的信息。另外，控制单元40为本实施方式中的全息图制作部。控制单元40基于所获得的信息，制作用于修正起因于生物体对象物B的表面形状的像差的像差修正全息数据。像差修正全息数据被提供给空间光调制器33。还有，控制单元40可以用相同的处理器来实现控制各个单元的功能、作为形状取得部的功能以及作为全息图制作部的功能，也可以用不同的处理器来实现。

[0056] 图2是表示上述的光刺激装置1A的动作的流程图。参照图2，对本实施方式的光刺激方法进行说明。

[0057] 首先，将生物体对象物B载置于生物体对象物台11上。接着，从形状测量单元20的光源21输出光L3，在检测器24中检测来自生物体对象物B表面的反射光与参照光L31的干涉光L4。由此，观测生物体对象物B表面上的干涉条纹。然后，基于该干涉条纹，在控制单元40中，取得与生物体对象物B的表面形状相关的信息(形状取得步骤S11)。

[0058] 接着，基于在形状取得步骤S11中取得的信息，由控制单元40制作用于修正起因于生物体对象物B的表面形状的像差的像差修正全息数据(全息图制作步骤S12)。接着，基于像差修正全息数据的全息图被呈现于空间光调制器33。然后，由空间光调制器33调制从激光光源31输出的光L5，并向生物体对象物B照射调制后的照射光L1(光照射步骤S13)。还有，在本实施方式中，一边由光扫描器35扫描照射光L1一边反复进行光照射步骤S13。

[0059] 对由具备上述的结构的本实施方式的光刺激装置1A以及光刺激方法获得的效果进行说明。在多数情况下，生物体对象物B的表面不是平坦的。因此，起因于生物体对象物B的表面形状的像差会产生。如果物镜12的数值孔径(NA)小或者是生物体对象物B的浅的位置的观察，则其影响小，但在数值孔径(NA)大或者深的位置的观察时不能够无视像差的影响。于是，如果照射光L1受到这样的像差的影响，则照射光L1的聚光强度在生物体对象物B内部的所希望的照射位置变弱，或者聚光范围扩大。因此，产生限定于所希望的照射位置来进行光刺激变得困难等的问题。

[0060] 图3是概略地表示像差的产生的情况的图。在图3中，曲线B1表示生物体对象物B的表面、即生物体对象物B与其外侧的边界。还有，将生物体对象物B的外部的折射率设定为n1，将生物体B的内部的折射率设定为n2(≠n1)。照射光L1由物镜12而被聚光于生物体对象物B的内部(表面正下方)。此时，照射光L1中通过物镜12的光轴A2附近的光L11基本上不受到生物体对象物B的表面形状的影响，并且朝向聚光点C直进。另一方面，照射光L1中通过从物镜12的光轴A2分开的位置的光L12会受到生物体对象物B的表面形状的影响而折射，并从聚光点C脱离。由这样的现象，照射光L1的聚光强度在生物体对象物B内部变弱，聚光像D会扩大。

[0061] 在本实施方式的光刺激装置1A以及光刺激方法中，取得与生物体对象物B的表面形状相关的信息。然后，基于该信息，生成用于修正像差的像差修正全息数据。另外，由基于该数据的全息图调制照射光L1。由此，因为起因于生物体对象物B的表面形状的像差被适宜地修正，所以能够抑制生物体对象物B的内部的照射光L1的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。

[0062] 另外，如本实施方式那样，在形状测量单元20以及形状取得步骤中取得的与伴有折射率差的形状相关的信息也可以包含生物体对象物B的表面形状。根据上述的光刺激装置1A以及光刺激方法，例如在这样的情况下，能够适宜地抑制生物体对象物B的内部的照射光L1的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。

[0063] 在此，对像差修正全息图的设计方法的细节进行叙述。图4概念性地表示在没有被像差修正的平面波即照射光L6被物镜12聚光的时候，生物体对象物B与其外侧的边界B1从相对于光轴A2垂直的平面H仅倾斜角度α的时候的照射光L6的情况。在此，图中的光线L6a、L6b是通过了物镜12的中心附近的光线，并且称为近轴光线。另外，图中的光线L6c、L6d是通过了物镜12的边缘附近的光线，并且称为外周部光线。

[0064] 在光线通过生物体对象物B与其外侧的边界的时候，根据由下述式(1)进行表示的斯涅尔定律，求得光线的向边界B1的入射角θ1以及出射角θ2的关系。

[0065] [数1]

[0066] n1sin(θ1±α)＝n2sin(θ2±α)···(1)

[0067] 关于近轴光线，因为入射角小，所以入射角以及出射角的变化量小。另一方面，关于外周部光线，因为入射角大，所以入射角以及出射角的变化量大。另外，因为边界B1相对于垂直于光轴A2的面倾斜，所以近轴光线以及外周部光线在光轴上不重叠。由此，产生各种像差，作为结果，聚光像成为与衍射极限像不同的失真像。

[0068] 图5是用于说明计算光线集中于光轴A2上的任意的点O’的那样的波阵面的方法的图。圆弧Q,Q’为平面波通过了焦点距离f的物镜12之后的波阵面，例如是半径一定的球冠。在假设生物体对象物B不存在的情况下，如以图中的两点划线所示的那样，照射光L6A聚光于光轴A2上的别的点O。在此，线段OQ(或者OQ’)与线段OT所成的角θmax如下述式(2)所示。其中，NA为物镜12的数值孔径。另外，T为圆弧Q,Q’与光轴A2的交点。

[0069] [数2]

[0070] θmax＝sin-1(NA/n1)···(2)

[0071] 照射光L6A的光线从纸面的左侧输入到物镜12，并作为收敛光向纸面的右侧行进。将该方向定义为正的传播方向，例如通过反向传播求得从点O’经边界B1上的点V而到达圆弧QQ’上的点W的光路。在本实施方式中，例如使用以下所说明的逆光线跟踪、波阵面传播以及电磁场解析等的方法，由反向传播求得上述光路。

[0072] ＜逆光线跟踪＞

[0073] 在本实施方式中，在光路计算的前阶段，进行使用了干涉测量的生物体对象物B的结构把握。因此，从生物体对象物B的结构推定生物体对象物B内的折射率分布，并求得折射率的边界B1。通过对该折射率的边界B1进行多项式近似或者地图化从而能够对位置进行特定。

[0074] 接着，决定光线从点O’经折射率的边界B1上的点V而到达至圆弧QQ’上的点W的路径以及光路长。如果使来自点O’的光线反向传播的话，则到达折射率的边界B1上的点V。点V由上述的多项式近似等求得。光线由边界B1的前后的折射率差，根据斯涅尔定律在点V进行折射。在本实施方式中，因为设想不均匀(具有不规则的凹凸)的边界B1，所以应用下述式(3)所示的那样的使用了向量和外积的三维的斯涅尔定律。

[0075] [数3]

[0076] n1·m×VW＝n2·m×O′V···(3)

[0077] 其中，数式(3)中的×表示外积。另外，在数式(3)中，m为点V上的法线向量，VW、O’V分别为边界通过后、通过前的方向向量。折射后，再次使光线反向传播并向圆弧QQ’上的点W传播。这样，查寻从点O’到点W的光路，计算光路长L。光路长L例如由下述式(4)求得。

[0078] [数4]

[0079] L＝n1|VW|+n2|O′V|···(4)

[0080] 相对于多个光线进行上述的计算，求得到达球冠的光线全部的光路长。从这些光路长经光路差求得相位差，消除该相位差的那样的图案成为像差修正图案即像差修正全息数据。还有，实际上，因为折射率的边界B1存在有多个，所以也可以在每个折射率的边界B1进行折射并使光线跟踪。此时，变更数式(4)。

[0081] ＜波阵面传播＞

[0082] 使用菲涅耳衍射或菲涅耳-基尔霍夫的衍射等，从聚光预定位置(点O’)渐渐地向物镜12反向传播。此时，将折射率的边界B1加到传播来进行计算。该方法也可以与上述的逆光线跟踪或者后面所述的电磁场解析组合。例如，也可以相对于除了折射率的边界B1的部分进行逆光线跟踪，相对于包含折射率的边界B1的部分进行波阵面传播。由此，能够减轻计算负担。

[0083] ＜电磁场解析＞

[0084] 使用FDTD(Finite-Difference Time-Domain(时域有限差分))法或RCWA(Rigorous Coupled-Wave Analysis(严格耦合波分析))法，从想聚光的点O’向物镜12侧进行解析。此时，将折射率的边界B1加到边界条件。该方法也可以与上述的逆光线跟踪或者波阵面传播组合。

[0085] 上述的各个方法所进行的反向传播解析即使是存在2个折射率的边界的情况也能够适用。图6概略地表示2个折射率的边界B2,B3存在的情况。使边界B2相对于光轴垂直。另外，将垂直于光轴A2的面H与边界B3所成的角设定为α。将边界B2的外侧的折射率设定为n1，将边界B2与边界B3之间的折射率设定为n2，将边界B3的内侧的折射率设定为n3。

[0086] 图7(a)以及图7(b)是表示在这样的情况下使用反向传播解析求得的波阵面的图，通过浓淡表示相位。还有，图7使用相位折叠等的技术来表现。图7(a)表示作为α＝0°求得的波阵面。另外，图7(b)表示作为α＝0.3°求得的波阵面。还有，在这些波阵面的计算中设定n1＝1、n2＝1.33、n3＝1.38。在此情况下，n1模拟空气，n2模拟水，n3模拟细胞。在n1与n2的边界B2上存在盖玻片，但是使盖玻片所引起的像差被物镜12的玻璃修正功能修正。夹持于光轴上的边界B2和边界B3的区域(即，夹持于盖玻片和细胞的区域)例如被磷酸缓冲食用盐水充满。光轴上的边界B2与边界B3的距离E1例如是30μm。再有，将物镜12的倍率设定为40倍，将数值孔径(NA)设定为0.75，将光轴上的点O与边界B3的距离E2设定为300μm，将点O与点O’的距离E3设定为80μm。还有，在上述的条件下，除了球面像差之外慧形像差(coma aberration)以及散光(astigmatism)被包含于波阵面。如图7(a)以及图7(b)所示，通过上述的反向传播解析，适宜地求得照射光所需要的波阵面。然后，基于该波阵面，适宜地求得像差修正全息图。

[0087] 还有，作为修正起因于生物体对象物B的表面形状的像差的方法，例如考虑组合相位调制器(主要是可变形反射镜(deformable mirror))和波阵面测量器(夏克-哈特曼传感器(Shack-Hartmann sensor))并进一步将大小或形状已知的荧光珠埋入到生物体对象物B的内部的特定的位置的方法。在该方法中，激发光和来自荧光珠的荧光一起受到像差的影响。因此，通过使用波阵面测量器测量荧光强度分布从而能够测量像差。然后，将修正该像差的那样的全息图呈现于相位调制器。此时，将荧光珠作为参照信息来进行使用。然而，在这样的方法中，有必要通过外科手术埋入荧光珠，埋入荧光珠是困难的，或者在生物体对象物B的状态会通过埋入荧光珠而发生变化的那样的情况下不能够适用。相对于此，根据本实施方式的方法，没有必要埋入荧光珠。

[0088] 另外，也考虑将被设想为像差减少的多个全息图提示于空间光调制器，扫描由该空间光调制器调制后的照射光，并选择所获得的图像的亮度或分辨率提高的全息图等的由试误法获得像差修正全息图的方法。然而，在这样的方法中为了重复实验以及设计而需要长时间。另外，所获得的像差修正全息图成为近似解的可能性高，精度被抑制得较低。相对于此，在本实施方式的方法中，因为将像差修正全息数据的计算全部在计算机43中进行，所以与伴有操作者所进行的试误法的方法相比较，可以缩短所需要时间。另外，在本实施方式的方法中，因为计算机43基于在形状测量单元20中取得的表面形状的信息来制作像差修正全息数据，所以能够提高像差修正的精度。

[0089] 还有，被呈现于空间光调制器33的全息图也可以不是像差修正全息图其本身。例如，也可以是重叠了用于控制被照射于生物体对象物B的照射光L1的聚光形状或聚光位置的全息图等的其他全息图和像差修正全息图的全息图。

[0090] (第2实施方式)

[0091] 在上述第1实施方式中，作为伴有成为像差的产生原因的折射率差的形状，例示了生物体对象物B的表面形状，但是，作为伴有折射率差的形状，除此以外还可以列举例如生物体对象物B的表面正下方的内部结构。以下，对那样的情况进行详细的说明。

[0092] 即使是在将具有一定的光强度的照射光照射于生物体对象物B的情况下，在生物体对象物B的深的位置和浅的位置上照射光的每单位体积的强度也不同。这是由起因于生物体对象物B的内部结构的照射光的散射以及像差引起的。这样的散射以及像差的产生中，由宏观上血管等的结构、微观上构成细胞的器官的折射率差产生的光路变化成为一个原因。特别是在生物体对象物B的深的位置上，光路由内部结构而发生变化，照射光的聚光形状会发生大幅变化。由此，照射光的聚光强度在生物体对象物B内部的所希望的照射位置上变弱，或者聚光范围扩大。因此，限定于所希望的照射位置来进行光刺激变得困难。

[0093] 因此，在本实施方式中，测量伴有生物体对象物B的表面正下方的折射率差的内部结构，将包含用于修正起因于该内部结构的像差的像差修正全息图的全息图呈现于空间光调制器33。由此，能够抑制照射光L1的聚光强度强度的降低以及聚光范围的扩大。

[0094] 图8是从侧方看生物体对象物B的图，并且概念性地表示照射光通过包含折射率互相不同的介质Ba以及Bb的内部结构并被聚光的情况。图8(a)以及图8(b)表示假定无像差的时候的照射光L7的聚光的情况，并且表示分别聚光于生物体对象物B的浅的位置和深的位置的情况。如图8(a)所示，在聚光于浅的位置的情况下，存在于光路上的折射率的边界比较少，但是，如图8(b)所示，越是聚光于深的位置，则存在于光路上的折射率的边界越是增加。因此，在这样的情况下，实际上如图8(c)所示照射光受到生物体对象物B的内部结构所产生的影响。如图8(c)所示不进行像差修正的情况下，透镜外周部附近的光线L7c,L7d受到内部结构的影响而发生折射。另一方面，光轴A2附近的光线因为折射角小，所以难以受到内部结构的影响。其结果，光轴A2附近的光线的聚光位置和光线L7c,L7d的聚光位置互相不同，像差产生。图8(d)表示这样的像差被修正了的情况。通过考虑内部结构的折射率分布来修正照射光L7的波阵面，从而光轴A2附近的光线的聚光位置和光线L7c,L7d的聚光位置互相一致，并且照射光L7的高密度下的聚光成为可能。

[0095] 图9是表示本实施方式的光刺激装置1B的结构的图。如图9所示，光刺激装置1B与上述的第1实施方式的光刺激装置1A相比较，不具备形状测量单元20，取而代之具备分色镜34、检测器37以及过滤器38。检测器37以及过滤器38构成本实施方式中的形状取得部即形状测量单元60。形状测量单元60包含检测器37，与物镜12光学结合。

[0096] 分色镜34将来自空间光调制器33的照射光L1以及来自照射光学单元10的被检测光L2中的一方透过，将另一方反射。在图1所示的例子中，分色镜34透过照射光L1并反射被检测光L2。在此，被检测光L2是由照射光L1而在生物体对象物B上发生的光，例如是照射光L1的反射光、照射光L1的高次谐波、或者被照射光L1激发的荧光。被检测光L2被物镜12聚集并经4f光学系统52、反射镜39、光扫描器35以及4f光学系统51而到达分色镜34。

[0097] 检测器37检测经由物镜12从生物体对象物B输出的被检测光L2的光强度，并输出检测信号S2。被检测光L2被光扫描器35双能量扫描(de-scan)，在分色镜34上被反射，并被检测器37检测。检测器37也可以是PMT(Photomultiplier Tube(光电倍增管))、光电二极管、雪崩光电二极管等的点传感器。或者，检测器37也可以是CCD图像传感器、CMOS图像传感器、多阳极PMT、光电二极管阵列等的面图像传感器。还有，也可以在检测器37的正前方配置聚光透镜37a。

[0098] 过滤器38被配置于分色镜34与检测器37之间的光轴上。过滤器38从输入到检测器37的光中将照射光L1的波长以及观察所不需要的荧光等的波长截止(cut)。还有，过滤器38也可以被配置于聚光镜37a的前段、后段中的任一方。

[0099] 如上所述，本实施方式的光刺激装置1B不具备形状测量单元20，取而代之具备形状测量单元60。形状测量单元60是取得与生物体对象物B的表面正下方的内部结构相关的信息的形状取得部。然后，在本实施方式中，使物镜12在光轴方向上移动，基于所获得的检测信号S2，计算机43取得与生物体对象物B的内部结构相关的信息。

[0100] 由本实施方式的结构，能够取得与生物体对象物B的表面正下方的内部结构相关的信息。即，如果使用恰当的荧光材料的话，则在所获得的荧光像中包含与生物体对象物B的内部结构相关的信息。因此，使用物镜移动机构13，按顺序使物镜12与生物体对象物B的距离进行变化。如果使照射光(激发光)L1聚光于生物体对象物B内部的深的位置的话，则从存在于照射光(激发光)L1的光路上的生物体对象物B内部的结构物发出荧光(自身含有荧光)。因此，通过使聚光位置变浅并取得荧光强度，从而能够把握生物体对象物B的折射率分布。于是，通过将考虑了被把握的折射率分布的像差修正全息图呈现于空间光调制器33，从而能够减轻像差的影响。还有，在本实施方式中，生物体对象物B可以是由荧光色素、荧光蛋白质、自身荧光、SecondHarmonic Geberation(SHG)等而从特定的部位发出荧光的物质。另外，在以下的说明中，将物镜移动机构13、激光光源31、光扫描器35以及检测器37所形成的用于上述那样的内部结构的测量的动作称为预扫描。

[0101] 在光刺激装置1B中，为了观察相对于光轴垂直的面内的荧光像，由光扫描器35(例如XY检流计)进行扫描。于是，通过物镜12或者生物体对象物台11在光轴方向上进行移动，从而获得深度分别不同的多个面内的信息。最终，通过组合这些信息从而构筑出三维信息。

[0102] 另外，形状取得部也可以替代上述的结构或者与上述的结构一起使用被用于单光子的荧光观察的光片光(light sheet light)或者超声波等来测量折射率分布。由此，在观察前预先把握大概的结构，能够适宜地设计用于修正起因于该结构的像差的像差修正全息图。

[0103] 图10是表示上述的光刺激装置1B的动作以及本实施方式的光刺激方法的流程图。首先，将生物体对象物B载置于生物体对象物台11上。接着，一边在光轴方向上移动物镜12一边渐渐地使聚光位置从生物体对象物B的浅的位置向深的位置移动。同时，从激光光源31输出光L15并使照射光L1聚光于生物体对象物B的表面正下方，在检测器37中检测来自生物体对象物B的表面正下方的内部结构的被检测光(荧光)L2。还有，此时，不进行空间光调制器33所进行的像差修正。由此，检测出起因于生物体对象物B的表面正下方的内部结构的深度方向的荧光的变化。于是，一边由光扫描器35使照射光L1的光轴移动一边重复进行该动作。由此，构筑出与生物体对象物B的内部结构相关的三维信息。然后，从被构筑出的三维信息推定折射率分布(形状取得步骤S21)。

[0104] 之后，进行与第1实施方式相同的全息图制作步骤S12以及光照射步骤S13。还有，在向深的位置的照射中，因为照射光L1通过被推定的折射率分布的一部分乃至全部，所以在全息图制作步骤S12中，可以以相对于通过中的照射光L1的折射率分布的影响变小的方式制作像差修正全息图。在本实施方式中，像差修正全息图使用几何光学、波动光学、电磁场解析等并基于由反向传播求得的波阵面来设计。所谓几何光学，例如是逆光线跟踪，所谓波动光学，例如是菲涅耳波阵面传播或者菲涅耳-基尔霍夫的衍射，所谓电磁场解析，例如是FDTD或者RCWA。

[0105] 还有，在上述第1实施方式中基于生物体对象物B的表面形状制作像差修正全息图，在本实施方式中基于伴有生物体对象物B的表面正下方的折射率分布的结构来制作像差修正全息图，但是，也可以基于生物体对象物B的表面形状和生物体对象物B的表面正下方的结构的双方来制作像差修正全息图。

[0106] 另外，本实施方式的形状取得部使用通过照射照射光L1而获得的荧光来取得与生物体对象物B的表面正下方的结构相关的信息，但是，形状取得部可以使用超声波来测量生物体对象物B的表面正下方的折射率分布，也可以使用相位差或微分干涉来测量表面正下方的折射率分布。或者，形状取得部也可以摆动光轴的角度或者改变浸液的折射率，并从反射和透过等推定表面正下方的折射率分布或散射程度。由此，能够推定特别是生物体对象物B的表面上的折射率分布。例如在摆动光轴的角度的情况下，能够从布儒斯特角(Brewster's angle)或角度与反射率的关系推定生物体对象物B的表面的折射率或试样内部的折射率分布。

[0107] 对由具备上述的结构的本实施方式的光刺激装置1B以及光刺激方法获得的效果进行说明。在本实施方式的光刺激装置1B以及光刺激方法中，取得与生物体对象物B的表面正下方的内部结构相关的信息。然后，基于该信息，生成用于修正像差的像差修正全息数据。另外，由基于该数据的全息图调制照射光L1。由此，因为起因于生物体对象物B的表面正下方的内部结构的像差被适宜地修正，所以能够抑制生物体对象物B的内部的照射光L1的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。

[0108] 另外，如本实施方式那样，在形状测量单元60以及形状取得步骤中取得的与伴有折射率差的形状相关的信息也可以包含生物体对象物B的表面正下方的结构。根据上述的光刺激装置1B以及光刺激方法，例如在这样的情况下，能够适宜地抑制生物体对象物B的内部的照射光L1的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。

[0109] (第1变形例)

[0110] 图11是用于说明第1变形例的动作的图，并且是从光轴方向看生物体对象物B的表面的图。在第2实施方式中，形状取得部(在形状取得步骤中)，也可以如图11所示将生物体对象物B的表面分割成格子状的多个区域F1～F4，并且对每个区域F1～F4并行地进行小面积上的扫描。在此情况下，对每个区域F1～F4制作个别的像差修正全息图，并在空间光调制器33呈现具有像差修正以及多点生成的效果的全息图。

[0111] 图12(a)以及图12(b)是表示与生物体对象物B的外侧的边界B1的一个例子的图。如图12(a)所示，在扫描照射光L1宽的区域的情况下，因为物镜12与边界B1的距离以及生物体对象物B的表面正下方的内部结构发生较大变化，所以也可以在中途切换像差修正全息图。然而，在此情况下，因为空间光调制器的动作迟缓，所以会牵涉到时间的损失。相对于此，如图12(b)所示，如果分割成多个区域F1～F4并减小扫描区域的话，则没有必要切换像差修正全息图，能够实现高精度而且高速的扫描。

[0112] (第2变形例)

[0113] 图13是表示第2变形例所涉及的光刺激装置1C的结构的图。在本变形例的光刺激装置1C中，形状测量单元20B构成形状取得部。形状测量单元20B具有光源25、分色镜26、光扫描器27、检测器28以及过滤器29。形状测量单元20B包含检测器28并与物镜12光学结合。

[0114] 光源25输出被照射于生物体对象物B的激发光L8。还有，即使在本变形例中，也与第2实施方式相同，生物体对象物B可以是由荧光色素、荧光蛋白质、自身荧光、SHG等而从特定的部位发出荧光的物质。于是，激发光L8是包含激发生物体对象物B的波长的光。激发光L8可以是与从激光光源31输出的光L5相同的波长的光，也可以是不同的波长的光。

[0115] 分色镜26将来自光源25的激发光L8以及来自照射光学单元10的荧光L9中的一方透过，将另一方反射。在图13所表示的例子中，分色镜26反射激发光L8，并透过荧光L9。

[0116] 光扫描器27通过在垂直于激发光L8的光轴的面内使激发光L8的光轴移动从而扫描生物体对象物B上的激发光L8的照射位置。光扫描器27例如由检流计反射镜、共振镜或者多棱镜构成。另外，来自生物体对象物B的荧光L9经由光扫描器27被检测。由此，能够使激发光L8的光轴与荧光L9的光轴互相一致。

[0117] 检测器28检测经由物镜12而从生物体对象物B输出的荧光L9的光强度，并输出检测信号S3。检测器28也可以是PMT、光电二极管、雪崩光电二极管等的点传感器。或者，检测器28也可以是CCD图像传感器、CMOS图像传感器、多阳极PMT、光电二极管阵列等的面图像传感器。还有，也可以通过在检测器28的前段配置针孔来提供共焦效应。

[0118] 过滤器29被配置于分色镜26与检测器28之间的光轴上。过滤器29从输入到检测器28的光中将激发光L8的波长以及观察所不需要的荧光等的波长截止。

[0119] 在物镜12与光源25的距离较长的情况下，也可以将至少一个4f光学系统设置于激发光L8以及荧光L9的光轴上。作为一个例子，在图13中表示一个4f光学系统53。4f光学系统53被配置于光扫描器27与分束器14之间的光轴上。

[0120] 在本变形例中，首先，将生物体对象物B载置于生物体对象物台11上。接着，一边在光轴方向上移动物镜12一边渐渐地使聚光位置从生物体对象物B的浅的位置向深的位置移动。同时，从光源25输出激发光L8，在检测器28中检测来自生物体对象物B的表面正下方的内部结构的荧光L9。由此，检测出起因于生物体对象物B的表面正下方的内部结构的深度方向的荧光的变化。于是，一边由光扫描器27使激发光L8的光轴移动一边重复进行该动作。由此，构筑出与生物体对象物B的内部结构相关的三维信息。然后，从被构筑出的三维信息推定折射率分布。以后的动作与上述的第2实施方式相同。还有，在激发光L8的波长包含于从激光光源31输出的光L5的波长的情况下，由激光光源31以及光扫描器35，也可以实现光源25以及光扫描器27的功能。在此情况下，光源25、光扫描器27以及分色镜26变得不需要。

[0121] (第3变形例)

[0122] 在上述的第2实施方式中，重复多次预扫描，在第2次以后的预扫描中，也可以基于前一次的预扫描的结果，由空间光调制器33修正光L5的像差。由此，能够在将光L5照射于生物体对象物B的时候减轻起因于生物体对象物B的内部结构的像差的影响，能够更加正确地把握生物体对象物B的结构，并获得更高分辨率的图像。

[0123] 具体来说，在最初的预扫描的时候，因为不实施像差修正，所以照射光L1成为平面波，但是，在第2次的预扫描中，将修正像差的那样的波阵面提供给照射光L1。于是，基于由第2次以后的预扫描获得的生物体对象物B的结构，设计像差修正全息图。或者，也可以由最初的预扫描进行大概的像差修正，并由第2次以后的预扫描进行更加细致的像差修正。

[0124] (第4变形例)

[0125] 图14是表示第4变形例所涉及的光刺激装置1D的结构的图。在本变形例中，将瞬逝场(evanescent field)用于生物体对象物B的表面形状的测量。由此，生物体对象物B是否接地于生物体对象物台11等的形状把握变得容易。还有，在变形例中，为了使瞬逝场发生而使用产生全反射的那样的物镜12以及生物体对象物台11(盖玻片)。

[0126] 在本变形例的光刺激装置1D中，形状测量单元20C构成形状取得部。形状测量单元20C具有光源25、分色镜26、检测器28、过滤器29以及聚光透镜61。还有，光源25、分色镜26、检测器28以及过滤器29的结构与第3变形例相同。形状测量单元20C与物镜12光学结合。

[0127] 聚光透镜61在激发光L8为面照明的情况下被设置，并且被配置于分色镜26与照射光学单元10之间的光轴上。聚光透镜61使激发光L8聚光于物镜12的后侧焦点面。还有，在激发光L8为点照明的情况下，不需要聚光透镜61。在此情况下，也可以例如使平面波即激发光L8输入到物镜12的产生全反射的区域，并由光扫描器或者生物体对象物台11的平面移动来进行激发光L8的扫描。另外，也可以替代物镜12而使用棱镜或光纤。

[0128] (第5变形例)

[0129] 图15是表示第5变形例所涉及的光刺激装置的照射光学单元10B以及形状测量单元20D的结构的图。在本变形例中，由超声波测量生物体对象物B的弹性，并利用生物体对象物B的区域间的弹性差来获得生物体对象物B的结构。于是，基于所获得的结构，制作像差修正全息图。还有，在图15中，省略图1所表示的照射光生成单元30以及控制单元40的图示。

[0130] 如图15所示，本变形例的形状测量单元20D具有脉冲发生源62以及检测器即信号接收器63。脉冲发生源62产生用于使超声波产生的脉冲信号S4。信号接收器63对包含与生物体对象物B的内部结构相关的信息的脉冲信号S5进行接收。

[0131] 照射光学单元10B替代图1所表示的照射光学单元10的物镜12而具有附有压电薄膜的透镜64。还有，关于其他结构，与照射光学单元10相同。附有压电薄膜的透镜64以与生物体对象物B相对的方式被配置，由压电薄膜将脉冲信号S4转换成超声波并将该超声波照射于生物体对象物B，另外，将在生物体对象物B上反射的超射波转换成脉冲信号S5。还有，在本变形例中，相对于脉冲信号S4和脉冲信号S5使用共同的附有压电薄膜的透镜，但是，也可以分别地设置脉冲信号S4用的附有压电薄膜的透镜和脉冲信号S5用的附有压电薄膜的透镜。

[0132] (第6变形例)

[0133] 图16是表示第6变形例所涉及的光刺激装置1E的结构的图。在本变形例中，将相位差·微分干涉用于生物体对象物B的表面形状的测量。在本变形例的光刺激装置1E中，形状测量单元20E构成形状取得部。形状测量单元20E具有光源21、分束器22、检测器24、微分干涉(DIC)棱镜66以及偏光片67。形状测量单元20E与物镜12光学结合。还有，光源21、分束器22、检测器24的结构与第1实施方式相同。

[0134] DIC棱镜66以及偏光片67被排列配置于分束器22与物镜12之间的光路上。DIC棱镜66将来自光源21的光L3分支成2根，另外，使来自生物体对象物B的返回光L10重叠。偏光片
67限制光L3以及L10的偏光。从生物体对象物B经DIC棱镜66以及偏光片67而到达分束器22的光L10透过分束器22并被输入到检测器24。

[0135] 本发明的一个方面的光刺激装置以及光刺激方法并不限于上述的实施方式，除此之外可以进行各种变形。例如，在上述的实施方式中，对照射光学单元10为倒立型显微镜的情况进行了说明，但是，照射光学单元10也可以是正立型显微镜。

[0136] 另外，也可以取代激光光源31而使用输出非相干光的非相干光源。非相干光源例如包括超辐射发光二极管(SLD)或发光二极管(LED)、ASE(Amplified Spontaneous Emission(放大自发发射))光源、灯类光源。

[0137] 产业上的利用可能性

[0138] 根据本发明的一个方面，能够提供一种能够抑制生物体对象物的内部的照射光的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大的光刺激装置以及光刺激方法。

[0139] 符号的说明

[0140] 1A～1E…光刺激装置、10,10B…照射光学单元、11…生物体对象物台、12…物镜、13…物镜移动机构、14…分束器、15…反射镜、20,20B～20E,60…形状测量单元、21…相干光源、22…分束器、23…参照光用镜、24…检测器、30…照射光生成单元、31…激光光源、
32…光束扩展器、33…空间光调制器、35…光扫描器、40…控制单元、A2…光轴、B…生物体对象物、L1…照射光、L3…相干光、L4…干涉光。