一种脂肪间充质干细胞组合物及其应用

摘要

本发明涉及医学领域，公开了一种脂肪间充质干细胞组合物及其应用。本发明所述组合物包括脂肪间充质干细胞、透明质酸或其药用盐、生理盐水、人血白蛋白、胰岛素生长因子。本发明组合物选择脂肪间充质干细胞、透明质酸或其药用盐、生理盐水、人血白蛋白、胰岛素生长因子作为治疗骨关节炎的成分，组合物组成简单，脂肪间充质干细胞为自体细胞，取材不受限制，并且在治疗复发率上明显低于其他干细胞制剂，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种脂肪间充质干细胞组合物，其特征在于，所述组合物由脂肪间充质干细胞、透明质酸或其药用盐、生理盐水、人血白蛋白、胰岛素生长因子组成；脂肪间充质干细胞浓度为（1-2）×106个/mL，透明质酸或其药用盐体积百分比为5-10%，人血白蛋白体积百分比10-

15%，胰岛素生长因子体积百分比为5-10%，其余为生理盐水。

2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，脂肪间充质干细胞浓度为1.5×106个/mL，透明质酸或其药用盐体积百分比为8%，人血白蛋白体积百分比10%，胰岛素生长因子体积百分比为8%，其余为生理盐水。

3.根据权利要求1或2所述组合物，其特征在于，所述人血白蛋白的浓度为20%。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞为传代5代以内的细胞。

5.权利要求1-4中任一权利要求所述的组合物在制备治疗骨关节炎产品中的应用。

说明书

一种脂肪间充质干细胞组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医学领域，具体的说是涉及一种脂肪间充质干细胞组合物及其应用。

背景技术

[0002] 骨性关节炎是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病，发病率高，在老年人口中十分常见，60岁以上的人群中患病率可达50％，75岁以上的人群中则达80％。骨关节炎患者的关节疼痛常使患者难以忍受，患者发病后致残率高。骨关节炎常发生软骨缺损，但软骨的自身修复能力有限，通常可以将软骨修复作为骨关节炎治疗的最重要评价指标。

[0003] 现有的治疗骨关节炎的药物能在一定程度上延缓病程、改善患者症状，缓解患者疼痛，但不能逆转病理过程，不能根治骨关节炎，且大部分药物副作用明显。而外科手术治疗主要通过关节镜(窥镜)、开放手术或人工关节置换，虽然能暂时缓解疼痛，但长远效果(10年左右)并不理想。干细胞等细胞治疗法是目前最有希望彻底解决骨关节炎治疗的新方法。

[0004] 近十年来，干细胞移植治疗骨关节炎已有大量研究报道。干细胞注入骨关节炎关节后，能发挥免疫调节作用，炎症反应调节作用，减少疼痛；分泌抗凋亡因子和抗纤维化因子抑制病情进展；分泌TGF-β、BMP-4等因子，促进内源性干细胞软骨修复；还能分化为软骨细胞帮助修复软骨。中国专利CN105796600A公开了使用干细胞治疗骨关节炎的方法和组合物，该组合物包括间充质干细胞、透明质酸或其药用盐、氯化钠和水，虽然其记载了冻存后细胞存活率较好的有益效果，但是采用该组合物治疗骨关节炎的效果却具有一定的缺陷，主要是治疗后复发率较高。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于一种脂肪间充质干细胞组合物及其应用，使得所述组合物对骨关节炎有显著的疗效，且治疗后复发率较低。

[0006] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0007] 一种脂肪间充质干细胞组合物，包括脂肪间充质干细胞、透明质酸或其药用盐、生理盐水、人血白蛋白、胰岛素生长因子。

[0008] 针对现有间充质干细胞制剂在治疗骨关节炎方面存在复发率较高的问题，本发明选用脂肪间充质干细胞、透明质酸或其药用盐、生理盐水、人血白蛋白、胰岛素生长因子组成新型组合物，对骨关节炎具有较为显著的疗效并且复发率较低。

[0009] 其中，作为优选，脂肪间充质干细胞浓度为(1-2)×106个/mL，透明质酸或其药用盐体积百分比为5-10％，人血白蛋白体积百分比10-15％，胰岛素生长因子体积百分比为5-10％，其余为生理盐水。

[0010] 在本发明具体实施过程中，所述组合物中各成分组成可任意选择如下：

[0011] (1)脂肪间充质干细胞浓度为1.5×106个/mL，透明质酸或其药用盐体积百分比为8％，人血白蛋白体积百分比10％，胰岛素生长因子体积百分比为8％，其余为生理盐水；

[0012] (2)脂肪间充质干细胞浓度为2×106个/mL，透明质酸或其药用盐体积百分比为5％，人血白蛋白体积百分比13％，胰岛素生长因子体积百分比为10％，其余为生理盐水；

[0013] (3)脂肪间充质干细胞浓度为1×106个/mL，透明质酸或其药用盐体积百分比为10％，人血白蛋白体积百分比15％，胰岛素生长因子体积百分比为5％，其余为生理盐水；

[0014] 本发明所述脂肪间充质干细胞的分离培养可按照常规方法进行，在具体制备时可采用患者自体脂肪进行分离培养，本发明提供了如下方法：

[0015] 抽取30ml新鲜脂肪，将脂肪转移到无菌储液瓶中用等体积PBS剧烈摇晃，静止分层弃去下层液体，重复一次；

[0016] 将清洗好的脂肪转移到50ml离心管中补加加PBS至体积50ml，用1500rpm离心5分钟，离心后用移液管将上层脂肪油和下层液体弃置，再加入等体积的I型胶原酶，盖上盖子封口；

[0017] 转移到恒温震荡仪中以37度、200转每分进行消化，大概30-50分钟，至脂肪完全消化，再转移到离心机中以1500rpm离心5分钟；

[0018] 用移液管吸掉上层脂肪油，倒弃剩余液体，再用40mlPBS重悬细胞沉淀，继续以1500rpm离心5分钟；

[0019] 倒弃液体，用Lonza无血清完全培养基重悬，分到3个10cm的培养皿中，每个皿10ml，再在每个皿中加入EGF调整后EGF为10ng/ml，放置37度、5％二氧化碳、湿度95％的二氧化碳培养箱中培养；

[0020] 培养2天后，给细胞换液，每天观察细胞，待细胞贴壁汇合度达到80％给细胞传代。

[0021] 作为优选，本发明所述脂肪间充质干细胞选择传代5代以内的细胞。

[0022] 作为优选，所述人血白蛋白的浓度为20％。

[0023] 本发明组合物在治疗兔骨关节炎的实验中，破坏的软骨表层恢复完好，软骨正常未发生空泡样变性，成熟软骨细胞柱状线恢复；软骨含量、TNF-α含量和Mankin评分结果与正常组无显著差异，表明本发明组合物对骨关节炎具有显著的疗效。

[0024] 同时以本发明所述组合物为试验对象，以现有专利CN105796600A实施例8的脐带间充质干细胞组合物为第一组对照，同时在其基础上用脂肪间充质干细胞替换脐带间充质干细胞设置第二组对照，分别治疗按临床标准划分为相同程度的骨关节炎疾病志愿者，结果显示，采用本发明组合物治疗的志愿者，复发率只有36％，而另外两组对照组的复发率均为68％，此外其中一组还有1例无效。

[0025] 基于上述优异的技术效果，本发明提供了所述组合物在制备治疗骨关节炎产品中的应用。

[0026] 由以上技术方案可知，本发明组合物选择脂肪间充质干细胞、透明质酸或其药用盐、生理盐水、人血白蛋白、胰岛素生长因子作为治疗骨关节炎的成分，组合物组成简单，脂肪间充质干细胞为自体细胞，取材不受限制，并且在治疗复发率上明显低于其他干细胞制剂，具有广阔的应用前景。

附图说明

[0027] 图1所示为正常兔关节石蜡切片图；

[0028] 图2所示为骨关节炎兔模型关节石蜡切片图；

[0029] 图3所示为经过本发明组合物治疗后的骨关节炎兔模型关节石蜡切片图。

具体实施方式

[0030] 本发明实施例公开了一种脂肪间充质干细胞组合物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明产品和应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0031] 本发明所述组合物将各组分按照要求的比例轻微振荡混匀即可获得所述组合物。

[0032] 在本发明兔骨关节炎的实验中，脂肪来源为模型兔自体脂肪，同样，在骨关节炎志愿者临床治疗实验中，脂肪来源为志愿者自体脂肪，所用脂肪间充质干细胞均经过流式细胞仪检测细胞表面标志物符合要求，实施方式中采用传代至第4代的细胞。

[0033] 以下就本发明所提供的一种脂肪间充质干细胞组合物及其应用做进一步说明。

[0034] 实施例1：脂肪间充质干细胞的分离培养

[0035] 抽取30ml新鲜脂肪，将脂肪转移到无菌储液瓶中用等体积PBS剧烈摇晃，静止分层弃去下层液体，重复一次；

[0036] 将清洗好的脂肪转移到50ml离心管中补加加PBS至体积50ml，用1500rpm离心5分钟，离心后用移液管将上层脂肪油和下层液体弃置，再加入等体积的I型胶原酶，盖上盖子封口；

[0037] 转移到恒温震荡仪中以37度、200转每分进行消化，大概30-50分钟，至脂肪完全消化，再转移到离心机中以1500rpm离心5分钟；

[0038] 用移液管吸掉上层脂肪油，倒弃剩余液体，再用40mlPBS重悬细胞沉淀，继续以1500rpm离心5分钟；

[0039] 倒弃液体，用Lonza无血清完全培养基重悬，分到3个10cm的培养皿中，每个皿10ml，再在每个皿中加入EGF调整后EGF为10ng/ml，放置37度、5％二氧化碳、湿度95％的二氧化碳培养箱中培养；

[0040] 培养2天后，给细胞换液，每天观察细胞，待细胞贴壁汇合度达到80％给细胞传代。

[0041] 实施例2：本发明所述脂肪间充质干细胞组合物

[0042] 脂肪间充质干细胞浓度为1.5×106个/mL，透明质酸或其药用盐体积百分比为8％，人血白蛋白(浓度为20％)体积百分比10％，胰岛素生长因子体积百分比为8％，其余为生理盐水。

[0043] 实施例3：本发明所述脂肪间充质干细胞组合物

[0044] 脂肪间充质干细胞浓度为2×106个/mL，透明质酸或其药用盐体积百分比为5％，人血白蛋白(浓度为20％)体积百分比13％，胰岛素生长因子体积百分比为10％，其余为生理盐水。

[0045] 实施例4：本发明所述脂肪间充质干细胞组合物

[0046] 脂肪间充质干细胞浓度为1×106个/mL，透明质酸或其药用盐体积百分比为10％，人血白蛋白(浓度为20％)体积百分比15％，胰岛素生长因子体积百分比为5％，其余为生理盐水。

[0047] 实施例5：治疗兔骨关节炎的实验

[0048] 1、兔骨关节炎造模

[0049] 选用健康成年新西兰大耳白兔，体重5到8千克。将兔后左膝关节进行前交叉韧带切断术与内侧半月板切除术联合造模，右膝作为对照侧，手术4周后，病理评价骨关节炎造模效果。

[0050] 2、兔骨关节炎治疗

[0051] 在评价造模成功后第4周，在超声引导下使用注射器向患骨关节炎的关节处注射0.4mL组合物(实施例2组合物)，缓慢推注。

[0052] 3、治疗效果评价

[0053] 在接受治疗后第10周，进行检测：

[0054] (1)关节病理观察

[0055] 关节去除远端股骨和胫骨平台后，用10％甲醛固定，样本脱钙后，石蜡包埋后切片，进行HE染色。结果如图1-图3所示，正常膝关节软骨表层完好，软骨细胞正常(图1)；对照组未治疗的膝关节软骨表层明显破坏，剥脱现象明显，表层软骨空泡样变性，成熟软骨细胞柱状线消失，结构破坏明显(图2)；经细胞治疗后的软骨，破坏的软骨表层恢复完好，软骨正常未发生空泡样变性，成熟软骨细胞柱状线恢复(图3)。

[0056] (2)Mankin评分

[0057] 关节去除远端股骨和胫骨平台后，用10％甲醛固定，样本脱钙后，石蜡包埋后切片，进行HE染色、甲苯胺蓝和番红O染色。采用Mankin评分法对关节进行评分，结果如表1所示。

[0058] 表1Mankin评分结果

[0059]正常对照组 治疗组 模型组
0.3 1.5 5.5

[0060] (3)ELISA法检测TNF-α含量

[0061] 取关节液，采用ELISA法检测TNF-α炎性因子表达，含量检测如表2所示。

[0062] 表2ELISA法检测TNF-α结果(单位：μg/ml)

[0063]天数 正常对照组 治疗组 模型组
第1天 30 30 30
第20天 30 100 100
第40天 30 35 105

[0064] (4)软骨总量变化

[0065] 将兔关节进行核磁共振成像MRI观察，检测关节恢复状况及软骨体积。治疗10周后关节软骨含量如表3所示。

[0066] 表3软骨含量(单位：μg)

[0067]正常对照组 治疗组 模型组
10 9 4

[0068] 根据上述多项试验结果可知，本发明组合物对骨关节炎具有显著的疗效。同样，实施例3和4组合物进行上述试验，与模型组相比，在各方面均得到显著改善。

[0069] 实施例6：临床疗效对比试验

[0070] 招募骨关节病志愿者125名，所有志愿者经临床诊断标准诊断为同等程度的疾病患者，随机平均分成五组，实验1-3组采用本发明实施例2-4组合物，对照1组采用专利CN105796600A实施例8的脐带间充质干细胞组合物，对照2组在对照1组基础上采用脂肪间充质干细胞，跟踪6个月(2个月注射一次)，无效、有效以及复发判断参照临床标准，结果见表4。

[0071] 表4骨关节炎志愿者6个月后治疗情况

[0072]组别 无效 有效不复发 有效复发
实验1组 0/25，0 16/25，64％ 9/25，36％
实验2组 0/25，0 15/25，60％ 10/25，40％
实验3组 0/25，0 13/25，52％ 12/25，48％
对照1组 0/25，0 8/25，32％ 17/25，68％
对照2组 1/25，4％ 7/25，28％ 17/25，68％

[0073] 由表4可知，采用本发明组合物治疗的志愿者均有效，有效不复发率在50％以上，远高于两组对照；而在有效不复发率上，本发明只有36％，另外两组对照组的复发率均为68％，此外其中对照2组还有1例无效。

[0074] 以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。