全人源抗狂犬病毒中和抗体及其用途

摘要

本发明公开了一种全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段，本发明的中和抗体能特异性与狂犬病病毒结合并且可以有效中和病毒活性。本发明还涉及该中和抗体的制备方法和用途。本发明的抗体可以用于狂犬病紧急预防和/或治疗以及狂犬病毒检测。此外，该抗体还可用于制备狂犬病毒检测试剂，发现有效中和抗原表位及开发狂犬病毒重组蛋白及亚单位疫苗。

权利要求

1.一种全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

重链CDR1为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

重链CDR2为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

重链CDR3为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

轻链CDR1为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

轻链CDR2为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

轻链CDR3为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链可变区具有SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链抗体。

4.编码权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求4所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

8.一种狂犬病毒检测产品，其特征在于，所述检测产品包括权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

9.一种制备权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述制备权利要求1-3中任一项所述的抗体的方法包括如下步骤：（1）分离注射狂犬疫苗的人静脉血中的单个核细胞，之后利用流式细胞术进行细胞分选，PBMC分选获得具有CD3－，CD14－，CD16－，CD19＋，CD27＋的单个B细胞；

（2）利用单细胞RT-PCR扩增步骤（1）获得的单个B细胞中的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段；

（3）将步骤（2）获得的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段融合到含有人类抗体恒定区的表达载体中形成重组表达载体，之后导入宿主细胞表达；

（4）抗体筛选平台筛选获得具有结合活性和中和活性的权利要求1-3中任一项所述的抗体。

10.一种非诊断目的的检测狂犬病毒水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）获得狂犬病毒的样品；

（2）将步骤（1）获取的样品与权利要求1-3中任一项所述的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段的接触；

（3）检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。

11.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备狂犬病毒检测产品中的应用。

12.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备抑制狂犬病毒的药物中的应用。

13.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备治疗由狂犬病毒感染引起的疾病的药物制剂中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述疾病是狂犬病。

说明书

全人源抗狂犬病毒中和抗体及其用途

技术领域

[0001] 本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种全人源的单克隆抗体，尤其涉及一种全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体。另外，本发明还涉及该中和抗体的制备方法和用途。

背景技术

[0002] 根据世界卫生组织(WHO)建议，对于严重暴露者应同时进行主动和被动免疫治疗，以获得快速有效的保护作用。狂犬病疫苗是减毒后的对人体无害的狂犬病病毒(也就是无害抗原)，需要15～20天才产生足够抗体刺激机体产生抗狂犬病毒的主动免疫作用。被动免疫制剂是含有特异性抗体的免疫血清或细胞因子，能够立即特异地中和狂犬病病毒，短期内起到治疗或紧急预防狂犬病的作用。

[0003] 随着对狂犬病毒及其单克隆抗体不断深入的研究，如何用单克隆抗体取代现有被动免疫制剂的思路越来越清晰。应用单克隆抗体技术开发抗狂犬病毒单克隆抗体(monoclonal antibodies，mAbs)防治狂犬病可以克服多抗血清的众多弊端，应用前景广阔。

[0004] 1975年创立体外杂交瘤技术得到了鼠源性单克隆抗体(Kohler et al.，1975)，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。与多克隆抗体相比，mAb具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。在目前生产的单抗中，鼠源性单抗仍占其中较大比重。鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体(human anti mouseantibody，HAMA)反应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用(Dhar et al.，2004)。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为mAb研究的重点。随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。

[0005] 目前，抗体的应用经历了从非人源抗体到人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。人鼠嵌合抗体的实质是将鼠源性单抗的抗原结合活性保留下来，并在此基础上尽可能地消除鼠源化部分并用人源化片断取而代之；降低了免疫原性，减轻单抗异源性产生的排斥反应，又能同时维持亲本抗体特异性结合抗原的能力。但是人鼠嵌合抗体的鼠源性仍然高达30％左右，还是容易引HAMA反应。为减少鼠源成分，人们进一步用人的FR替代鼠FR，形成更为完全的人源化抗体，即除了3个CDR是鼠源的外，其余全部是人源结构，又称CDR移植抗体(CDR grafted antibody)或改型抗体(reshaped antibody)。由于人源化抗体(CDR移植抗体)内还含有10％以上的鼠源蛋白，因而在临床应用时，仍然存在一些免疫排斥反应,没有达到治疗性抗体发展的最终目标——抗体完全人源化。

[0006] 从鼠源到全人源，单抗在患者体内人抗鼠免疫反应发生概率逐步降低，治疗效果和安全性逐步提高，因此全人源单抗是单抗发展的趋势。目前有部分抗狂犬病病毒特异性的mAbs进入临床研究阶段的报道，但至今仍没有此类药物被批准上市。因此，本领域迫切需要开发具有高亲和力的完全人源化的抗狂犬病病毒抗体，用于替代血清制品，以满足对于严重暴露者进行被动免疫治疗的需要。

发明内容

[0007] 为了弥补现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种用于诊断和/或治疗的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体，该抗体具有降低患者免疫反应的可能性，并且具有利于治疗目的的药理学性质，具有高效和安全的特点。

[0008] 本发明的目的之二在于提供上述抗体的重链、轻链或其片段。

[0009] 本发明的目的之三在于提供编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或其片段，以及并入这些核酸分子以用于重组表达上述抗体的表达载体和宿主细胞。

[0010] 本发明的目的之四在于提供上述抗体的制备方法和用途。

[0011] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

[0012] 本发明提供了一种全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

[0013] 重链CDR1具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

[0014] 重链CDR2具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

[0015] 重链CDR3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

[0016] 轻链CDR1具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

[0017] 轻链CDR2具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

[0018] 轻链CDR3具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。

[0019] 优选地，重链CDR1具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；重链CDR3具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；重链CDR3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；轻链CDR1具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；轻链CDR2具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；轻链CDR3具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

[0020] 具有上述优选序列的本发明的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体命名为TRN073。

[0021] 进一步，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。

[0022] 优选地，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

[0023] 包括优选抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本发明的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体结合性质和中和性质的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。

[0024] 本发明的抗体还包括人源与非人源抗体，以及具有与TRN073抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。

[0025] 进一步，所述抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链抗体。

[0026] Fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。

[0027] Fab’是指包含了部分铰链区的Fab片段。

[0028] F(ab’)2指的是Fab’的二聚体。

[0029] Fv指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。

[0030] 单链抗体指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。

[0031] 本发明的公开的抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强的抗体免疫原性，或者由于改变了抗原结合而改变抗体的药物动力学。

[0032] 本发明的抗体可以被设计为在Fc区域内包含修改，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。

[0033] 发明还提供了编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子，所述核酸分子包括编码抗体重链可变区的核苷酸序列或编码抗体轻链可变区的核苷酸序列。

[0034] 本发明的编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子包括具有上述优选的核苷酸序列的保守核苷酸序列变体的核酸分子。所谓的保守核苷酸序列变体源于遗传密码简并和沉默的变体，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在内。

[0035] 本发明还提供了前面所述的核酸分子的DNA片段。所述DNA片段编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的功能性片段。

[0036] 本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包括前面所述的核酸分子，此外，还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。

[0037] 本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

[0038] 在本发明的具体实施方案中，所述载体是pCDNA3.3。

[0039] 本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞内含有前面所述的核酸分子或前面所述的表达载体。

[0040] 本发明中“宿主细胞”一词指的是导入核酸分子或载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。

[0041] 在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选293细胞。

[0042] 本发明还提供了一种狂犬病毒检测产品，所述检测产品包括本发明的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段。

[0043] 所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是能够检测出狂犬病毒的检测产品均包括在本发明的范围之内。

[0044] 本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。

[0045] 进一步，所述药物组合物还包括可药用载体或稀释剂。可以用任何适当的药用载体施用根据本发明的药物组合物用于治疗。

[0046] 本发明还提供了一种非诊断目的的检测狂犬病毒水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

[0047] (1)获得狂犬病毒的样品；

[0048] (2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段的接触；

[0049] (3)检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。

[0050] 本发明还提供了一种前面所述的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0051] (1)分离注射狂犬疫苗的人静脉血中的单个核细胞，之后利用流式细胞术进行细胞分选，PBMC分选获得具有CD3－，CD14－，CD16－，CD19+，CD27+的单个B细胞；

[0052] (2)利用单细胞RT－PCR扩增步骤(1)获得的单个B细胞中的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段；

[0053] (3)将步骤(2)获得的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段融合到含有人类抗体恒定区的表达载体中形成重组表达载体，之后导入宿主细胞表达；

[0054] (4)抗体筛选平台筛选获得具有结合活性和中和活性的本发明的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体。

[0055] 本发明还提供了前面所述的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段在制备狂犬病毒检测产品中的应用。

[0056] 所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段在制备狂犬病毒检测产品均包括在本发明的范围之内。

[0057] 本发明还提供了前面所述的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段在制备抑制狂犬病毒的药物中的应用。

[0058] 本发明还提供了前面所述的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段在制备治疗由狂犬病毒感染引起的疾病的药物制剂中的应用。

[0059] 进一步，所述疾病是狂犬病。

[0060] 本发明的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段可以以化学方法或者通过基因工程与其他因子缀合。这些因子提供将抗体靶向所需功能位点的作用或者为抗体提高或提供其他性能。

[0061] 根据本发明的全人源抗狂犬病毒的抗体可以以化学方法或者通过基因工程标记，以提供可检测的抗体。

[0062] 本发明的“治疗”意在包括为受治疗者施用全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体，其目的包括预防、改善、治疗狂犬病毒介导的疾病。

[0063] 本发明的“治疗有效量”是指对狂犬病毒介导事件的有害影响至少有所改善的水平。本领域技术人员能很容易地确定该全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体的给药量和方案。

[0064] 利用RT-PCR与抗体筛平台制备的全人源抗狂犬病毒中和抗体，可以高效中和狂犬病毒，具有抗感染作用，起到紧急预防和治疗的作用。

[0065] 本发明的抗体还可用于制备狂犬病毒检测试剂，发现有效中和抗原表位及开发狂犬病毒重组蛋白及亚单位疫苗。

附图说明

[0066] 图1显示利用流式细胞仪分选获得单个的B细胞；

[0067] 图2显示利用SDS-PAGE鉴定表达纯化后的TRN073抗体；

[0068] 图3显示利用ELISA检测TRN073抗体的结合活性。

具体实施方式

[0069] 下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

[0070] 实施例1全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体TRN073的制备

[0071] 1.记忆性B细胞分选

[0072] 选取2名健康志愿者注射狂犬疫苗(诺华，批号：1928)，全程免疫后的第7d(第28d)均空腹抽血100mL，并用ELISA检测其狂犬病毒抗体IgG为阳性结果。然后将抗凝全血样本用Ficoll淋巴细胞分离液分离得人外周血单个核细胞(PBMC)，利用BD FACSria流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose，CA)从PBMC分选获得具有CD3－，CD14－，CD16－，CD19+，CD27+的单个B细胞，结果如图1所示。将分选获得单个B细胞置于含有RT反应体系的96孔PCR板中，使每个孔含有一个记忆性B细胞，PCR板-80℃冻存备用。

[0073] 2.反转录合成cDNA链

[0074] 在计数有单个细胞的微孔中每孔加入0.5μM的各亚型重链与轻链的恒定区引物与SuprescriptⅢ反转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，37℃孵育60min，产物cDNA-20℃保存。完成反转录合成cDNA第一条链。

[0075] 3.PCR分离扩增抗体基因

[0076] 采用巢式PCR方法，以逆转录产物(cDNA)为模板，加入HotStarTaq Plus酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)、dNTPs及0.5μM的各亚型重链与轻链抗体的特异性引物，PCR反应条件为：预变性95℃5min；95℃×30s，55℃×60s，72℃×90s，35次循环；72℃延伸7min。1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

[0077] 4.重组抗体的表达载体的构建

[0078] 用特异性引物获取ELISA检测为阳性的抗体重链与轻链基因片段(包括可变区和恒定区)，利用TA克隆的方法分别将重链和轻链基因链接到pcDNA3.3载体上，将连接产物转化DH5α感受态细菌中，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上37℃、5％CO2培养过夜，随即挑取单菌落用特异性引物进行PCR鉴定(PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min40s，28个循环，最后72℃再延伸5min)，取2μLPCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测后，选取PCR鉴定为阳性的菌落进行基因测序，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链和轻链基因的转化子。

[0079] 5.直接竞争ELISA检测目的基因的表达

[0080] 采用脂质体法将配对的重链与轻链基因的质粒共转染293T细胞，操作步骤按PolyFect(Qiagen，Valencia，CA)转染试剂盒说明书进行。细胞上清采用直接竞争ELISA检测目的基因表达的抗体。步骤如下：以狂犬疫苗为抗原，并用包被液将抗原10倍稀释后包被96孔ELISA板，每孔100μL，4℃过夜包被，用封闭液常温封闭2个小时。将100μl的瞬时转染上清作为一抗常温孵育2个小时，用HRP标记的羊抗人IgG(1:2000稀释)作为二抗常温孵育1个小时，加入底物显色液100μl/孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸钠中止反应，用450nm/
630nm波长进行比色。

[0081] 6.抗体中和实验(快速荧光灶抑制实验法，RFFIT)

[0082] 用WHO推荐的快速荧光灶抑制实验法(RFFIT)检测筛选到有活性的抗体与狂犬病毒的中和活性，阳性对照为商业化抗狂犬病毒血清标准品(240IU/ml)。将系列稀释的抗体及抗病毒血清标准品与100TCID50狂犬病毒(CVS株)于96孔培养板中混均，37℃孵育1小时，然后加入BSR细胞，放37℃培养24小时，于48小时进行染色观察。PBS洗两次，加入80％丙酮，4℃孵育15min后，PBS洗一次晾干后，每孔加入100μlFITC标记的抗体。37℃孵育1h，PBS洗2次，荧光显微镜蓝色激光激发观察。将具有中和活性的抗体命名为TRN073。

[0083] 7.抗体大量表达与纯化

[0084] 将含有TRN073抗体重链可变区核苷酸序列的表达载体(重链可变区核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)和含有TRN073抗体轻链可变区核苷酸序列的表达载体(抗体轻链可变区核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)在大肠杆菌DH5α中大量扩增，将上述表达载体转染进入在175cm2细胞培养瓶中培养的293细胞中，转染后6-8小时换含有2％FCS新鲜培养基，并在37℃5％CO2培养箱中培养72小时。收集转染上清，4000rpm离心1小时，利用蛋白(Protein)A亲和层析法进行纯化。利用SDS-PAGE检验抗体TRN073的表达及纯化情况，结果见图2，证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻、重链。

[0085] 实施例2TRN073抗体结合活性检测

[0086] 用前文提到的相同的ELISA方法对表达纯化的抗体的结合活性进行检测：以狂犬疫苗为抗原，并用包被液将抗原10倍稀释后包被ELISA 96孔板，每孔100μL4℃过夜包被，并用封闭液常温封闭2个小时。将起始浓度为100μg/ml TRN073抗体上清稀释10倍后作为一抗进行系列稀释，加一抗常温孵育2个小时，同时用未转染的细胞上清作为阴性抗体对照，用HRP标记的羊抗人IgG(1:2000稀释)作为二抗常温孵育1个小时，加入底物显色液100μl/孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸钠中止反应，用450nm/630nm波长进行比色，[0087] 结果如图3显示，把表达纯化的抗体TRN073进行大于50，000倍稀释后(抗体浓度约为：0.0025μg/ml)，TRN073抗体依然可以与抗原有结合。

[0088] 实施例3TRN073抗体结合特异性检测

[0089] (1)与狂犬病毒G蛋白(rabies virus G protein，RVG)的结合

[0090] 步骤：是狂犬病毒的主要保护性抗原，可以刺激机体产生中和抗体，将RVG的基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，用PolyFect(Qiagen，Valencia，CA)转染试剂转染293T细胞，取1×105转染后48～72小时的293T细胞，300×g离心10min，去上清，加入10μL商业化人抗狂犬病毒血清或抗体TRN073，并用表达的其他人源单克隆抗体作为阴性对照，4℃染色孵育45min后用PBS洗两次，然后加入FITC标记的羊抗人IgG抗体，4℃染色孵育30min后PBS洗两次，用BD FACSria流式细胞仪进行分析。

[0091] 结果说明抗体TRN073是狂犬病毒G蛋白特异性的有功能的抗体。

[0092] (2)与灭活狂犬病病毒CVS株的结合

[0093] 步骤：用前文提到的相同的斑点杂交方法对表达纯化的抗体的特异性进行检测：PVDF膜用甲醇活化后，分别滴加2μL灭活的TCID50狂犬病毒(CVS株)、293T细胞裂解物，室温干燥后封闭液封闭1h；分别与1：2000稀释的单抗以及293T上清、封闭液孵育2h；洗涤后加入
1：2000稀释HRP标记的羊抗人IgG抗体孵育1h；DAB显色。

[0094] 结果表明TRN073能100％与灭活狂犬病病毒CVS株特异性结合，而与培养该抗体的293T细胞裂解物无反应，相同实验条件下对照均成立。

[0095] 实施例4TRN073抗体中和活性检测

[0096] 步骤：用前文提到的WHO推荐的快速荧光灶抑制实验法(RFFIT)对表达纯化的抗体的中和病毒活性进行检测，并根据Reed&Muench法计算抗体保护效价(单位为IU/ml)。

[0097] 结果：抗体TRN073(3.8mg/ml)其保护效价约为1700IU/ml，说明表达的重组抗体TRN073是高纯度的具有狂犬病毒中和活性的全人源单克隆抗体。

[0098] 虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。