基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备及表征

摘要

本发明公开了基于硫醇‑烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备及表征。该制备方法通过先分别合成巯基化的脂肪酸和带有双键的肝素‑烯丙基结合物两类化合物，再利用硫醇‑烯点击化学使巯基化脂肪酸中的巯基与肝素‑烯丙基结合物中的双键反应而将脂肪酸连接到肝素结构上，从而制备得到不同长链饱和脂肪酸修饰的脂肪酸化肝素结合物。并公开了使用核磁氢谱检测、抗Xa活性测定、元素分析、粒度分析和凝胶渗透色谱分子量测定对脂肪酸化肝素进行表征。本发明首次根据硫醇‑烯点击化学反应的优点和特色，将长链饱和脂肪酸应用于肝素结构修饰中，并保留了肝素的抗凝活性，为肝素的修饰提供了新的思路，对研究开发新的长效肝素类抗凝药物有着重要意义。

权利要求

1.基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)取结构式为 的化合物1中的月桂酸或肉豆蔻酸或软脂酸的一种与胱胺

在碱性条件下，发生酰化反应，生成化合物2a

n＝10或12或14；

或取结构式为 的化合物1中的硬脂酸或花生酸的一种与胱胺

在碱性条件下，发生酰化反应，生成化合物2b

n＝16或18；

2)将化合物2a或2b的二硫键还原，生成化合物3 n＝10或12或14

或16或18；

3)将结构式为 的烯丙基缩水甘油醚与肝素在氢氧化钠的碱性条件

下，发生环氧乙烷的开环反应，生成化合物4；

其中肝素的结构式为 M、N为肝素结构中其它多

糖序列；

化合物4的结构式为 M、N为肝素结构中其它

多糖序列；

4)将一种化合物3和化合物4在硫醇-烯点击化学的基础上进行点击反应，生成化合物

5，即基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素。

2.根据权利要求1所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)化合物2a的制备：称取一种n＝10或12或14的化合物1和摩尔量相当于化合物1摩尔量1倍的卡特缩合剂，加入按mL计体积相当于按g计的化合物1质量15～20倍的N’N-二甲基甲酰胺，搅拌溶解后加入摩尔量相当于化合物1摩尔量3倍的N’N-二异丙基乙胺，混合并搅拌10min，最后滴加摩尔量相当于化合物1摩尔量0.55倍已除盐的游离形式的胱胺，常温下搅拌反应8h，薄层色谱法检测脂肪酸反应完全，接着往反应溶液中加入5倍体积的水，析出固体，过滤，收集固体并在70℃乙醇中加热溶解，再沉淀，再次过滤，干燥得到白色固体，即得化合物2a；

2)化合物2b的制备：n＝16的化合物1中的硬脂酸与胱胺的反应与化合物2a的合成方法相同，其最终得到的产物为化合物2b；n＝18的化合物1中的花生酸与胱胺反应采用固相合成法合成，操作步骤如下：①先取2-氯三苯甲基氯树脂于固相反应器中，二氯甲烷用作反应溶剂，按mL计的二氯甲烷体积与按g计的树脂质量的体积质量比不小于10，加入摩尔量相当于按mmol计的树脂取代量4倍的已除盐的游离形式的胱胺，和摩尔量相当于按mmol计的树脂取代量6倍的N’N-二异丙基乙胺，放于摇摆机上摇摆反应2～3h；②抽去反应液，二氯甲烷洗5～8次，茚三酮检测树脂呈蓝黑色；③检测结束后，用20％的甲醇/二氯甲烷溶液反应2h；

④抽去反应液，二氯甲烷洗5～8次，加入二氯甲烷溶解好的摩尔量均相当于按mmol计的树脂取代量1.2倍的花生酸和卡特缩合剂，其中按mL计的二氯甲烷体积与按g计的花生酸质量的体积质量比在15～20之间，最后加入摩尔量相当于按mmol计的树脂取代量4倍的N’N-二异丙基乙胺，摇摆反应2～3h，至茚三酮检测颜色为黄色；⑤抽去反应液，并用二氯甲烷洗5～8次，然后用5％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液裂解3次，每次半小时；⑥裂解液浓缩，得到黄色粘稠状固体，即为化合物2b；

3)化合物3的制备：把化合物2a或2b用四氢呋喃搅拌溶解，再用水溶解摩尔量相当于化合物2a或2b摩尔量1.1倍的二硫键还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐，加入四氢呋喃溶液中混合，调节四氢呋喃和水的比例，使溶液澄清，搅拌反应4-6h，至薄层色谱法检测反应完全，反应液减压浓缩除去四氢呋喃，浓缩后用0.01～1mol/L HCl溶液调节pH为3，二氯甲烷萃取，水洗，通氩气，封口干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到化合物3，即巯基化的脂肪酸；

4)化合物4的制备：取效价为198.9u/mg的肝素钠，加入0.1mol/L的氢氧化钠水溶液溶解，得到肝素钠反应液，其中肝素钠质量浓度分别为4％、8％，再分别加入5组不同物质的量的烯丙基缩水甘油醚，按顺序编号，-80℃下预冻，然后冷冻干燥48～72h，冻干后用水溶解，再用0.01～1mol/L HCl溶液中和至pH为中性，接着加入5倍体积的乙醇沉淀，振摇后再离心，倒去上清液，如此反复3次，干燥，得到化合物4，其中5组烯丙基缩水甘油醚物质的量分别为肝素钠伯醇基的1～5倍；

5)化合物5的制备：化合物4用水溶解，化合物3用四氢呋喃溶解，两者溶液混合，然后以安息香二甲醚为光引发剂，在365nm紫外灯下照射反应36～48h，至Ellman试剂检测黄色消失，将反应液放入带有冷阱的真空干燥箱中抽干，抽干后的固体先用二氯甲烷洗3次，再乙酸乙酯洗3次，最后用甲醇洗3次，洗完后抽干，抽干得到的白色固体加10mL水搅拌溶解，将得到的澄清液放于-80℃冰箱预冻，然后冷冻干燥48～72h，得到化合物5，其中化合物3物质的量相当于肝素伯醇羟基的1.3倍，安息香二甲醚物质的量相当于肝素伯醇羟基的0.2倍。

3.根据权利要求2所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，其特征在于：步骤1)中胱胺的除盐方法为：先用质量浓度为20～50％的氢氧化钠水溶液溶解胱胺二盐酸盐，保证溶液pH在9～10之间，然后用二氯甲烷萃取，至水层用茚三酮检测显示无胱胺后萃取结束，把二氯甲烷层干燥，浓缩，得到黄色液体，即为游离胱胺，氩气保护，置于-20℃保存，待用时取出。

4.根据权利要求2所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，其特征在于：步骤2)中所用2-氯三苯甲基氯树脂的取代率为1.1mmol/g。

5.根据权利要求2所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，其特征在于：步骤4)中得到的肝素-烯丙基结合物要先进行核磁表征，再通过抗Xa活性测定后使用。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法制备得到的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素。

说明书

基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备及表征

技术领域

[0001] 本发明涉及基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备及表征，属于生物医药领域。

背景技术

[0002] 药物的脂肪酸化是指利用脂肪酸(饱和/不饱和)对药物进行修饰，以改良药物的某些性质，更好的满足临床需求。目前有关脂肪酸修饰药物的研究还不是很多，已有的一些研究主要集中在蛋白多肽类药物修饰方面。利用脂肪酸修饰蛋白多肽类药物可有效延长它们在体内的半衰期，此外，与其他修饰剂相比，脂肪酸是构成细胞膜磷脂及人体脂肪与类脂的重要成分，直接参与了细胞膜的组成以及蛋白质配体与膜受体的结合，因此脂肪酸修饰更有助于提高药物的脂溶性、肠道黏膜透过性及吸收效率。

[0003] 已有一些利用饱和脂肪酸进行修饰且获批上市用于临床的药物，例如丹麦诺和诺德公司生产的地特胰岛素(detemir,Levemir)和利拉鲁肽(liraglutide,Victoza)。地特胰岛素是将人胰岛素B链30位上的苏氨酸去除后在29位的赖氨酸上连接一个肉豆蔻酸侧链而成，在经皮下注射给药后，其结构中的肉豆蔻酸侧链能有效促进胰岛素形成六聚体并与血浆白蛋白发生可逆性结合，从而减缓了在体内的扩散速度，半衰期由原来的10min延长到了10.2h，同时药效可保持一天，达到长效降糖的作用【Asias B D,Stock E M,Small N L,et al.Clinical and financial outcomes of switching insulin glargine to insulin detemir in a veteran population with type 2 diabetes[J].Journal of Diabetes&Metabolic Disorders,2014,14(1):1-6】。利拉鲁肽是将人胰高糖素样肽-1(GLP-1)第34位的赖氨酸替换为精氨酸，同时在第26位赖氨酸上引入一个由谷氨酸介导的碳十六软脂酸侧链，这样的结构改变带来的结果是利拉鲁肽可以从皮下组织缓慢吸收，不易被体内相应的酶降解，其半衰期由之前的2min延长到13个小时，降糖作用可以持续24小时【
A.Liraglutide  therapy for type  2diabetes:overcoming unmet needs[J]
.Pharmaceuticals,2010,3(3):764-781】。

[0004] 脂肪酸修饰多肽类药物的成功给药物的修饰提供了一种新的方案，说明用脂肪酸对药物进行修饰改性是具有一定应用前景的。随着研究的不断深入，脂肪酸修饰将会用在越来越多的药物优化方面，可以基于已上市药物的研究经验，开发其他药物脂肪酸修饰位点，得到新的具有长效稳定性的药物。

[0005] 点击化学是由诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless于2001年提出的一个概念，就是把化学反应的过程形象地描述为像点击鼠标一样简单、高效、便捷、可控，它是利用少数近乎完美的反应，通过有效和模块化的途径合成多样化的化合物。硫醇-烯点击化学是点击化学的一种特殊形式，它以光引发自由基反应为催化介质，充分将光引发过程的优点和传统的点击反应的优点相结合，在巯基和双键之间发生反应，具有高度的选择性，并可与多种化学合成方法交互使用，成为有机材料制备的又一重要途径。

[0006] 硫醇-烯点击化学的自由基反应机理主要分为以下几个阶段：引发剂在光照或者热的条件下吸收光子被激发，裂解形成自由基；自由基夺取巯基上的一个氢原子，产生巯基自由基；巯基自由基进攻碳碳双键，活性中心转移，产生烷基自由基；烷基自由基夺取巯基化合物上巯基的氢原子，再次产生巯基自由基，进入循环。其中第二步产生的巯基自由基可引发链增长也可以发生双基终止【Reddy S K,Cramer N B,Brien A K O,et al.Rate mechanisms of a novel  thiol-ene  photopolymerization  reaction[J].Macromolecular Symposia,2004,206(1):361–374】。作为一种新型高效的点击化学，硫醇-烯点击化学与其他需要金属催化的点击化学反应相比具有高效、高选择性、应用范围广等优点，并且避免了使用有毒金属作为催化剂，是无金属催化的点击化学中最简单的一种反应。正是因为上述优点，硫醇-烯点击化学已在药物、高分子、功能材料、表面改性等诸多领域获得了广泛的应用。

[0007] 肝素(Heparin)是一种天然来源的、结构异常复杂、成分不均一的多糖类化合物，主要是由硫酸-D-葡萄糖胺、硫酸-D-艾杜糖醛酸D-葡萄糖醛酸中两种双糖单位交替连接而成，分子量在3000～30000Da之间，由于一定数目的6位无硫酸化的葡萄糖胺及硫酸化的葡萄糖醛酸的存在，使肝素中出现了10种不同的单糖(4种糖醛酸和6种葡萄糖胺)，从而使得肝素的整个结构变得异常复杂，到目前为止，肝素的精细结构还不是很清楚【Mulloy B,Khan S,Perkins S J.Molecular architecture of heparin and heparin sulfate:recent developments in solution structural studies[J].Pure&Applied Chemistry,
2011,84(1):65-76】。肝素的主要生理功能是抗凝血，它在体内和体外均具有很强的抗凝血活性。肝素抑制血液凝固的功能是多方面的，目前医学界普遍认为肝素的抗凝血机制是与抗凝血酶III(ATIII)密切相关的。在肝素存在的条件下，其结构中的特定的五糖序列(6-O-S-D-葡糖胺-D-葡萄糖醛酸-N-S-3-O-S-6-O-S-D-葡糖胺-2-O-S-L-艾杜糖醛酸-N-S-6-S-D-葡糖胺)能够与ATIII特异性的结合，激活ATIII的构象，使ATIII的活性部位由一个部分埋藏的构象转化为一个完全暴露的构象，改变后的结构可以大大提高ATIII与凝血酶Xa和IIa的反应速度，加速凝血酶的失活，从而能够有效的抑制血凝过程，这也正是肝素被用作抗凝药物的主要原因【Desai U R,Petitou M,Bjork I,et al.Mechanism of heparin activation of antithrombin:evidence for an induced-fit model of allosteric activation involving two interaction subsites[J].Biochemistry,1998,37(37):
13033-13041】。

[0008] 肝素作为一种主要的抗凝和抗血栓药物，临床使用已有近80年的历史，至今尚未有替代品，它相比其他抗凝剂的最大优势在于起效快、抗凝效果显著、临床应用经验丰富。但普通肝素由于半衰期较短、皮下注射生物利用度低，需要连续静脉注射，给患者带去了较大的痛苦；普通肝素还具有易引起出血、诱导血小板减少等副作用；此外，肝素由于结构复杂，分子量大小不均一的特点，使得药代动力学难以预测，所以在临床使用中需要进行抗凝监测以控制剂量，这些缺点都在一定程度上限制了肝素的应用【Francis J L,Groce J B.Challenges in variation and responsiveness of unfractionated heparin.[J].Pharmacotherapy the Journal of Human Pharmacology&Drug Therapy,2004,24(2):
108S–119S】。因此通过不同方法寻找出半衰期长、副作用小、抗凝效果明确的新型抗凝药物就显示出了它的重要性与优越性。

[0009] 低分子量肝素便是一类由普通肝素经过物理、化学或酶法分离解聚而得到的一类半衰期延长的肝素类抗凝药物。低分子量肝素由于其分子量较小，不易与血浆和细胞蛋白相互作用，具有皮下注射吸收较好、生物利用度高、出血等副作用小等优点，半衰期也延长至4h左右。例如：法国安万特公司生产的依诺肝素钠，它是以肝素钠为原料，经过碱性β-消除法制得的一种低分子量肝素，平均分子量为4200Da，血浆半衰期为4.1h，生物利用度可达90％，是临床使用范围最广的一种低分子量肝素；美国辉瑞公司的达肝素钠则是通过亚硝酸降解法对普通肝素进行降解得到的一种低分子量肝素，平均分子量为6000Da，其静脉注射半衰期约为2h，皮下注射半衰期为3～4h，较普通肝素也有着更小的副作用和更高的生物利用度。除了对肝素进行降解得到的半衰期延长、生物利用度提高的低分子量肝素外，还有一种肝素类抗凝药物，它便是化学全合成的肝素特定的五糖序列类似物磺达肝素。磺达肝素是继肝素和低分子量肝素后，由FDA批准的可用于预防和治疗多种动静脉血栓的又一种肝素类抗凝药物，其半衰期可达17h且生物利用度也可达到100％【Weitz D S,Weitz J I.Update on heparin:what do we need to know？[J].Journal of Thrombosis&Thrombolysis,2010,29(2):199-207】。这些经肝素降解或化学全合成得到肝素类抗凝药物相比普通肝素在体内半衰期和生物利用度方面都有了一定的改进。

[0010] 低分子量肝素和化学全合成的肝素类药物作为新的抗凝药物现已被应用于越来越多的治疗领域，它们都在不同程度上克服了普通肝素半衰期较短和生物利用度低等缺点。但是低分子量肝素每天仍需要注射2次，患者顺应性较差；此外，低分子量肝素的生产技术需要严格控制，以免在分离解聚过程中引入异物或使肝素的抗凝活性位点改变甚至消失；不同降解方法的得到的产品特点不同，质量不稳定，并且在临床上也不能相互代替，需要进行不同的研究试验【Fareed J,Jeske W,Fareed D,et al.Are all low molecular weight heparins equivalent in the management of venous thromboembolism？[J].Clinical&Applied Thrombosis/hemostasis Official Journal of the International Academy of Clinical&Applied Thrombosis/hemostasis,2008,14(4):385-392】，所以低分子量肝素的研究和应用还有很多问题需要解决和克服。磺达肝素虽然半衰期较低分子量肝素和普通肝素明显延长，并且生物利用度也达到了100％，但由于是化学全合成的药物，所以合成步骤复杂，使得其成为了最贵的肝素类抗凝药物；另外，磺达肝素目前在临床使用中还没有任何解毒剂，这些缺点在一定程度上限制了磺达肝素的应用。

[0011] 尽管通过降解肝素或化学全合成肝素特定五糖类似物的方法来获得半衰期延长、生物利用度提高的抗凝药物已经被证实是可行的，并且也有相应的产品获批用于临床，但由于它们各自存在的问题，这些低分子量肝素以及磺达肝素并没有成为理想的“更有效、更便捷”的抗凝和抗血栓药物，而且在一些治疗领域普通肝素仍然是首选药物。因此，本发明提供了一种新的肝素结构修饰方法，在不降解或破坏肝素基本结构的基础上对其进行修饰改性，对于研究开发新的具有长效潜力的肝素类抗凝药物有显著的优越性。本发明以普通肝素为原料，通过冷冻干燥的方法对肝素羟基进行修饰反应得到带双键的肝素-烯丙基结合物，再与巯基化的脂肪酸在硫醇-烯点击化学的基础上进行点击反应，从而得到脂肪酸化肝素结合物，并且有3种脂肪酸化肝素结合物基本保留了肝素的抗Xa活性，这对于之后的研究具有重要的价值和意义。

发明内容

[0012] 本发明的目的在于提供一种含双键的肝素-烯丙基结合物的温和的制备方法，以及运用硫醇-烯点击化学对肝素进行脂肪酸化修饰的方法。

[0013] 本发明的技术方案如下：

[0014] 基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素，结构式如下：

[0015]

[0016] 式中n＝10、12、14、16、18，

[0017]

[0018] 所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，包括以下步骤：

[0019] 1)取结构式为 (n＝10、12、14、16、18)的月桂酸、肉豆蔻酸、软脂酸、硬脂酸和花生酸五种不同的长链饱和脂肪酸与胱胺 在碱性条件下，发生酰化反应，生成结构式为 (n＝10、12、14)的化合物2a
和结构式为 (n＝16、18)的化合物2b；

[0020] 2)将化合物2a和2b的二硫键还原，生成结构式为 (n＝10、12、14、16、18)的化合物3；

[0021] 3) 将 结 构 式 为 的 烯 丙 基 缩 水 甘 油 醚 与 肝 素(M、N为肝素结构中其它多糖序列)在氢氧化钠的碱
性条件下，发生环氧乙烷的开环反应，生成结构式为
(M、N为肝素结构中其它多糖序列)的化合物4；

[0022] 4)将化合物3中的巯基和化合物4中的双键在硫醇-烯点击化学的基础上进行点击反应，生成化合物5，即基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素。

[0023] 所述的制备方法，具体包括如下步骤：

[0024] 1)化合物2a的制备：称取不同碳链长度的化合物1和摩尔量相当于化合物1摩尔量1倍的卡特缩合剂，加入体积相当于化合物1质量15～20倍的N’N二甲基甲酰胺，搅拌溶解后加入摩尔量相当于化合物1摩尔量3倍的N’N-二异丙基乙胺，混合并搅拌10min，最后滴加摩尔量相当于化合物1摩尔量0.55倍已除盐的游离形式的胱胺，常温下搅拌反应8h，至点板检测脂肪酸反应完全，接着往反应溶液中加入5倍体积的水，析出固体，过滤，收集固体并在70℃乙醇中加热溶解，再沉淀，再次过滤，干燥得到白色固体，即得化合物2a；

[0025] 2)化合物2b的制备：硬脂酸与胱胺的反应与化合物2a的合成方法相同，其最终得到的产物为化合物2b；花生酸与胱胺反应采用固相合成法合成，操作步骤如下：①先取2-氯三苯甲基氯树脂于固相反应器中，二氯甲烷用作反应溶剂且与树脂的体积质量比不小于10，加入摩尔量相当于树脂取代率4倍的已除盐的游离形式的胱胺，和摩尔量相当于树脂取代率6倍的N’N-二异丙基乙胺，放于摇摆机上摇摆反应2～3h；②抽去反应液，二氯甲烷洗5～8次，茚三酮检测树脂呈蓝黑色；③检测结束后，用20％的甲醇/二氯甲烷溶液进行封头反应2h；④抽去反应液，二氯甲烷洗5～8次，加入二氯甲烷溶解好的摩尔量均相当于树脂取代率1.2倍的花生酸和卡特缩合剂，其中二氯甲烷与花生酸的体积质量比在15～20之间，最后加入摩尔量相当于树脂取代率4倍的N’N-二异丙基乙胺，摇摆反应2～3h，至茚三酮检测颜色为黄色；⑤抽去反应液，并用二氯甲烷洗5～8次，然后用5％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液裂解3次，每次半小时；⑥裂解液浓缩，得到黄色粘稠状固体，即为化合物2b；

[0026] 3)化合物3的制备：把化合物2a或2b用四氢呋喃搅拌溶解，再用水溶解摩尔量相当于化合物2a或2b摩尔量1.1倍的二硫键还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐，加入四氢呋喃溶液中混合，调节四氢呋喃和水的比例，使溶液澄清，搅拌反应4-6h，至薄层色谱检测反应完全，反应液减压浓缩除去四氢呋喃，浓缩后用0.01～1mol/L HCl溶液调节pH为3，二氯甲烷萃取，水洗，通氩气，封口干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到化合物3，即五种巯基化的脂肪酸；

[0027] 4)化合物4的制备：取效价为198.9u/mg的肝素钠，加入0.1mol/L的氢氧化钠水溶液溶解，得到肝素钠反应液，其中肝素钠质量浓度分别为2％、4％和8％这三个浓度，再分别加入5组不同物质的量的烯丙基缩水甘油醚，按顺序编为1～15号，-80℃下预冻，然后冷冻干燥48～72h，冻干后用水溶解，再用0.01～1mol/L HCl溶液中和至pH为中性，接着加入5倍体积的乙醇沉淀，振摇后再离心，倒去上清液，如此反复3次，干燥，得到化合物4，其中5组烯丙基缩水甘油醚物质的量分别为肝素钠伯醇基的1～5倍；

[0028] 5)化合物5的制备：化合物4用水溶解，化合物3用四氢呋喃溶解，两者溶液混合，然后以安息香二甲醚为光引发剂，在365nm紫外灯下照射反应36～48h，至Ellman试剂检测黄色消失，将反应液放入带有冷肼的真空干燥箱中抽干，抽干后的固体先用二氯甲烷洗3次，再乙酸乙酯洗3次，最后用甲醇洗3次，洗完后抽干，抽干得到的白色固体加10mL水搅拌溶解，将得到的澄清液放于-80℃冰箱预冻，然后冷冻干燥48～72h，得到化合物5，其中化合物3物质的量相当于肝素伯醇羟基的1.3倍，安息香二甲醚物质的量相当于肝素伯醇羟基的
0.2倍。

[0029] 步骤1)中胱胺的除盐方法为：先用质量浓度为20～50％的氢氧化钠水溶液溶解胱胺二盐酸盐，保证溶液pH在9～10之间，然后用二氯甲烷萃取，至水层用茚三酮检测显示无胱胺后萃取结束，把二氯甲烷层干燥，浓缩，得到黄色液体，即为游离胱胺，氩气保护，置于-20℃保存，待用时取出。

[0030] 步骤2)中所用2-氯三苯甲基氯树脂的取代率为1.1mmol/g。

[0031] 步骤4)中得到的肝素-烯丙基结合物要先进行核磁表征，再通过抗Xa活性测定后使用。

[0032] 基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的表征，所述的表征包括核磁氢谱检测、抗Xa活性测定、元素分析、粒度分析和凝胶渗透色谱分子量测定。

[0033] 本发明的有益效果是：首次根据硫醇-烯点击化学反应的优点和特色，将长链饱和脂肪酸应用于肝素结构修饰中，并保留了肝素的抗凝活性，为肝素的修饰提供了新的思路，对研究开发新的长效肝素类抗凝药物有着重要意义。具体如下：

[0034] 本发明采用一种冷冻干燥的方法制备含双键的肝素-烯丙基结合物，得到的10种肝素-烯丙基结合物均保留了肝素大部分的活性，说明本发明采用的这种方法克服了肝素非常不稳定、不容易被修饰的困难，是肝素的结构修饰方面的重大突破。冷冻干燥法作为一种较温和的方法在今后其他大分子尤其是具有生物活性的多糖结构修饰中也具有良好的应用前景。

[0035] 本发明在硫醇-烯点击化学的基础上采用了5种不同长链饱和脂肪酸对肝素结构进行修饰，得到了50种脂肪酸化肝素结合物，通过抗Xa活性测定最终得到了3种活性保留较好的脂肪酸化肝素结合物，说明脂肪酸不仅可以用于蛋白多肽类药物的修饰，还可以用在多糖类化合物的修饰方面，扩展了脂肪酸修饰应用的范围，脂肪酸修饰对于那些半衰期较短、脂溶性较差的药物来说将有很大的吸引力。

[0036] 本发明首次采用四氢呋喃/水的两相溶剂体系进行硫醇-烯点击反应得到了脂肪酸化肝素结合物，为硫醇-烯点击化学的反应溶剂提供了更多的选择，对于今后硫醇-烯点击反应在药物合成、高分子材料制备和表面改性等领域的发展具有很大的促进意义。

附图说明

[0037] 图1为实施例1的步骤(1)中第①步合成的二硫键中间体的质谱图；

[0038] 图2为实施例1的步骤(1)中第②步合成的巯基化月桂酸的质谱图；

[0039] 图3为实施例1的步骤(1)中第②步合成的巯基化月桂酸的核磁共振氢谱图；

[0040] 图4为实施例2的步骤(1)中第①步合成的二硫键中间体的质谱图；

[0041] 图5为实施例2的步骤(1)中第②步合成的巯基化软脂酸的质谱图；

[0042] 图6为实施例2的步骤(1)中第②步合成的巯基化软脂酸的核磁共振氢谱图；

[0043] 图7为实施例3的步骤(1)中第①步合成的二硫键中间体的质谱图；

[0044] 图8为实施例3的步骤(1)中第②步合成的巯基化花生酸的质谱图；

[0045] 图9为实施例3的步骤(1)中第②步合成的巯基化花生酸的核磁共振氢谱图；

[0046] 图10为未修饰的肝素标准品的核磁共振氢谱图；

[0047] 图11为实施例1和2的步骤(2)中合成的肝素-烯丙基结合物的核磁共振氢谱图；

[0048] 图12为实施例1制备的由月桂酸修饰的脂肪酸化肝素结合物的核磁共振氢谱图；

[0049] 图13为实施例2制备的由软脂酸修饰的脂肪酸化肝素结合物的核磁共振氢谱图；

[0050] 图14为实施例3制备的由花生酸修饰的脂肪酸化肝素结合物的核磁共振氢谱图；

[0051] 图15为未修饰的肝素标准品吸光度的标准曲线；

[0052] 图16为葡聚糖标准品的凝胶渗透色谱(GPC)校正曲线；

[0053] 图17为未修饰的肝素标准品的GPC处理结果图；

[0054] 图18为实施例1制备的由月桂酸修饰的脂肪酸化肝素结合物的GPC处理结果图；

[0055] 图19为实施例2制备的由软脂酸修饰的脂肪酸化肝素结合物的GPC处理结果图；

[0056] 图20为实施例3制备的由花生酸修饰的脂肪酸化肝素结合物的GPC处理结果图。

具体实施方式

[0057] 基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，合成路线示意图如下：

[0058]

[0059] 上述合成示意图化合物5中n＝10、12、14、16、18，

[0060]

[0061] 结合上述合成线路图，所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，包括以下步骤：

[0062] 1)取结构式为 (n＝10、12、14、16、18)的月桂酸、肉豆蔻酸、软脂酸、硬脂酸和花生酸五种不同的长链饱和脂肪酸与胱胺 在碱性条件下，发生酰化反应，生成结构式为 (n＝10、12、14)的化合物2a
和结构式为 (n＝16、18)的化合物2b；

[0063] 2)将化合物2a和2b的二硫键还原，生成结构式为 (n＝10、12、14、16、18)的化合物3；

[0064] 3) 将 结 构 式 为 的 烯 丙 基 缩 水 甘 油 醚 与 肝 素(M、N为肝素结构中其它多糖序列)在氢氧化钠的碱
性条件下，发生环氧乙烷的开环反应，生成结构式为
(M、N为肝素结构中其它多糖序列)的化合物4；

[0065] 4)将化合物3中的巯基和化合物4中的双键在硫醇-烯点击化学的基础上进行点击反应，生成化合物5，即基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素。

[0066] 进一步的，所述的制备及表征方法，具体包括如下：

[0067] 1.脂肪酸化肝素结合物的制备：

[0068] 1)化合物2a的制备(以月桂酸为例)：取月桂酸和摩尔量相当于月桂酸摩尔量1倍的卡特缩合剂用N’N-二甲基甲酰胺搅拌溶解，其中N’N-二甲基甲酰胺与月桂酸的体积质量比控制在15～20之间，再加入摩尔量相当于月桂酸摩尔量3倍的N’N-二异丙基乙胺，混合均匀并搅拌10min左右，最后缓慢滴加摩尔量相当于月桂酸摩尔量0.55倍胱胺(已除盐的游离形式)，常温下搅拌反应8h，至点板检测脂肪酸反应完全，接着往反应溶液中加入约5倍体积的水，析出固体，过滤，收集固体并在70℃乙醇中加热溶解，再沉淀，再次过滤，干燥得到白色固体，即得化合物2a，肉豆蔻酸、软脂酸、硬脂酸与胱胺的反应条件及处理方法均同上；

[0069] 2)化合物2b的制备：硬脂酸与胱胺反应合成化合物2b其实是和化合物2a的合成方法一样，只不过由于硬脂酸的碳链较长，与胱胺反应难度增加，所以反应效果较差，最终得到的为化合物2b；花生酸与胱胺反应在上述条件下无法完成，最终采用固相合成法合成，具体操作：①先取2-氯三苯甲基氯树脂于固相反应器中，二氯甲烷用作反应溶剂且与树脂的体积质量比不小于10，加入摩尔量相当于树脂取代率4倍的胱胺(已除盐的游离形式)和摩尔量相当于树脂取代率6倍的N’N-二异丙基乙胺，放于摇摆机上摇摆反应2～3h，②抽去反应液，二氯甲烷洗5～8次，茚三酮检测树脂呈蓝黑色，说明胱胺的氨基已加到树脂上，③检测结束后，用20％的甲醇/二氯甲烷溶液进行封头反应2h，④抽去反应液，二氯甲烷洗5～8次，加入事先二氯甲烷溶解好的摩尔量均相当于树脂取代率1.2倍的花生酸和卡特缩合剂，其中二氯甲烷与花生酸的体积质量比在15～20之间，最后加入摩尔量相当于树脂取代率4倍的N’N-二异丙基乙胺，摇摆反应2～3h，至茚三酮检测颜色为黄色，⑤抽去反应液，并用二氯甲烷洗5～8次，然后用5％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液裂解3次，每次半小时，⑥裂解液浓缩，得到黄色粘稠状固体，即为化合物2b；

[0070] 3)化合物3的制备：把化合物2a或2b用四氢呋喃搅拌溶解，再用水溶解摩尔量相当于化合物2a或2b摩尔量1.1倍的二硫键还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐，加入四氢呋喃溶液中混匀，调节四氢呋喃和水的比例，尽量使溶液澄清，搅拌反应4-6h，至薄层色谱检测反应完全，反应液减压浓缩除去四氢呋喃(反应液浑浊则先过滤，滤液浓缩)，浓缩后用0.01～1mol/L HCl溶液调节pH约为3，二氯甲烷萃取，水洗，通氩气，封口干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到化合物3，即五种巯基化的脂肪酸；

[0071] 4)化合物4的制备：取效价为198.9u/mg的肝素钠，加入0.1mol/L的氢氧化钠水溶液溶解，得到肝素钠反应液，其中肝素钠质量浓度分别为2％、4％和8％这三个浓度，再分别加入5组不同物质的量的烯丙基缩水甘油醚，按顺序编为1～15号，-80℃下预冻，然后冷冻干燥48～72h，冻干后先少量水溶解，再用0.01～1mol/L HCl溶液中和至pH为中性，接着加入约5倍体积的乙醇沉淀，充分振摇后再离心，倒去上清液，如此反复3次，干燥，得到化合物4，其中5组烯丙基缩水甘油醚物质的量分别为肝素钠伯醇基的1～5倍；

[0072] 5)化合物5的制备：化合物4用水溶解，化合物3用四氢呋喃溶解，两者溶液混合，调节四氢呋喃和水的体积比例，使反应液澄清，然后以安息香二甲醚为光引发剂，在365nm紫外灯下照射反应36～48h，至Ellman试剂检测黄色基本消失，将反应液放入带有冷肼的真空干燥箱中抽干，抽干后的固体先用二氯甲烷洗3次，再乙酸乙酯洗3次，最后用甲醇洗3次，洗完后抽干，抽干得到的白色固体加10mL水搅拌溶解，发现有的澄清，有的浑浊，浑浊溶液再过滤一次可明显澄清，过滤收集到很少量的白色固体，经点板确定不是所要的目的产物，可以弃去，将得到的澄清液放于-80℃冰箱预冻，然后冷冻干燥48～72h，得到化合物5，其中化合物3物质的量相当于肝素伯醇羟基的1.3倍，安息香二甲醚物质的量相当于肝素伯醇羟基的0.2倍。

[0073] 步骤1)中胱胺的除盐方法为：先用质量浓度为20～50％的氢氧化钠水溶液溶解胱胺二盐酸盐，保证溶液pH在9～10之间，然后用二氯甲烷萃取，至水层用茚三酮检测显示无胱胺后萃取结束，把二氯甲烷层干燥，浓缩，得到黄色液体，即为游离胱胺，氩气保护，置于-20℃保存，待用时取出。

[0074] 优选的，步骤2)中所用2-氯三苯甲基氯树脂的取代率为1.1mmol/g。

[0075] 2.化合物4的核磁和抗Xa活性测试表征

[0076] 优选的，步骤4)中得到的肝素-烯丙基结合物要先进行核磁表征，再通过抗Xa活性测定后使用。

[0077] (1)核磁表征：在进行下一步的硫醇-烯点击反应制备化合物5之前，先对通过不同浓度肝素与不同当量烯丙基缩水甘油醚反应合成得到的化合物4即肝素-烯丙基结合物进行核磁表征。结果显示浓度为2％的肝素与烯丙基缩水甘油醚反应后的5个样品在核磁共振氢谱中没有出现烯丙基缩水甘油醚的烯基氢的信号(δH 5.98ppm，CH2＝CHCH2O-)，4％和8％浓度的肝素反应后的样品中出现烯基氢信号。说明2％浓度肝素与烯丙基缩水甘油醚没有反应成功，推测可能是由于肝素浓度低，加入的烯丙基缩水甘油醚的量很少，在冷冻干燥过程中又可能损失一部分，所以导致2％浓度的肝素与不同当量的烯丙基缩水甘油醚反应失败。

[0078] 步骤4)中得到的15种肝素-烯丙基结合物先进行核磁表征，确定修饰成功的只有4％和8％浓度的肝素，然后通过抗Xa活性测定确定这10种肝素-烯丙基结合物活性没有完全失活，因此可以用于下一步的反应。

[0079] (2)抗Xa活性测试：参考美国药典(USP36-NF31)中肝素钠抗Xa效价测定的生色底物法对烯丙基缩水甘油醚修饰成功的4％和8％浓度的肝素样品进行活性测试表征。生色底物法测定原理如下：

[0080] ◆肝素+抗凝血酶III→肝素·抗凝血酶III复合物

[0081] ◆肝素·抗凝血酶III复合物+Xa因子(过量)→肝素·抗凝血酶III·Xa因子+Xa因子(剩余)

[0082] ◆底物+H2O+Xa因子(剩余)→对硝基苯胺(pNA)+多肽

[0083] ◆底物是无色的，pNA是有色的。在405nm处测反应产物的吸光度，结合标准曲线即可算出肝素的效价。

[0084] 以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

[0085] 实施例1：月桂酸修饰的脂肪酸化肝素结合物的制备

[0086] (1)巯基化月桂酸(12碳)的制备：

[0087] ①含二硫键中间体的制备：取5g月桂酸(25mmol)和11g的卡特缩合剂(25mmol)用100mL的N’N-二甲基甲酰胺搅拌溶解；然后加入12.4mL的N’N二异丙基乙胺(75mmol)，混匀搅拌约10min；最后慢慢滴入1.8mL的胱胺(13.75mmol)，搅拌反应8h，至薄层色谱检测反应完全。反应液中加入约500mL的水，析出固体，过滤，收集固体并在70℃乙醇中加热溶解，再沉淀，再次过滤，干燥得到白色固体，即得含二硫键的中间体(化合物2a,n＝10)，质量5.2g，产率80.5％，其质谱如附图1所示。

[0088] ②巯基化月桂酸的制备：把5.16g(10mmol)上一步中得到的化合物2a用四氢呋喃搅拌溶解；再用水溶解3.15g(11mmol)的二硫键还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐；将上述两种溶液混匀并适当调节四氢呋喃/水的体积比，保证反应液尽量澄清，搅拌反应4-6h，至薄层色谱检测反应液不再变化，反应液减压浓缩除去四氢呋喃(反应液浑浊则先过滤，滤液浓缩)，浓缩后用0.01mol/L HCl溶液调节pH约为3，二氯甲烷萃取3次，合并的二氯甲烷相再水洗3次，通氩气，封口无水硫酸镁干燥2h，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到白色固体，即巯基化的月桂酸(化合物3,n＝10)质量5.13g，产率98.9％。其质谱如附图2，核磁如附图3。

[0089] (2)肝素-烯丙基结合物的制备：称取1.6g(0.42mmol伯醇羟基计)效价为198.9u/mg的肝素钠，加入20mL 0.1mol/L的氢氧化钠水溶液溶解，得到8％浓度的肝素反应液；再加入200μL(1.68mmol)的烯丙基缩水甘油醚，振摇混匀后放入-80℃冰箱中预冻，然后冷冻干燥60h；冻干后取出先用10mL水溶解，再用0.1mol/L HCl溶液中和至pH为中性，接着加入约50mL的乙醇沉淀，充分振摇后再离心，倒去上清液，如此反复3次，干燥，得到肝素-烯丙基结合物(化合物4)。

[0090] (3)月桂酸修饰的脂肪酸化肝素的制备：将1g的化合物4用水溶解；取巯基化的月桂酸88.9mg(0.34mmol)用适量四氢呋喃溶解，然后加入到上述水溶液中；调节四氢呋喃/水的体积比，使反应液尽可能澄清，最终四氢呋喃的体积在15～20mL范围内；最后加入13.5mg(0.05mmol)的光引发剂安息香二甲醚，在365nm紫外光下照射反应48h，至Ellman试剂检测反应完全；将反应液放入带有冷肼的真空干燥箱中抽干，抽干后的固体先用二氯甲烷洗3次，再乙酸乙酯洗3次，最后用甲醇洗3次，洗完后抽干；抽干得到的白色固体加10mL水振摇溶解，溶液有浑浊，过滤，过滤收集到很少量的白色固体，经点板确定不是所要的目的产物，可以弃去，将得到的澄清液放于-80℃冰箱预冻，然后冷冻干燥60h，得到月桂酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物(化合物5)。

[0091] 实施例2：软脂酸修饰的脂肪酸化肝素结合物的制备

[0092] (1)巯基化软脂酸(16碳)的制备：

[0093] ①含二硫键中间体的制备：取5g软脂酸(19.5mmol)和8.6g的卡特缩合剂(19.5mmol)用100mL的N’N-二甲基甲酰胺搅拌溶解；然后加入9.7mL的N’N-二异丙基乙胺(58.5mmol)，混匀搅拌约10min；最后慢慢滴入1.4mL的胱胺(10.7mmol)，搅拌反应8h，至薄层色谱检测反应完全。反应液中加入约500mL的水，析出固体，过滤，收集固体并在70℃乙醇中加热溶解，再沉淀，再次过滤，干燥得到白色固体，即得含二硫键的中间体(化合物2a,n＝14)，质量4.4g，产率71.8％，其质谱如附图4所示。

[0094] ②巯基化软脂酸的制备：将4g上一步中的化合物2a(6.4mmol)用四氢呋喃搅拌溶解；再用水溶解2.02g(7.04mmol)的二硫键还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐；将上述两种溶液混匀并适当调节四氢呋喃/水的体积比，保证反应液尽量澄清，搅拌反应4-6h，至薄层色谱检测反应液不再变化，反应液减压浓缩除去四氢呋喃(反应液浑浊则先过滤，滤液浓缩)，浓缩后用0.01mol/L HCl溶液调节pH约为3，二氯甲烷萃取3次，合并的二氯甲烷相再水洗3次，通氩气，封口无水硫酸镁干燥2h，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到白色固体，即巯基化的月桂酸(化合物3,n＝14)质量3.91g，产率96.9％。其质谱如附图5，核磁如附图6。

[0095] (2)肝素-烯丙基结合物的制备：称取1.6g(0.42mmol伯醇羟基计)效价为198.9u/mg的肝素钠，加入20mL 0.1mol/L的氢氧化钠水溶液溶解，得到8％浓度的肝素反应液；再加入200μL(1.68mmol)的烯丙基缩水甘油醚，振摇混匀后放入-80℃冰箱中预冻，然后冷冻干燥60h；冻干后取出先用10mL水溶解，再用0.1mol/L HCl溶液中和至pH为中性，接着加入约50mL的乙醇沉淀，充分振摇后再离心，倒去上清液，如此反复3次，干燥，得到肝素-烯丙基结合物(化合物4)。

[0096] (3)软脂酸修饰的脂肪酸化肝素的制备：将1g的化合物4用水溶解；取巯基化的软脂酸107.9mg(0.34mmol)用适量四氢呋喃溶解，然后加入到上述水溶液中；调节四氢呋喃/水的体积比，使反应液尽可能澄清，最终四氢呋喃的体积在15～20mL范围内；最后加入13.5mg(0.05mmol)的光引发剂安息香二甲醚，在365nm紫外光下照射反应48h，至Ellman试剂检测反应完全；将反应液放入带有冷肼的真空干燥箱中抽干，抽干后的固体先用二氯甲烷洗3次，再乙酸乙酯洗3次，最后用甲醇洗3次，洗完后抽干；抽干得到的白色固体加10mL水振摇溶解，溶液有浑浊，过滤，过滤收集到很少量的白色固体，经点板确定不是所要的目的产物，可以弃去，将得到的澄清液放于-80℃冰箱预冻，然后冷冻干燥60h，得到软脂酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物(化合物5)。

[0097] 实施例3：花生酸修饰的脂肪酸化肝素结合物的制备

[0098] 实施例3的制备方法与实施例2一样，除了将实施例2中的步骤(1)替换为：

[0099] (1)巯基化花生酸(20碳)的制备：

[0100] ①含二硫键中间体的制备：取10g取代率为1.1mmol/g的2-氯三苯甲基氯(CTC)树脂于固相反应器中，加入80mL的二氯甲烷作为反应溶剂；然后加入9.1mL的N’N-二异丙基乙胺(55mmol)和4.3mL的脱盐的胱胺(33mmol)，放于摇摆机上摇摆反应3h；抽去反应液，二氯甲烷洗5次，茚三酮检测树脂为蓝黑色，说明胱胺一头的氨基已加到树脂上；加入20％的甲醇/二氯甲烷溶液进行过剩树脂的封头反应2h，防止其与后续的脂肪酸发生缩合；抽去反应液，二氯甲烷洗5次；加入事先80mL二氯甲烷溶解好的3.78g(12.1mmol)的花生酸和5.35g(12.1mmol)的卡特缩合剂；最后加入5.5mL(33mmol)的N’N-二异丙基乙胺，放于摇摆机上摇摆反应3h，至茚三酮检测树脂为黄色；抽去反应液，二氯甲烷洗5次，5％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液裂解3次，每次半小时；裂解液浓缩，得到黄色粘稠状固体，即含二硫键中间体(化合物2b,n＝18)，称重5.16g，产率95.6％。其质谱如附图7。

[0101] ②巯基化花生酸的制备：将5g上一步中合成的化合物2b(11.2mmol)用四氢呋喃搅拌溶解；再用水溶解3.53g(12.3mmol)的二硫键还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐；将上述两种溶液混匀并适当调节四氢呋喃/水的体积比，保证反应液尽量澄清，搅拌反应4-6h，至薄层色谱检测反应液不再变化，反应液减压浓缩除去四氢呋喃(反应液浑浊则先过滤，滤液浓缩)，浓缩后用0.01mol/L HCl溶液调节pH约为3，二氯甲烷萃取3次，合并的二氯甲烷相再水洗3次，通氩气，封口无水硫酸镁干燥2h，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到白色固体，即巯基化的月桂酸(化合物3,n＝18)质量4.1g，产率98.6％。其质谱如附图8，核磁如附图9。

[0102] (2)花生酸修饰的脂肪酸化肝素结合物的制备：将巯基化的花生酸与实施例2中步骤(2)得到的化合物4用于实施例2中步骤(3)的反应即可获得花生酸修饰后脂肪酸化肝素结合物(化合物5)。

[0103] 下面对实施例中制备的肝素-烯丙基结合物、脂肪酸化肝素结合物的制备作进一步的效果表征。

[0104] 一、质谱检测

[0105] 取实施例1、2、3中的各中间体及目标产物脂肪酸化肝素结合物进行质谱或核磁共振氢谱检测，检测图谱如附图1～10所示通过图谱分析得知制备得到的各中间体和终产物均为期望合成的目标产物。

[0106] 图1为实施例1中步骤(1)下①合成的含二硫键中间体的质谱图。质谱中质荷比为517.3855为产物化合物2a(n＝10)的【M+H】峰，说明通过该方法得到了含二硫键的中间体化合物2a(n＝10)。由于最终需要的巯基化的脂肪酸，故该步只通过质谱检测判断能够得到含二硫键的中间体即可，并且杂质对下一步的反应并没影响，所以没做进一步的纯化处理，直接投入下一步还原二硫键的反应。

[0107] 图2为实施例1中步骤(1)下②合成的巯基化月桂酸的质谱图。质谱中质荷比为258.1894为巯基化月桂酸即化合物3(n＝10)的【M-H】峰。

[0108] 图3为实施例1中步骤(1)下②合成的巯基化月桂酸的核磁共振氢谱图，对图中信号进行归属分析：1H NMR(500MHz,CDCl3),δ5.90(s,1H,-CO-NH-),3.44(d,J＝6.2Hz,2H,-NH-CH2-),2.68(d,J＝8.3Hz,2H,-CH2-SH),2.20(s,2H,-CH2-CO-),1.63(s,2H,-CH2-),1.43(s,1H,-SH),1.26(s,16H,CH3-CH2-),0.88(s,3H,CH3-)，结合质谱与氢谱说明该化合物为巯基化的月桂酸。

[0109] 图4为实施例2中步骤(1)下①合成的含二硫键中间体的质谱图。质谱中质荷比为629.5113为产物化合物2a(n＝14)的【M+H】峰，图中可以看出其峰比较小，说明反应效果没有月桂酸效果好，存在着杂质，这可能与脂肪酸链越长在同样条件下反应越困难有关，由于并不影响下一步的二硫键还原反应，故没做进一步的纯化，直接投入下一步反应。

[0110] 图5为实施例2中步骤②合成的巯基化软脂酸的质谱图。质谱中质荷比为314.2523为巯基化软脂酸即化合物3(n＝14)的【M-H】峰。

[0111] 图6为实施例2中步骤(1)下②合成的巯基化软脂酸的核磁共振氢谱图，对图中信号进行归属分析：1H NMR(500MHz,CDCl3),δ5.91(s,1H,-CO-NH-),3.44(d,J＝6.3Hz,2H,-NH-CH2-),2.68(d,J＝8.4Hz,2H,-CH2-SH),2.19(s,2H,-CH2-CO-),1.63(s,2H,-CH2-),1.43(s,1H,-SH),1.25(s,24H,CH3-CH2-),0.88(s,3H,CH3-)，结合质谱与氢谱说明该化合物为巯基化的软脂酸。

[0112] 图7为实施例3中步骤(1)下①合成的含二硫键中间体的质谱图。质谱中质荷比为447.3437为产物化合物2b(n＝18)的【M+H】峰，图中可以看出在合成巯基化月桂酸和巯基化软脂酸的液相条件下很难反应的花生酸和胱胺在固相条件下可以很好的反应。

[0113] 图8为实施例1中步骤(1)下②合成的巯基化花生酸的质谱图。质谱中质荷比为370.3151为巯基化花生酸即化合物3(n＝18)的【M-H】峰。

[0114] 图9为实施例1中步骤(1)下②合成的巯基化花生酸的核磁共振氢谱图，对图中信号进行归属分析：1H NMR(500MHz,CDCl3),δ5.90(s,1H,-CO-NH-),3.44(d,J＝6.2Hz,2H,-NH-CH2-),2.67(d,J＝8.3Hz,2H,-CH2-SH),2.19(s,2H,-CH2-CO-),1.63(s,2H,-CH2-),1.43(s,1H,-SH),1.25(s,32H,CH3-CH2-),0.88(s,3H,CH3-)，结合质谱与氢谱说明该化合物为巯基化的花生酸。

[0115] 图10为未做任何修饰的肝素钠标准品的氢谱。用于和烯丙基修饰后肝素氢谱以及脂肪酸修饰后肝素氢谱进行对比。

[0116] 图11为实施例1中步骤(2)合成肝素-烯丙基结合物氢谱，对图中信号进行分析归属：与未修饰肝素标准品对比可发现在δH 5.99ppm处出现烯丙基缩水甘油醚烯基氢信号，所以可判断烯丙基缩水甘油醚成功的和肝素反应，得到了含双键的肝素-烯丙基结合物，结构可见合成路线中的化合物4。

[0117] 图12为实施例1中步骤(3)通过月桂酸修饰后得到的脂肪酸化肝素结合物氢谱，对图中信号进行分析归属：与肝素-烯丙基结合物的氢谱对比可知在δH 5.99ppm处的烯基信号消失，并且在δH 1.30ppm处出现了月桂酸中亚甲基氢信号，所以可判断巯基化的月桂酸与含双键的肝素-烯丙基结合物之间的硫醇-烯点击反应成功，得到了月桂酸修饰的脂肪酸化肝素结合物。

[0118] 图13为实施例2中步骤(3)通过软脂酸修饰后得到的脂肪酸化肝素结合物氢谱，对图中信号进行分析归属：与肝素-烯丙基结合物的氢谱对比可知在δH 5.99ppm处的烯基信号消失，并且在δH 1.30ppm处出现了软脂酸中亚甲基氢信号，所以可判断巯基化的软脂酸与含双键的肝素-烯丙基结合物之间的硫醇-烯点击反应成功，得到了软脂酸修饰的脂肪酸化肝素结合物。

[0119] 图14为实施例3中步骤(3)通过花生酸修饰后得到的脂肪酸化肝素结合物氢谱，对图中信号进行分析归属：与肝素-烯丙基结合物的氢谱对比可知在δH 5.99ppm处的烯基信号消失，并且在δH 1.31ppm处出现了花生酸中亚甲基氢信号，所以可判断巯基化的花生酸与含双键的肝素-烯丙基结合物之间的硫醇-烯点击反应成功，得到了花生酸修饰的脂肪酸化肝素结合物。

[0120] 二、根据美国药典对修饰后肝素进行抗Xa活性检测

[0121] 由于肝素性质不稳定，在修饰过程中有可能会失去抗凝活性，因此在用烯丙基缩水甘油醚对肝素进行修饰得到肝素-烯丙基结合物后要对其进行活性测定，看肝素在第一步的修饰后是否会完全失活。如果烯丙基缩水甘油醚修饰后肝素彻底失活则没有进行下一步脂肪酸修饰的必要，如果还保留了部分抗凝活性则可进行下一步的点击反应合成脂肪酸化肝素结合物，合成后也要进行活性测定判断最终得到的脂肪酸化肝素结合物是否还有抗凝活性，只有最终得到的脂肪酸化肝素结合物还有活性，这项通过脂肪酸修饰来获得新的具有长效潜力的肝素类抗凝药物的研究才具有实际意义。

[0122] 参考美国药典(USP36-NF31)中肝素钠抗Xa效价测定的生色底物法对合成的肝素-烯丙基结合物和脂肪酸化肝素结合物进行活性的初步测定，其原理如下：

[0123] ●肝素+抗凝血酶III→肝素·抗凝血酶III复合物

[0124] ●肝素·抗凝血酶III复合物+Xa因子(过量)→肝素·抗凝血酶III·Xa因子+Xa因子(剩余)

[0125] ●底物+H2O+Xa因子(剩余)→对硝基苯胺(pNA)+多肽

[0126] ●底物是无色的，pNA是有色的。在405nm处测反应产物的吸光度

[0127] 首先要绘制肝素标准品效价与吸光度的标准曲线，再测定样品的吸光度，根据标准曲线即可求出样品的效价。

[0128] 1)绘制标准曲线：

[0129] 缓冲液的配制：取三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸和氯化钠各适量，溶于0.1％聚乙二醇6000水溶液，使溶液中各组分浓度分别为0.050，0.0075和0.175mol/L。用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调pH至8.4，作为pH8.4缓冲液，配制为500mL。

[0130] 标准溶液的配制：准确称取未修饰的肝素钠(198.9u/mg)即标准品10.2mg，用202.9mL水将其溶解成10u/ml的溶液，然后分别取出100μL、150μL、200μL、250μL、300μL上述溶液并均用缓冲液稀释成0.1u/mL、0.15u/mL、0.2u/mL、0.25u/mL、0.3u/mL的5种不同浓度的标准溶液

[0131] 标准溶液的吸光度测定：①取一系列试管，编号并置于37℃恒温水浴锅中；②先加pH8.4的Tris缓冲液120μL，然后分别加入不同浓度的肝素标准品溶液30μL；③加入37℃预温15min的1.0u/mL的抗凝血酶溶液150μL，混匀，保温2min；④加入37℃预温15min的3.5nkat/mL的Xa因子溶液300μL，混匀，保温2min；⑤加入37℃预温15min的1mmol/L的发色底物S-2765溶液300μL，混匀，保温2min；⑥最后加入终止反应液20％(v/v)的醋酸150μL，终止反应；⑦通过按上述相反顺序加入试剂(从终止反应溶液开始，最后加入150μL的pH8.4缓冲液)制备调零的空白溶液，不加入标准溶液或供试品溶液；⑧在紫外分光光度计上读出并记录405nm下的吸光度值。结果如表1所示，并绘制标准曲线如附图15所示，得标准曲线方程y＝-3.039x+1.423，R2＝0.995。

[0132] 表1肝素标准品吸光度

[0133]

[0134] 2)测定实施例1中制备的肝素-烯丙基结合物的活性：

[0135] 配制样品溶液：准确称取肝素-烯丙基结合物10.5mg，用208.8mL水溶解，然后取200μL上述溶液并用缓冲液稀释到10mL，得到样品溶液。

[0136] 样品吸光度测定：按照标准溶液吸光度的测定步骤进行，将标准溶液吸光度的测定步骤①中的标准溶液换为样品溶液即可，剩余步骤相同。2次测得的样品的吸光度值见下表2：

[0137] 表2肝素-烯丙基结合物样品吸光度

[0138]测试次数 1 2 平均值
肝素-烯丙基结合物吸光度 0.949 0.957 0.953

[0139] 利用标准曲线和样品的吸光度值即可计算出样品稀释后的效价。

[0140] 带入标准曲线y＝-3.039x+1.423，得出样品稀释后效价为0.15u/mL，从而可得出实施例1中合成的肝素-烯丙基结合物效价为153.8u/mg，较未稀释的肝素标准品效价(198.9u/mg)有所下降。

[0141] 3)测定实施例1、实施例2和实施例3中不同脂肪酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物的活性：

[0142] 配制样品溶液：分别准确称取月桂酸、软脂酸和花生酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物10.5mg、10.3mg和10.1mg，然后分别用208.8mL、204.8mL和200.9mL的水溶解，再各取200μL上述溶液并均用缓冲液稀释到10mL，得到3个脂肪酸化肝素结合物样品溶液。

[0143] 样品吸光度测定：按照标准溶液吸光度的测定步骤进行，将标准溶液吸光度的测定步骤①中的标准溶液换为样品溶液即可，剩余步骤相同。2次测得的样品的吸光度值见下表3：

[0144] 表3不同脂肪酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物吸光度

[0145]

[0146] 同样根据标准曲线及各自的稀释情况可计算出月桂酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物、软脂酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物、花生酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物的效价分别为199.9u/mg、241.8u/mg和235.3u/mg，均稍微高于标准肝素的效价(198.9u/mg)。

[0147] 三、元素分析测试

[0148] 不同脂肪酸修饰肝素后对其进行C、H、N、S元素分析，分析结果如下：

[0149] 表4不同脂肪酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物的元素分析

[0150]

[0151] 从表中可知显示3个脂肪酸修饰后样品的C、H元素含量都比标准品增加，N、S元素含量变化不大，这应该与巯基化的长链脂肪酸(主要由C、H元素组成)成功修饰到肝素结构中是相关的，因为脂肪酸修饰对N、S元素并不会有太大的影响，所以修饰后样品测得的N、S元素含量和标准品相比变化不大。

[0152] 四、粒度分析测试

[0153] 由于本发明是将疏水的长链脂肪酸与亲水的肝素钠进行反应结合在一起，而两亲性分子结合后在一定条件下容易发生自聚合作用形成聚合物，所以为确定制备得到的脂肪酸化的肝素分子是否也会发生自聚合作用，对这3个样品又进行了粒度测定，先将样品配成1.5mg/ml的水溶液，然后在粒度分析仪中检测，观察它们的粒度是不是会比未修饰的标准品粒度大幅度增加，测定结果如下：

[0154] 表5不同脂肪酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物的粒度分析

[0155]样品 平均粒度(nm)
未修饰肝素标准品 311
月桂酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物 480.1
软脂酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物 410.6
花生酸修饰后的脂肪酸化肝素结合物 350.7

[0156] 从以上测得的数据可以发现修饰后的3个样品粒度相对标准品均没有明显增加，即在脂肪酸修饰后，肝素的分子大小变化不大，说明它们并没有发生自组装作用。

[0157] 五、凝胶渗透色谱(GPC)表征

[0158] 在本发明中为观察大分子肝素在修饰后分子量是否会发生显著变化，用GPC来测定标准品和3个修饰后的样品相对分子量，在用GPC测定高分子和聚合物的分子量时首先要用已知分子量的标样标定出流出时间和分子量的关系，即得到GPC的校正曲线，然后用标定好的时间和分子量的关系对未知样品各流出组分的时间和信号强度进行统计计算得到分子量分布。本发明中所用的葡聚糖标准品分子量和流出时间的关系如表6所示：

[0159] 表6GPC标准品数据

[0160]strandard Mw(Dalton) Time(min)
1 401000 19.95
2 277000 20.42
3 196000 20.83
4 124000 21.5
5 43500 22.77
6 4400 26
7 960 28.74
8 440 31
9 194 32.61

[0161] 由以上数据即可绘制得到GPC校正曲线，并在此校正曲线基础上根据所测肝素样品的流出时间和信号强度进行统计计算得到样品分子量分布，GPC校正曲线图及肝素样品处理结果见附图16-20。通过分子量的GPC测定，可以看出脂肪酸加上后肝素的分子量变化不大，说明了在用脂肪酸进行修饰的过程中肝素分子链没有被破坏或发生降解；由于脂肪酸本身的分子量相对于肝素分子量较小并且修饰到肝素上的量不多，所以在GPC测得的结果中观察不到肝素分子量明显增加。

[0162] 因此，合成化合物5后，通过抗Xa活性测定、元素分析、粒度分析、凝胶渗透色谱分子量测定来进行表征，选出了3种活性较好的脂肪酸化肝素结合物，进一步的核磁表征也显示脂肪酸修饰成功。所述的3种活性较好的脂肪酸化肝素结合物分别是月桂酸修饰后的月桂酸化肝素结合物、软脂酸修饰后的软脂酸化肝素结合物和花生酸修饰后的花生酸化肝素结合物。

[0163] 综上所述，实施例1～3说明本发明制备的3种活性较好的脂肪酸化肝素结合物是在8％浓度肝素、烯丙基缩水甘油醚加入量是肝素伯醇羟基含量4倍的条件下与不同巯基化脂肪酸点击反应得到的，通过相应的结构和活性测定结果中可看出肝素的脂肪酸化修饰是成功的，并且修饰过程中肝素基本骨架没有被破坏或发生降解，修饰后的产物仍然保留了较高的抗Xa活性。本发明是首次根据硫醇-烯点击化学反应的优点和特色，将长链饱和脂肪酸应用于肝素结构修饰中，并保留了肝素的抗凝活性，该结果为肝素的修饰提供了新的思路，是肝素结构修饰领域的重大突破，对于研究开发新的长效肝素类抗凝药物有着重要意义。