温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料及其制备方法

摘要

温敏性聚(脯氨酸‑肌氨酸)材料，属于智能材料中的温敏性聚合物领域，涉及到一种具有良好生物相容性、生物降解性和温敏特性聚合物材料的该聚(脯氨酸‑肌氨酸)由式(I)所示的结构单元组成，该聚(脯氨酸‑肌氨酸)为无规共聚物，该聚(脯氨酸‑肌氨酸)的分子量为0.8‑1.6×104；其中，n：m＝1：(0.09‑0.76)。本发明还公开了该温敏性聚(脯氨酸‑肌氨酸)材料的制备方法，本发明所制备的聚合物材料，不仅具有温敏特性，同时兼备了优异的生物相容性和生物降解性。

权利要求

1.温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料，其特征在于：该聚(脯氨酸-肌氨酸)由式(I)所示的结构单元组成，该聚(脯氨酸-肌氨酸)为无规共聚物，该聚(脯氨酸-肌氨酸)的分子量为

0.8-1.6×104；

其中，n：m＝1：(0.09-0.76)。

2.权利要求1所述的温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的制备方法，其特征在于：以N-羧基-脯氨酸环内酸酐和N-羧基-肌氨酸环内酸酐为原料，以无水二氯甲烷为溶剂，在引发剂存在的条件下进行开环聚合反应，控制反应温度25-35℃，反应时间70-75h，经洗涤、离心、过滤、干燥，得到温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料，所述的引发剂为胺类化合物。

3.根据权利要求2所述的温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的制备方法，其特征在于：N-羧基-脯氨酸环内酸酐和N-羧基-肌氨酸环内酸酐的结构单元比为1：(0.09-0.76)。

4.根据权利要求2所述的温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的制备方法，其特征在于：N-羧基-脯氨酸环内酸酐和N-羧基-肌氨酸环内酸酐的物质的量之和与引发剂的摩尔比为(50-100)：1。

5.根据权利要求2所述的温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的制备方法，其特征在于：所述的N-羧基-脯氨酸环内酸酐由下述方法制备，A、合成反应：以脯氨酸和三光气为原料，以无水四氢呋喃为溶剂，于45-55℃的条件下反应0.8-1.5h，得反应混合液；

B、N-羧基-脯氨酸环内酸酐的制备：将步骤A得到的反应混合液除杂后，进行浓缩，向浓缩后的混合溶液中加入无水四氢呋喃，置于2-3℃恒温浴中，然后向浓缩后的混合溶液中加入三乙胺，待反应体系中出现白色的三乙胺盐酸盐后，想反应体系中通氮气，反应22-30h，过滤，滤液浓缩后，至冰箱中冷冻过夜，直至滤液出现黄色固体，然后用无水四氢呋喃溶解黄色固体，向其中加入正己烷或石油醚，沉淀得到N-羧基-脯氨酸环内酸酐。

6.根据权利要求5所述的温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的制备方法，其特征在于：步骤A中，脯氨酸和三光气的摩尔比为1：(0.33-0.50)。

7.根据权利要求5所述的温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的制备方法，其特征在于：步骤B中，脯氨酸和三乙胺摩尔比1：(1-1.10)。

8.根据权利要求2所述的温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的制备方法，其特征在于：所述的N-羧基-肌氨酸环内酸酐由下述方法制备，a、合成反应：以肌氨酸和三光气为原料，以无水四氢呋喃为溶剂，于55-65℃的条件下反应1.5-2.5h，得反应混合液；

b、N-羧基-脯氨酸环内酸酐的制备：将步骤a得到的反应混合液除杂后，进行浓缩，然后向浓缩后的混合液中加入无水正己烷，室温下静置沉淀45-53h，过滤，滤饼用无水四氢呋喃溶解，加入正己烷沉淀，得到白色的N-羧基-脯氨酸环内酸酐。

9.根据权利要求8所述的温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的制备方法，其特征在于：步骤a中，肌氨酸和三光气的摩尔比1：(0.33-0.50)。

说明书

温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于智能材料中的温敏性聚合物领域，涉及到一种具有良好生物相容性、生物降解性和温敏特性聚合物材料的分子设计及其制备方法，具体涉及一种温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料及其制备方法，本聚合物材料本身是一种单一聚合物，而不是改性方法中两种或多种聚合物的混合物、接枝物、共混物。

背景技术

[0002] 温敏性聚合物材料是一类对外界温度变化具有可逆的相应行为的智能材料，它的一个最重要的物理参数就是最低临界溶解温度(LCST)或最高临界溶解温度(UCST)，即聚合物在水溶液中随温度改变而可逆地发生明显相变时的温度。在生物医学领域中，温敏性聚合物材料的实际应用必然涉及到两个最基本的问题：第一，临界溶解温度(LCST或UCST)的调控，即控制材料的响应温度，如赋予材料在生理体温范围内具有温敏特性；第二，温敏性聚合物材料的生物可降解性与生物相容性，即保证材料在实际应用中具有优异的生物可降解性与生物相容性，对组织无排异性或毒性。目前，温敏性聚合物材料在组织工程、药物控释、生物分离、酶固定化、免疫分析等生物医学研究领域得到了广泛的应用，成为功能聚合物领域中的一个研究与开发热点。基于材料应用领域的特殊性，良好的生物相容性与生物降解性是温敏性聚合物材料在实际应用中的客观要求，也是对人体安全的重要保证。

[0003] 氨基酸通过肽键相连形成的大分子被称为聚氨基酸、多(聚)肽或蛋白质，是一种具有良好生物相容性和生物可降解性生物材料，聚氨基酸或多肽主链结构中存在很多肽键，可在酶的作用下可降解成无毒的氨基酸小分子单体，被人体吸收或排出体外。多肽或聚氨基酸的应用涉及了许多热门的研究领域包括生物医学应用和组织工程学领域等，这种材料的结构特点使其拥有很多传统材料所不具备的优势。多肽或聚氨基酸中通常存在很强的α-螺旋和β-折叠等形式的二级结构，不同的二级结构对聚合物的组织穿透力和溶解等性能有很大的影响。因此，研究聚氨基酸在溶液中的二级结构及其影响因素，对其在生物医学领域具有很好的指导意义。

[0004] 近几十年来，天然高分子类似物的合成与应用研究已引起化学家和生物学家的广泛关注，其中典型例子就是多肽和类肽正在兴起。类肽，即聚(N-取代甘氨酸)，是天然多肽的结构异构体，其取代基的位置是从α-碳转移到酰胺氮原子上。与天然的和合成的多肽相比，这种取代基位置的简单改变在很大程度上增强了聚合物的溶解性。同时，通过侧链取代基的改性可使这些类肽具备更加优异的性能，成为应用前景更加广泛的生物材料。在过去的二十年中，许多新型的类肽已被发现、研究，如尿素类肽的出现。来源于自然界的生物材料如小分子氨基酸、大分子聚氨基酸或多肽/类肽具有其他材料所不具备的诸多优点，如手性、多官能团、生物相容性、生物可降解、二级结构丰富等等。同时，在生物体中蛋白质、多肽能够自组装成具有特定的、更加高级的结构与功能。如果将温敏特性引入到聚氨基酸或是多肽/类肽等生物材料中，这种材料必然具有潜在的应用价值，极大地拓展温敏性聚合物的应用领域。目前，研究人员可以采用各种方法来制备不同的多肽、类肽，并能够精确地控制肽链上单元摩尔质量、分散度和序列等性能。例如，均匀的、顺序控制的类肽样品可以通过固相肽合成仪来获得。当然，这些合成过程较为繁琐，最重要的是多肽或类肽的结构单元数量也是有限的。

[0005] 有关具有温敏性聚氨基酸或多肽材料的制备中，人们常常采用以下几种：多肽的后续修饰、新型氨基酸/多肽烯烃单体聚合等。然而现有技术中的温敏聚合物的生物可降解性和相容性较差，因此在生物医学领域中，同时赋予聚合物材料优异的生物降解性、生物相容性以及温敏特性是智能材料研究与开发中重要的方向之一。为了将温敏性聚合物材料赋予良好的生物相容性与生物降解性，人们通常将碳链型温敏聚合物(主链为C-C键)与具有生物降解性/相容性的(天然)聚合物结合在一起。例如，将壳聚糖、明胶、淀粉、葡聚糖和纤维素等与碳链型温敏聚合物进行必要的改性，包括接枝、嵌段和共混等。通过上述改性方法，可以在一定程度上改善或者提高温敏聚合物材料的生物降解性和相容性，却必然带来两个难以解决的重要问题：第一，由于碳链型温敏聚合物的存在，改性后材料本身仍然不可能完全降解，也不具备最佳的生物相容性；第二，因为非温敏性天然聚合物的引入，改性后材料的温敏特性亦会随含量增加而降低，甚至完全消失。因此，上述改性方法并不能彻底解决温敏性材料的生物降解性与相容性问题，即此方法不能兼顾材料的生物降解性、生物相容性与温敏特性。

发明内容

[0006] 本发明为解决现有技术中通过改性制备的聚合物材料不能同时具备生物相容性、生物降解性和温敏特性的技术难题，提供了一种温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料及其制备方法本发明的聚合物材料为单一的聚合物，而不是多种聚合物的混合物、共混物、接枝物，本聚合物材料同时具备优异的生物相容性、生物降解性和温敏特性。

[0007] 本发明为实现其目的采用的技术方案是：

[0008] 温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料，该聚(脯氨酸-肌氨酸)由式(I)所示的结构单元组成，该聚(脯氨酸-肌氨酸)为无规共聚物，该聚(脯氨酸-肌氨酸)的分子量为0.8～1.6×104；

[0009]

[0010] 其中，n：m＝1：(0.09-0.76).

[0011] 以N-羧基-脯氨酸环内酸酐和N-羧基-肌氨酸环内酸酐为原料，以无水二氯甲烷为溶剂，在引发剂存在的条件下进行开环聚合反应，控制反应温度25-35℃，反应时间70-75h，经洗涤、离心、过滤、干燥，得到温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料。

[0012] N-羧基-脯氨酸环内酸酐和N-羧基-肌氨酸环内酸酐的结构单元比为1：(0.09-0.76)。

[0013] N-羧基-脯氨酸环内酸酐和N-羧基-肌氨酸环内酸酐的物质的量之和与引发剂的摩尔比为(50-100)：1。

[0014] 所述的引发剂为胺类化合物，如正丁胺、正戊胺、己胺等。

[0015] 所述的N-羧基-脯氨酸环内酸酐由下述方法制备，

[0016] A、合成反应：以脯氨酸和三光气为原料，以无水四氢呋喃为溶剂，于45-55℃的条件下反应0.8-1.5h，得反应混合液；

[0017] B、N-羧基-脯氨酸环内酸酐的制备：将步骤A得到的反应混合液除杂后，进行浓缩，向浓缩后的混合溶液中加入无水四氢呋喃，置于2-3℃恒温浴中，然后向浓缩后的混合溶液中加入三乙胺，待反应体系中出现白色的三乙胺盐酸盐后，想反应体系中通氮气，反应22-30h，过滤，滤液浓缩后，至冰箱(优选-5℃)中冷冻过夜，直至滤液出现黄色固体，然后用无水四氢呋喃溶解黄色固体，向其中加入正己烷或石油醚，沉淀得到N-羧基-脯氨酸环内酸酐。

[0018] 步骤A中，脯氨酸和三光气的摩尔比1：(0.33-0.50)。

[0019] 步骤B中，脯氨酸和三乙胺摩尔比1：(1-1.10)。

[0020] 所述的N-羧基-肌氨酸环内酸酐由下述方法制备，

[0021] a、合成反应：以肌氨酸和三光气为原料，以无水四氢呋喃为溶剂，于55-65℃的条件下反应1.5-2.5h，得反应混合液；

[0022] b、N-羧基-脯氨酸环内酸酐的制备：将步骤a得到的反应混合液除杂后，进行浓缩，然后向浓缩后的混合液中加入无水正己烷，室温下静置沉淀45-53h，过滤，滤饼用无水四氢呋喃溶解，加入正己烷沉淀，得到白色的N-羧基-脯氨酸环内酸酐。

[0023] 步骤a中，肌氨酸和三光气的摩尔比1：(0.33-0.50)。

[0024] 本发明的有益效果是：

[0025] 本发明温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料对外界温度在10-40℃范围内具有优异的温度响应特性，同时表现出双重响应行为，即LCST为37℃而UCST为8.6℃。本发明所制备的聚合物材料属于多肽生物材料，因为不仅具有温敏特性，同时具有优异的生物相容性和生物降解性。因此，这种新型的温敏性聚合物材料可以在药物控制释放、生物分离、免疫分析等方面具有较高的应用价值和开发前景，尤其是对温敏性材料的生物相容性、生物降解性要求较高的技术应用领域。

[0026] 本发明的制备方法可以制备出对外界温度在10-40℃范围内具有优异的温度响应特性，同时表现出双重响应行为的温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料，这种温敏性聚合物材料是一种无规共聚物(大分子链上脯氨酸结构单元与肌氨酸结构单元是无规排列的)，其分子量在0.8～1.6万。本发明采用N-羧酸酐氨基酸单体(NCA)的开环聚合(ROP)的方法可以制备不同结构单元比和功能性以及低分子量分布的类肽或多肽生物材料。

[0027] 与现有温敏性聚合物材料相比，本发明是通过天然生物友好性脯氨酸和肌氨酸的NCA单体直接聚合，制备出具有温敏特性的聚合物材料。脯氨酸结构单元与肌氨酸结构单元在这种温敏性聚合物主链上的排列是无规的，材料本身也是一种单一聚合物，而不是改性方法中两种或多种聚合物的混合物、共混物。同时，本发明中所制备的温敏性材料属于杂链型聚合物，也是一种多肽材料，在其大分子主链上含有酰胺键。因此，这种新型温敏聚合物材料的成功制备可有效避免改性的材料本身仍然不可能完全降解或生物相容性差的问题；也避免了改性方法中非温敏性天然聚合物的引入所导致的温敏特性降低或消失。换句话说，本发明所制备的聚合物材料不仅具有良好的温敏特性，而且还兼顾了优异的生物相容性和生物降解性，为其在生物医学领域的实际应用提供了重要的安全保障和基础。

附图说明

[0028] 图1是实施例1温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的红外谱图。

[0029] 图2是实施例1温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的核磁谱图。

[0030] 图3是实施例1温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料水溶液透光率随温度变化曲线图。

[0031] 图4是实施例1温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料细胞毒性评价图。

[0032] 图5是N-羧基-肌氨酸环内酸酐的红外谱图。

[0033] 图6是N-羧基-肌氨酸环内酸酐的核磁谱图。

[0034] 图7是N-羧基-L-脯氨酸环内酸酐的红外谱图。

[0035] 图8是N-羧基-L-脯氨酸环内酸酐的核磁谱图。

具体实施方式

[0036] 在本发明中，将天然氨基酸的生物友好性与温敏特性的可调行为相结合，设计、制备了一种同时具备良好温敏特性、生物降解性、生物相容性的多肽生物材料。以两种天然的脯氨酸、肌氨酸为原料，合成其相应的N-羧基-氨基酸环内酸酐单体(NCA)，通过单体的(共)开环聚合反应，直接制备出兼具良好的生物相容性和优异温敏性的多肽生物材料。通过本发明，可以避免利用普通改性方法而导致的材料温敏性的降低或生物降解性与生物相容性的缺失，突破温敏材料因较差的生物降解性与生物相容性所导致的应用瓶颈。下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的说明。

[0037] 一、具体实施例

[0038] 实施例1

[0039] (1)N-羧基-肌氨酸环内酸酐的合成

[0040] 在装有回流冷凝管的100mL三口圆底烧瓶中加入2.0g肌氨酸，同时加入40mL无水THF，油浴升温至60℃，然后加入3.0g三光气。反应2h左右，当反应悬浊液由淡黄色反应至澄清状态，停止反应。再向反应体系中通N2以除去没有参加反应的三光气以及副产物HCl气体。2h后，将其进行旋蒸，浓缩反应液至2-3mL，并缓慢滴入50mL无水正己烷中。体系在室温下静置48h，可以观察到在容器底部出现固体结晶，倒去上层清液，加入无水四氢呋喃将固体结晶溶解，再次沉到正己烷中，重复2-3次，可得到白色粉末固体。

[0041] 该反应方程式如下所示：

[0042]

[0043] (2)N-羧基-脯氨酸环内酸酐的合成

[0044] 在加入装有回流冷凝管的100mL三口圆底烧瓶中加入3.0g L-脯氨酸，同时加入60mL无水THF，油浴升温至50℃，加入2.808g三光气。经过1h反应，反应悬浊液由白色反应至澄清状态，停止反应。再向反应体系中通N2以除去没有参加反应的三光气以及副产物HCl气体。2h后，将反应混合液进行旋蒸，浓缩反应液至2-3mL，再向其中加入60mL无水THF，将反应装置转移至低温恒温搅拌反应浴中，恒温在2-3℃，加入新蒸馏的三乙胺(3.96mL)。当反应体系中出现白色的三乙胺盐酸盐后，通N2，恒温反应需要24h。为了除去三乙胺盐酸盐，我们将初步得到的产物进行过滤，将所得液体进行旋蒸，浓缩液体至4-5mL，放入冰箱中进行冷冻过夜，直至容器中出现黄色固体。接下来再用无水四氢呋喃将黄色固体进行溶解，沉到适量正己烷中，重复2-3次，可得终产物为白色粉末状固体。

[0045] 该反应方程式如下所示：

[0046]

[0047] (3)温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的制备

[0048] 在25mL带通气阀的茄形反应瓶中加入0.2246g肌氨酸环内酸酐和0.2754g L-脯氨酸环内酸酐。加入15mL无水DCM，同时加入含0.008mL正丁胺(引发剂)的DCM溶液，引发剂与单体的物质的量之和比为1:50，同时氮气保护，反应温度30℃，72h后反应体系中白色糊状物不再增多，停止反应，用四氢呋喃洗涤，离心，过滤，在真空干燥箱干燥得目标生物材料。

[0049] 该反应方程式如下所示：

[0050]

[0051] 实施例2

[0052] (1)N-羧基-肌氨酸环内酸酐的合成

[0053] 在装有回流冷凝管的100mL三口圆底烧瓶中加入3.0g肌氨酸，同时加入50mL无水THF，油浴升温至50℃，然后加入4.50g三光气。反应2.5h左右，当反应悬浊液由淡黄色反应至澄清状态，停止反应。再向反应体系中通干燥N2以除去没有参加反应的三光气以及副产物HCl气体。3h后，将其进行旋蒸，浓缩反应液至约6mL，并缓慢滴入50mL无水石油醚/正己烷混合溶剂中。体系在室温下静置36h，可以观察到在容器底部出现固体结晶。经过滤除去上层清液，并加入无水四氢呋喃将固体溶解，再次沉到正己烷中，此操作重复3次，可得到白色纯净的粉末固体。

[0054] 该反应方程式如下所示：

[0055]

[0056] (2)N-羧基-脯氨酸环内酸酐的合成

[0057] 在100mL三口圆底烧瓶中加入4.0g L-脯氨酸，同时加入60mL无水二氯甲烷，油浴升温至35℃，加入3.735g三光气。经过3h反应，反应体系由悬浊液转为澄清状态，停止反应。再向反应体系中通N2以除去没有参加反应的三光气以及副产物HCl气体。2h后，将反应混合液进行旋蒸，浓缩反应液至约5mL，再向其中加入50mL无水THF，将反应装置转移至低温恒温搅拌反应浴中，恒温在2-3℃，加入新蒸馏的三乙胺(5.27mL)。当反应体系中出现白色的三乙胺盐酸盐后，通N2，恒温反应需要30h。经过滤除去三乙胺盐酸盐，并将所得液体进行旋蒸，浓缩液体至约7mL，放入冰箱中进行冷冻过夜，直至容器中出现固体。用无水四氢呋喃将固体进行溶解，沉到适量正己烷中，此操作重复2-3次，可得目标为目标白色固体。

[0058] 该反应方程式如下所示：

[0059]

[0060] (3)温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的制备

[0061] 在25mL带反应瓶中加入0.2695g肌氨酸环内酸酐和0.3304g L-脯氨酸环内酸酐。加入20mL无水N,N-二甲基二酰胺，同时加入含0.115mL正己胺(引发剂)的N,N-二甲基二酰胺溶液，引发剂与单体的物质的量之和比为1:60，同时干燥氮气保护，反应温度35℃，60h后停止聚合反应，用四氢呋喃沉淀，洗涤，离心，过滤多次，并在真空干燥箱干燥后可得到目标温敏性生物材料。

[0062] 该反应方程式如下所示：

[0063]

[0064] 实施例3

[0065] (1)N-羧基-肌氨酸环内酸酐的合成

[0066] 在100mL三口圆底烧瓶中加入2.0g肌氨酸，同时加入40mL无水三氯甲烷，油浴升温至50℃，然后加入3.0g三光气。反应3.5h后反应体系由悬浊液转为澄清状态，停止反应。向反应体系中通N2以除去没有参加反应的三光气和副产物HCl气体。2.5h后，将其进行旋蒸，浓缩反应液至约4mL，并缓慢滴入40mL无水正己烷中。体系在室温下静置50h，可以观察到在容器底部出现固体结晶。将上层清液倾倒出，加入无水四氢呋喃将固体结晶溶解，再次沉到正己烷中，此操作重复3-4次，即可得到N-羧基-肌氨酸环内酸酐。该反应方程式如下所示：

[0067]

[0068] (2)N-羧基-脯氨酸环内酸酐的合成

[0069] 在100mL三口反应瓶中加入4.0g L-脯氨酸，同时加入60mL无水THF，油浴升温至40℃，加入3.735g三光气。经过4h反应后，反应体系由悬浊液转为澄清状态，停止反应。向反应体系中通N2以除去没有参加反应的三光气以及副产物HCl气体。2.5h后，将反应混合液进行旋蒸，浓缩至约6mL，再向反应瓶中加入50mL无水THF，将反应装置转移至低温恒温搅拌反应浴中，控制温度在2-3℃，并加入新蒸馏的三乙胺(5.27mL)。随后反应体系中出现白色三乙胺盐酸盐沉淀，在N2气氛下恒温反应24h。滤除去三乙胺盐酸盐，并将所得液体进行旋蒸，浓缩至约8mL，置于冰箱中进行冷冻过夜，直至容器中出现固体。用无水四氢呋喃将固体进行溶解，沉到适量正己烷中，此溶解-沉淀操作重复2-3次，可得目标为目标白色固体。

[0070] 该反应方程式如下所示：

[0071]

[0072] (3)温敏性聚(脯氨酸-肌氨酸)材料的制备

[0073] 在25mL带反应瓶中，加入0.2695g肌氨酸环内酸酐和0.3304g L-脯氨酸环内酸酐。加入12mL无水N,N-二甲基二酰胺，同时加入含0.004mL正己胺(引发剂)的N,N-二甲基二酰胺溶液，引发剂与单体的物质的量之和比为1:100，同时干燥氮气保护，反应温度30℃，75h后停止反应，用乙醚沉淀，洗涤，离心，过滤多次，并在真空干燥箱干燥后可得到目标温敏性生物材料。

[0074] 该反应方程式如下所示：

[0075]

[0076] 二、开环聚合反应单体投料对聚合物性能的影响

[0077] 表1

[0078]

[0079] 表1说明了两种单体的投料摩尔比增大的情况下，对大分子链上结构单元含量有一定的影响。