一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法

摘要

本发明公开了一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法，包括以下步骤：将塔宾曲霉接种于培养基中，发酵培养后获得含果胶酯酶发酵液，分离含果胶酯酶发酵液获得果胶酯酶。所述培养基组成为高酯果胶3%(w/v)，硫酸铵0.5%(w/v)，Na2SO4 0.04%(w/v)，MgSO4·7H2O 0.04%(w/v)，K2HPO4 0.2%(w/v)，FeSO4·7 H2O 0.005%(w/v)，100 mL蒸馏水。所述分离含果胶酯酶发酵液的步骤包括：将发酵完毕的含果胶酯酶的发酵液，于4℃，10000 rpm离心15 min，上清液经过滤除菌、硫酸铵沉淀、离心、透析脱盐后得到果胶酯酶酶液。本发明首次采用了塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶，开辟了微生物产果胶酯酶的新道路，并且与固态发酵法相比，液态发酵具有易实现自动化连续生产，生产过程易控制，生产规模大等优点。

权利要求

1.一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：将塔宾曲霉菌种CICC2651接种于培养基中，180rpm，30℃培养4d，发酵培养后获得含果胶酯酶发酵液，分离纯化含果胶酯酶发酵液获得果胶酯酶；所述培养基为3％(w/v)高酯果胶、0.5％(w/v)(NH4)2SO4、0.04％(w/v)MgSO4·7H2O、0.2％(w/v)K2HPO4、0.04％(w/v)Na2SO4、0.005％(w/v)FeSO4·7H2O，100mL蒸馏水。

2.如权利要求1所述的一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为初始pH4.5，培养温度30℃，以OD600＝2.0的塔宾曲霉CICC2651单孢子菌悬液接种，接种量5％，180rpm，250mL三角瓶装液量40mL，培养时间为4d。

3.如权利要求1所述的一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法，其特征在于：所述分离纯化含果胶酯酶发酵液的步骤包括：将发酵完毕的含果胶酯酶的发酵液，经过4℃，

10000rpm，离心15min，获取上清液即为粗酶液；将所得粗酶液进行过滤除菌，然后向粗酶液中加入固体硫酸铵至饱和度70％，充分溶解后在高速冷冻离心机中4℃，10000rpm离心

15min，弃沉淀；上清再用硫酸铵沉淀至饱和度100％，充分溶解后于4℃，10000rpm离心

15min，弃上清，取沉淀用蒸馏水溶解；再用适量蒸馏水于4℃中透析，每隔4h换透析液，收集透析液得果胶酯酶。

说明书

一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及果胶酯酶，特别涉及一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法。

背景技术

[0002] 果胶酯酶（PE）又名果胶甲酯酶(pectinesterase, PE, EC 3.1.1.11)，是一种专一催化果胶分子长链上甲酯基水解，生成低酯果胶的一种酶。它不会减小果胶聚合物的体积，能较好地保持产品的胶凝度。果胶酯酶可用于果汁的制备，能改善过滤效果，有效提高出汁率，加速澄清效率等。研究表明，在一些蔬菜的加工中，果蔬组织中存在的果胶酯酶能保护果蔬质构。果胶酯酶能使果蔬中形成更大的果胶聚合物，使食物的青脆度近于新鲜。除用于果蔬保藏以外，高度专一的PE还可以用于研究酶的行为模式、果胶结构和功能性质之间的基本关系以及制备低酯果胶。

[0003] 果胶酯酶可从高等植物的果实和微生物中获得。其中，微生物果胶酯酶来源极其广泛，包括细菌、真菌、放线菌等。随着果胶酯酶来源不同，其理化特征等方面亦有差异。Ishii等发现从黑曲霉中提取的PE随机水解果胶分子中的甲酯，获得的低酯果胶胶凝性优于由其他材料来源的PE制备的低酯果胶。2004年，焦云鹏等人利用从黑曲霉发酵液中提取的果胶酯酶进行脱酯制备低酯果胶。帝斯曼公司研究发现，其果胶酯酶产品Rapidase. FP Super加入草莓整果中，草莓的硬度和稳定性都显著增强。国内未有生产果胶酯酶的公司, 国外主要有诺维信、Sigma、帝斯曼等公司, 产品形式为液体和粉末。工业上果胶酯酶主要是从黑曲霉发酵液中获得，而目前对利用塔宾曲霉发酵获得果胶酯酶尚未有报道。

[0004] 果胶酯酶在生产上的应用已有40多年的历史，采用固态法进行生产，以商品制剂出售。随着我国人民生活水平的提高，对外贸易的发展，低酯果胶的需求量越来越大，但至今仍需从国外进口，故对果胶酯酶的需求日益迫切。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法。

[0006] 一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法，包括以下步骤：将塔宾曲霉菌种CICC 2651接种于培养基中，180 rpm，30℃培养4 d，发酵培养后获得含果胶酯酶发酵液，分离纯化含果胶酯酶发酵液获得果胶酯酶。

[0007] 作为实施例的优选方式，所述培养基为3%(w/v)高酯果胶、0.5% (w/v) (NH4)2SO4、0.04%  (w/v) MgSO4·7H2O、0.2%  (w/v) K2HPO4、0.04% (w/v) Na2SO4、0.005% (w/v) FeSO4·7H2O，100 mL 蒸馏水。

[0008] 作为实施例的优选方式，所述发酵培养的条件为初始pH 4.5，培养温度30℃，接种量5% (OD600=2.0)，180 rpm，250 mL 三角瓶装液量40 mL，培养时间为4 d。

[0009] 作为实施例的优选方式，所述分离纯化含果胶酯酶发酵液的步骤包括：将发酵完毕的含果胶酯酶的发酵液，经过4℃，10000 rpm，离心15 min，获取上清液即为粗酶液；将所得粗酶液进行过滤除菌，然后向粗酶液中加入固体硫酸铵至饱和度70%，充分溶解后在高速冷冻离心机中4℃，10000 rpm离心15 min，弃沉淀；上清再用硫酸铵沉淀至饱和度100%，充分溶解后于4℃，10000 rpm离心15 min，弃上清，取沉淀用蒸馏水溶解；再用适量蒸馏水于4℃中透析，每隔4 h换透析液，收集透析液得果胶酯酶。

[0010] 本发明首次采用了塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶，开辟了微生物产果胶酯酶的新道路，并且与固态发酵法相比，液态发酵具有易实现自动化连续生产，生产过程易控制，生产规模大等优点。

附图说明

[0011] 图1 为不同碳源对产酶的影响图；在图1 中，横坐标为不同的碳源，纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；

[0012] 图2 为高酯果胶浓度对产酶的影响图；在图2 中，横坐标为高酯果胶浓度（w/v，%），纵坐标为果胶酯酶酶活（U/mL）；

[0013] 图3 为不同氮源对产酶的影响图；在图3 中，横坐标为不同的氮源，纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；

[0014] 图4 为硫酸铵浓度对产酶的影响图；在图4 中，横坐标为硫酸铵浓度（w/v，%），纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；

[0015] 图5 为无机盐浓度NaSO对产酶的影响图；在图5中，横坐标为无机盐浓度（w/v，%），纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；

[0016] 图6 为无机盐浓度MgSO4对产酶的影响图；在图6中，横坐标为无机盐浓度（w/v，%），纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；

[0017] 图7为无机盐浓度K2HPO4对产酶的影响图；在图7 中，横坐标为无机盐浓度（w/v，%），纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；

[0018] 图8 为优化前后生物量（g/L）及酶活(U/mL)变化图；

[0019] 图9为硫酸铵分级沉淀对果胶酯酶的影响图。

具体实施方式

[0020] 为使本领域的技术人员能进一步了解本发明，下面列举本发明的具体实施例，并配合说明书附图，详细说明本发明的技术方案。需强调的：实施例并非本发明技术方案所有可能实施方式的穷举，故不用于限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0021] 下述实施例中的培养基通过以下方法制备：

[0022] （1）材料与方法

[0023] 菌种：塔宾曲霉CICC 2651 (Aspergillus tubingensis) 由本实验室筛选所得，并保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），本领域技术人员可通过公众途径购买获得。

[0024] （2）培养基

[0025] PDA斜面培养基：称取200 g 马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000 mL 煮沸半个小时，纱布过滤，滤液再加20 g 葡萄糖和20 g 琼脂继续煮沸，充分溶解后分装试管，每试管约5 mL，121℃灭菌20 min 后取出试管摆斜面，冷却后贮藏备用。

[0026] （3）发酵培养基

[0027] 称取3% 高酯果胶、 0.5% (w/v) (NH4)2SO4、 0.04% (w/v) MgSO4·7H2O、 0.2% (w/v) K2HPO4、 0.04% (w/v) Na2SO4、 0.005%(w/v) FeSO4·7H2O，充分溶解于100 mL 蒸馏水中，调节初始pH为4.5，分装40 mL上述溶液于250 mL三角瓶中，121℃灭菌20 min。

[0028] （4）主要试剂

[0029] 1)0.02 mol/L NaOH溶液:准确称取0.8 g NaOH用蒸馏水溶解，并定容至1 L；

[0030] 2)1%高酯果胶溶液：称取1 g高酯果胶溶于100 mL蒸馏水中，调pH至4.5。

[0031] （5）试验方法

[0032] 单孢子菌悬液的制备：将4℃下贮藏的菌种，用无菌蒸馏水洗下孢子，放到装有无菌玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡30 min。待孢子充分打散后，测菌悬液OD 600，并用无菌生理盐水调整其OD600至2.0，即得单孢子菌悬液。

[0033] （6）塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶

[0034] 发酵培养基配好后，121℃灭菌20 min，冷却后在无菌条件下接种5%塔宾曲霉孢子悬液(OD 600=2.0)，混匀后置于30℃恒温振荡器中，180 rpm，培养4 d。

[0035] （7）粗酶液提取

[0036] 取出恒温培养振荡器中已培养4 d含果胶酯酶的发酵液，在4℃，10000 rpm下离心15 min，取上清液即为粗酶液。

[0037] （8）果胶酯酶活力的测定

[0038] 取100 ml 1%高酯果胶溶液（pH 4.5）于55℃下恒温，加入10 ml粗酶液，记录初始混合液pH，反应进行10 min，记录混合液pH。滴入0.02 mol/L NaOH调pH至初始混合液pH，记录NaOH消耗体积。定义1个酶活单位为：55℃下，每分钟生成1 μmol的酸，所需酶液的量即果胶酯酶酶活，酶活力单位为U/mL。

[0039] （9）果胶酯酶发酵工艺的单因素优化

[0040] 3%(w/v) 高酯果胶、0.5% (w/v) 硫酸铵、0.04%(w/v) MgSO4·7H2O、0.2%(w/v) K2HPO4、0.04%(w/v) Na2SO4、0.005%(w/v) FeSO4·7H2O，100 mL 蒸馏水，初始pH 4.5，发酵温度30℃，180 rpm，发酵时间4 d作为初始发酵条件进行优化。优化的内容包括碳源选择及其浓度优化、氮源选择及其浓度优化、无机盐（MgSO4·7H2O、K2HPO4、Na2SO4）浓度优化。

[0041] 实施例 1：果胶酯酶发酵培养基的单因素优化

[0042] （1）不同碳源及其浓度对产酶的影响

[0043] 以高酯果胶、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、柚皮粉、香蕉皮粉为碳源，30℃，180 rpm，发酵4 d，测定果胶酯酶活力，结果如图1 所示。由图1 可以看到，当碳源为高酯果胶时，果胶酯酶活力有最大值。因此，高酯果胶为最适产果胶酯酶的碳源。

[0044] 为进一步确定高酯果胶的用量，选取质量浓度（w/v）1%、2%、3%、4%、5%、6%六个水平进行试验，30℃，180 rpm，发酵4 d，测定果胶酯酶活力，结果如图2 所示。由图2 可以看到，随着高酯果胶浓度增大，果胶酯酶酶活逐渐升高，当高酯果胶浓度为3%时，果胶酯酶酶活达到最大。因此，选择高酯果胶浓度为3%。

[0045] （2）不同氮源及其浓度对产酶的影响

[0046] 以硫酸铵、酵母提取粉、牛肉膏、胰蛋白胨、尿素、硝酸钠为氮源，30℃，180 rpm，发酵4 d，测定果胶酯酶活力，结果如图3 所示。由图3 可以看到，当氮源为硫酸铵时，果胶酯酶活力达到最大值。

[0047] 为进一步确定硫酸铵的用量，选取0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%（w/v）六个水平进行试验，30℃，180 rpm，发酵4 d，测定果胶酯酶活力，结果如图4 所示。由图4 可以看到，随着硫酸铵浓度增大，果胶酯酶酶活逐渐升高，当硫酸铵浓度为0.5%时，果胶酯酶酶活最大。基于以上结果，塔宾曲霉发酵产果胶酯酶的最适氮源为硫酸铵，其浓度为0.5%。

[0048] （3）无机盐对产酶的影响

[0049] 将Na2SO4、MgSO4、K2HPO4分别以0.01%、0.01%、0.1%（w/v）为梯度，配制不同浓度梯度的培养基，30℃，180 rpm发酵4 d。运用pH-stat法对果胶酯酶酶活进行测定，实验重复4次。结果如图5、图6及图7所示。由图5 、图6及图7可以看到，当Na2SO4、MgSO4、K2HPO4浓度分别为
0.04%、0.04%、0.2%时，果胶酯酶酶活最大。因此，选择Na2SO4、MgSO4、K2HPO4浓度分别为
0.04%、0.04%、0.2%。

[0050] 实施例2：果胶酯酶发酵优化工艺与初始发酵工艺对照

[0051] （1）初始发酵工艺：

[0052] 4%(w/v) 高酯果胶、0.4% (w/v) 胰蛋白胨、0.05%(w/v) MgSO4·7H2O、0.1%(w/v) K2HPO4、0.05%(w/v) Na2SO4、0.05%(w/v) FeSO4·7H2O，100 mL 蒸馏水，溶液初始pH 4.5，发酵温度30℃，180 rpm，发酵时间4 d。

[0053] （2）优化发酵工艺：3% (w/v) 高酯果胶，0.5% (w/v) (NH4)2SO4，0.04% (w/v) MgSO4·7H2O，0.04%(w/v) Na2SO4，0.2% (w/v) K2HPO4，0.05%(w/v) FeSO4·7H2O，100 mL 蒸馏水，溶液初始pH 4.5，发酵温度30℃，180 rpm，发酵时间4 d。

[0054] （3）按照实施例1的优化参数，进行如下实验：

[0055] ①优化后培养基的配制：3% (w/v) 高酯果胶，0.5% (w/v) (NH4)2SO4，0.04% (w/v) MgSO4·7H2O， 0.04%(w/v) Na2SO4，0.2% (w/v) K2HPO4，0.05%(w/v) FeSO4·7H2O，100 mL 蒸馏水，溶液初始pH 4.5，121℃灭菌15 min。

[0056] ②菌种的活化：将生产果胶酯酶的菌种塔宾曲霉CICC 2651接种于PDA斜面培养基中，30℃活化培养4 d。

[0057] ③发酵培养：菌种活化培养后转接于发酵培养基中，发酵培养的条件为初始pH 4.5，接种量5%，装液量40 mL，30℃，180 rpm，培养时间4 d。

[0058] ④发酵完毕后，将上述发酵液在4℃、10000 rpm离心15 min，收集上清液，即得果胶酯酶粗酶液。

[0059] （4）优化发酵工艺与初始发酵工艺比较

[0060] 优化后果胶酯酶酶活力的测定，结果如图8所示，初始发酵工艺酶活力为0.41 U/mL，通过优化菌株的果胶酯酶发酵工艺，优化后酶活达到1.89 U/mL，是优化前的4.6倍。

[0061] 实施例3：果胶酯酶分离纯化

[0062] （1）粗酶液的制备

[0063] 将PDA斜面保藏菌种用无菌蒸馏水洗下孢子，置于装有无菌玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡30 min。待孢子充分打散后，测菌悬液OD600，并用无菌生理盐水调整其OD600至2.0，即得单孢子菌悬液。将单孢子悬浮液按接种量5%接种于发酵培养基中，30℃，180 rpm培养4 d。将发酵完毕的含果胶酯酶的发酵液，经4℃，10000 rpm，离心15 min，获取上清液即为粗酶液。

[0064] （2）硫酸铵分段盐析

[0065] 分别取粗酶液100 mL于9个烧杯中，置于冰水浴中，边搅拌边加入研细的固体(NH4)2SO4至饱和度20%， 30%， 40%...100%，充分溶解后放置于4℃，过夜。在高速冷冻离心机中10000 rpm离心15 min，弃上清，测沉淀酶活。由图9可知，70% (NH4)2SO4浓度条件下沉淀获得的果胶酯酶活力为1 U/mL，100% (NH4)2SO4浓度下沉淀获得的果胶酯酶活力为5.2 U/mL，因此，最佳(NH4)2SO4浓度区间为70% 100%。~

[0066] （3） 透析

[0067] 边搅拌边向粗酶液中缓慢加入研细的固体(NH4)2SO4至饱和度70%，充分溶解后放置于4℃，过夜。在高速冷冻离心机中10000 rpm离心15 min，弃沉淀。上清再用(NH4)2SO4沉淀至饱和度100%，10000 rpm离心15 min，取沉淀用缓冲液溶解。再用适量的缓冲液于4℃透析24 h，每隔4 h换透析液。透析结束后，收集透析液，即为果胶酯酶酶液。

[0068] 以上实施例是对本发明的具体描述，仅用于说明本发明的技术方案，并非本发明技术方案的穷举，故不用于限制本发明的保护范围。