一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法及试剂盒

摘要

本发明公开一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法及试剂盒。本发明首先提供了利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，包含：多个不同GC含量的标准品，文库稀释液，qPCR预混液，核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物，ddH2O。本发明还提供了利用上述试剂盒进行qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法。本发明试剂盒和方法定量精确、使用方便、适用范围广、选择性强、灵敏度高、特异性好、稳定性好，为高质量高效率的测序提供了保证。

权利要求

1.一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，其特征在于，包括：2-

10个不同GC含量的标准品，文库稀释液，qPCR 预混液，引物，ddH2O；其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

所述标准品的GC含量为20%-80%，其中，至少有一个标准品的GC含量为20%-50%，有一个标准品的GC含量为50%-80%；

所述标准品是线性DNA片段，其中，包含有P5/P7接头引物序列；

所述标准品的扩增片段的大小为300-600 bp。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述不同GC含量的标准品个数为3-9个。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述不同GC含量的标准品个数为5-7个。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品是预先稀释好的标准品。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品的扩增片段的大小为400-

500 bp。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品的扩增片段的大小为420 bp。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述文库稀释液包括缓冲体系，一种或多种稳定剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为BSA、carrier RNA、tRNA、carrier DNA、EDTA、Tween 20中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述BSA的浓度为0.2-2 mg/ml、carrier RNA的浓度为0.01-0.2 mg/ml、tRNA的浓度为0.01-0.2 mg/ml、carrier DNA的浓度为0.01-

0.1 mg/ml、EDTA的浓度为0.2-2 mM、Tween 20的浓度为0.02%-0.1%。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述qPCR 预混液为TransNGS Green qPCR SuperMix。

11.一种利用权利要求1-10任一所述试剂盒进行qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)标准品的选择：从权利要求1-10任一所述试剂盒中选择与待测样品DNA文库GC含量最为接近的标准品；

2)制作标准曲线与待测DNA文库qPCR：测定待测DNA文库的平均长度，使用文库稀释液梯度稀释标准品与待测DNA文库后，进行qPCR，获得稀释后的标准品和待测DNA文库的Ct值，以稀释后标准品的Ct值为纵坐标和以稀释后标准品的Ct值对应的Log[pM]为横坐标绘制标准曲线；其中，所述pM为稀释标准品的浓度；

3)待测DNA文库浓度计算：根据标准曲线和稀释后的待测DNA文库的Ct值计算稀释后的待测DNA文库的浓度，依据待测DNA文库的平均长度进行校正，进一步根据文库稀释度获得待测DNA文库浓度。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述稀释是以10x或5x梯度进行稀释，稀释后的标准品的个数为4-8个，浓度范围为0.0001 pM-100 pM，拷贝数范围是

101-108个/微升。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述梯度稀释后的标准品相邻浓度一组标准品间的ΔCt值在3.1-3.6之间，标准曲线扩增效率在90-110%之间，R2 值大于等于0.99。

说明书

一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法及

试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及高通量测序领域，即二代测序(NGS)范畴。更具体地，涉及一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法和试剂盒。

背景技术

[0002] 随着科技的不断进步，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究和应用的需求，对基因组测序，需求费用更低、速度更快、通量更高的测序技术——第二代测序技术(NGS)应运而生。测序文库的定量分析和质量评价对于获得高质量的核酸测序数据十分重要，要控制NGS测序仪上测序文库的载入量，保证测序数据的质量，就需要在测序前对DNA测序文库进行精确的定量检测分析，力求准确地预测簇密度，从而合理安排样本的上样量和上样比例。文库精确的定量对于二代测序的结果非常关键，过低估计文库的大小，容易导致clusters或多重模板太多，数据质量不高；过高估计文库的大小，导致数据读取量少，基因组覆盖率低，所以低估或高估文库的量都会影响测序质量与效果。

[0003] NGS流程使用多种文库定量方法，例如qPCR定量法、分光光度计(如NanoDrop)、荧光染料法(Qubit)或电泳设备(Bioanalyzer)，其中，qPCR定量法只测定可扩增文库的分子(双端接头完整)，避免非特异性检测，测定值与真实值最接近，并且检测灵敏度最高，非常适合低浓度文库(PCR-free文库)的检测，因此，qPCR是DNA文库定量的金标准，也是唯一一种能够准确检测出分子数目的方法。理论上来说，文库定量试剂盒所定量的浓度应该与分光光度计方法定量的浓度接近或比其低。

[0004] qPCR法进行准确定量的一个前提是保证标准品和未知样品的扩增效率相同，否则无法进行精确定量。针对不同GC含量的文库定量，特别是高GC/AT的文库，为保证qPCR法的准确定量，目前主要通过改善DNA聚合酶避免PCR扩增的偏好性、优化反应体系(添加GC buffer)、优化反应条件(提高预变性温度)等方式进行，例如市场上主流产品KAPA Library Quantification Kits中包含有的KAPA SYBR FAST DNA聚合酶，宣称针对高GC/AT的DNA片段可以获得相似的扩增效率，但是我们的多次比较实验，检测相同浓度的不同GC含量的标准品，结果发现其Ct值会有明显差异(图1)，这说明其依然无法保证完全相同的扩增效率，避免模板的扩增偏好性，对于富含GC/AT的标准品扩增效率要低。因此，如果只用一种GC含量的标准品，目前的方法无法对不同GC含量的文库进行精确定量，然而通过改变标准品的GC含量的研究几乎没有相关的报道。

[0005] 本发明人研究发现不同GC含量的文库模板DNA模板的GC含量是影响qPCR扩增的一个重要因素，特别是富含GC/AT模板的扩增，当以相同引物、同一条件扩增不同GC含量的目的片段，其Ct值会有明显差异。另外，本发明人还发现不同形式的模板(质粒、gDNA、cDNA、PCR产物、人工合成片段等)扩增效率也会不一样，研究报道线性片段的DNA模板比质粒模板的Ct值明显要小，特别是对于低拷贝数的模板，线性片段DNA更容易被扩增。生物界(动物、植物、细菌、真菌、病毒等)不同物种基因组DNA的GC含量差异很大(20％-80％)，因此，开发出一种针对不同GC含量的文库模板，选择与文库GC含量接近的线性片段DNA标准品的利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒和方法，对于第二代测序结果精确性具有重要的意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的之一是提供一种利用qPCR精确定量Illumina平台不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，使得qPCR文库定量的准确性更高，进而获得高质量的测序结果；

[0007] 本发明的目的之二是提供一种利用上述试剂盒进行qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法。

[0008] 为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

[0009] 一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，包括：多个不同GC含量的标准品，文库稀释液，qPCR预混液，引物(Primer Premix)，ddH2O；其中，所述引物为[0010] Primer P5:5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3’(SEQ ID NO:1所示)[0011] Primer P7:5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’(SEQ ID NO:2所示)。

[0012] 进一步，所述不同GC含量的标准品是通过使用电脑随机合成的不同GC含量的DNA片段，所述不同GC含量的标准品个数可以为2-10个，优选的为3-9个，更优选的为5-7个；所述标准品的GC含量为20％-80％，其中，至少有一个标准品的GC含量为20％-50％，有一个标准品的GC含量为50％-80％；所述标准品是线性DNA片段，其中，包含有P5/P7接头引物序列。

[0013] 不同物种基因组GC含量差异明显，二代测序构建的DNA文库GC含量不同。如果不考虑文库的GC含量差异，只选择单一的标准品，利用qPCR定量时由于DNA聚合酶扩增效率不一样，缺乏针对不同GC含量的标准品，导致文库定量不准确，富含GC/AT序列文库以及低样品文库定量差异更加明显，无法准确地预测簇密度，严重影响测序质量与效果。本发明创新性地设计涵盖GC含量范围的多个特征性标准品(2-10个，3-9个，4-8个或者5-7个，但不限于此)，都是包含有P5/P7接头引物序列的线性DNA片段，方便根据文库的GC含量选择最佳标准品，确保qPCR文库定量的准确性，合理安排不同GC含量样本的上样量和上样比例，获得高质量的测序结果。表1与表2分别列出了可以设计的5个或者7个标准品的GC含量。

[0014] 表1 5个DNA标准品的GC含量

[0015]

[0016] 表2 7个DNA标准品的GC含量

[0017]

[0018] 进一步，所述标准品为预先稀释好的标准品。

[0019] 试剂盒中的标准品一般选用预先梯度稀释好的，方便直接使用，确保稳定性，避免操作误差。

[0020] 进一步，所述标准品的扩增片段的大小为300-600bp，优选的为400-500bp，更优选的为420bp。

[0021] 本发明DNA标准品是专为二代测序平台设计，根据二代测序文库一般为平均长度为300-600bp的线性片段这个特性，因此，通过使用电脑随机合成了不同GC含量的DNA片段，其扩增大小应在300-600bp范围内，优选的为400-500bp，更优选的为420bp。

[0022] 进一步，所述文库稀释液除了缓冲体系，还包括有一种或者多种稳定剂；所述缓冲体系为该领域内常用的缓冲体系，优选的为Tris-HCl，更优选的为pH＝8.0的10mM Tris-HCl；所述稳定剂为BSA、carrier RNA、tRNA、carrier DNA、EDTA、Tween 20中的一种或多种；优选的，所述BSA的浓度为0.2-2mg/ml、carrier RNA的浓度为0.01-0.2mg/ml、tRNA的浓度为0.01-0.2mg/ml、carrier DNA的浓度为0.01-0.1mg/ml、EDTA的浓度为0.2-2mM、Tween 20的浓度为0.02％-0.1％。

[0023] 制作标准曲线时梯度稀释标准品的稀释液如果直接用水或TE Buffer稀释，由于受微管吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，容易导致实验结果精度降低。使用本发明中的文库稀释液来稀释文库与标准品，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线，并且不影响PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用，并且可以稳定保存DNA样品。

[0024] 进一步，所述qPCR预混液为TransNGS Green qPCR SuperMix，该预混液为一种基于抗体法热启动的新型染料法qPCR预混液。这种qPCR预混液具有特异性高、扩增效率高、GC含量适应性广、检测灵敏度高、可以扩增大片段等诸多优势，非常适合进行文库浓度的绝对定量。

[0025] 一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法(具体操作流程见图2)：

[0026] 1)标准品选择：根据待测DNA文库GC含量(可以从基因库获知常见模式生物的基因组GC含量，例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/)，选择与待测样品DNA文库GC含量最为接近的标准品；

[0027] 2)制作标准曲线与待测DNA文库qPCR：测定待测DNA文库的平均长度，使用文库稀释液梯度稀释标准品与待测DNA文库后，进行qPCR，获得稀释后的标准品和待测DNA文库的Ct值，以稀释后标准品的Ct值为纵坐标和以稀释后标准品的Ct值对应的Log[pM]为横坐标绘制标准曲线；其中，所述pM为稀释标准品的浓度；

[0028] 3)待测DNA文库浓度计算：根据标准曲线和稀释后的待测DNA文库的Ct值计算稀释后的待测DNA文库的浓度，依据待测DNA文库的平均长度进行校正，进一步根据文库稀释度获得待测DNA文库浓度。

[0029] 进一步，步骤2)中稀释标准品的个数为4-8个，浓度范围为0.0001pM-100pM，拷贝1 8
数范围是10-10个/微升。该范围内能保证标准曲线线性关系好，确保定量结果的稳定性与重复性。

[0030] 进一步，所述步骤2)中相邻一组标准品间的ΔCt值在3.1-3.6之间，标准曲线扩增效率保证在90-110％之间，R2值不小于0.99，确保PCR指数扩增，方可依据标准曲线的进行准确定量。

[0031] 进一步，所述qPCR的体系为：总体积20μl:qPCR预混液10μl，引物2μl，ddH2O 4μl，标准品4μl；或者总体积10μl:qPCR预混液5μl，引物1μl，ddH2O 2μl，标准品2μl；

[0032] 所述qPCR程序，可以选择两步法或者三步法，根据仪器要求添加熔解曲线步骤，便于扩增产物的特异性分析。

[0033] 其中，三步法的程序为：

[0034]

[0035] 两步法的程序为：

[0036]

[0037] 若文库平均长度大于700bp，建议把延伸时间适当增加15-25s。

[0038] 本发明的有益效果如下：

[0039] 目前qPCR是DNA文库定量的金标准，也是唯一能够准确检测出有效分子数目的方法。不论以使用何种方式构建，只要文库末端包含Illumina P5和P7芯片结合序列、长度不超过1kb且浓度不低于0.0002pM，都可以使用本发明方法或者试剂盒进行精确定量，指导合理安排样本的上样量和多样品混样比例，力求准确地预测簇密度，获取高数据量的测序read。

[0040] 本发明方法和试剂盒克服了目前单一GC含量的标准品引起的不同GC含量DNA文库定量误差较大的缺陷，确保可以获得可重复、准确可靠、高质量的测序结果。通过与现有产品进行比较，本发明试剂盒和方法可以避免GC含量不同所引起的定量误差，更精确地指导不同GC含量的文库进行测序，根据其定量的结果上样，同一测序Lane上不同的GC含量文库与预期更为准确，获得更高的测序read。

[0041] 本方法定量精确、使用方便、适用范围广、其选择性强、灵敏度高、特异性好，为高质量高效率的测序提供了保证，是二代测序中文库定量的最佳选择，弥补了目前定量方法的缺陷。

附图说明

[0042] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

[0043] 图1示出KAPA公司产品扩增同一浓度的5个不同GC含量DNA标准品的曲线图；

[0044] 图2示出针对不同GC含量的二代测序文库qPCR定量操作过程；

[0045] 图3示出同一浓度的5个不同GC含量DNA标准品扩增曲线；

[0046] 图4示出同一浓度的5个不同GC含量DNA标准品熔解曲线；

[0047] 图5示出6个梯度浓度预稀释好的标准品的扩增曲线；

[0048] 图6示出6个梯度浓度预稀释好的标准品的标准曲线；

[0049] 图7示出10倍梯度浓度稀释的二代测序DNA文库的扩增曲线；

[0050] 图8示出5个不同GC含量DNA标准品的标准曲线；

[0051] 图9示出分别以5个不同GC含量DNA标准品定量天蓝色链霉菌DNA文库结果；

[0052] 图10示出分别以5个不同GC含量DNA标准品定量拟南芥DNA文库结果。

具体实施方式

[0053] 为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

[0054] 实施例1

[0055] 利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，包括：5个不同GC含量的标准品(标准品是线性DNA片段，包含有P5/P7接头引物序列，扩增片段大小为420bp，其GC含量见表1)，文库稀释液(pH＝8.0的10mM Tris-HCl和浓度为1mg/ml BSA以及0.05％的Tween 20的混合物)，基于抗体法热启动的新型染料法qPCR预混液TransNGS Green qPCR SuperMix，引物(Primer Premix)，ddH2O；其中，所述引物为

[0056] Primer P5:5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3’(SEQ ID NO:1所示)[0057] Primer P7:5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’(SEQ ID NO:2所示)[0058] 利用上述试剂盒精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法，包括：

[0059] 1)标准品选择：根据待测DNA文库GC含量(可以从基因库获知常见模式生物的基因组GC含量，例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/)，从表1选择与待测样品DNA文库GC含量最为接近的标准品；

[0060] 2)制作标准曲线与待测DNA文库qPCR：测定待测DNA文库的平均长度，使用文库稀释液梯度稀释标准品与待测DNA文库后，进行qPCR，获得稀释后标准品和待测DNA文库的Ct值，以稀释后标准品的Ct值为纵坐标和以对应的Log[pM]为横坐标绘制标准曲线；

[0061] 其中，

[0062] 稀释标准品的个数为6个，表3给出了配制好的6个10x梯度稀释的稳定标准品，其浓度范围为0.0002pM-20pM，拷贝数为1.2×102-1.2×107，其稳定性高，线性关系好，确保定量结果的稳定。

[0063] 表3预稀释好标准品浓度与拷贝数

[0064]

[0065] qPCR的体系为总体积20μl:TransNGS Green qPCR SuperMix 10μl，引物2μl，ddH2O 4μl，标准品4μl；稀释后的标准品、稀释后的文库以及NTC(文库稀释液)做好平行孔(3个)，根据仪器说明书加DYE，采用两步法进行qPCR。

[0066] 3)待测DNA文库浓度计算：根据标准曲线和稀释后的待测DNA文库的Ct值计算稀释后的待测DNA文库的浓度，依据文库平均长度进行校正，进一步根据文库稀释度获得待测DNA文库浓度。

[0067] 实施例2

[0068] 利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，包括：7个不同GC含量的标准品(标准品是线性DNA片段，包含有P5/P7接头引物序列，扩增片段大小为300bp，其GC含量见表2)，文库稀释液(pH＝8.0的10mM Tris-HCl和浓度为0.05mg/ml的carrier RNA的混合物)，基于抗体法热启动的新型染料法qPCR预混液TransNGS Green qPCR SuperMix，引物(Primer Premix)，ddH2O；其中，所述引物为

[0069] Primer P5:5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3’(SEQ ID NO:1所示)[0070] Primer P7:5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’(SEQ ID NO:2所示)[0071] 利用上述试剂盒精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法，包括：

[0072] 1)标准品选择：根据待测DNA文库GC含量(可以从基因库获知常见模式生物的基因组GC含量，例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/)，从表2中选择与待测样品DNA文库GC含量最为接近的标准品；

[0073] 2)制作标准曲线与待测DNA文库qPCR：测定待测DNA文库的平均长度，使用文库稀释液梯度稀释标准品与待测DNA文库后，进行qPCR，获得稀释后的标准品和待测DNA文库的Ct值，以稀释后标准品的Ct值为纵坐标和以稀释后标准品的Ct值对应的Log[pM]为横坐标绘制标准曲线；

[0074] 其中，

[0075] 稀释标准品的个数为8个，表4给出了配制好的8个5x梯度稀释的稳定标准品，其浓度范围为0.0005-40pM，拷贝数为3×102-2.4×107个/μl。

[0076] 表4预稀释好标准品浓度与拷贝数

[0077]

[0078] qPCR的体系为总体积20μl:TransNGS Green qPCR SuperMix 10μl，引物2μl，ddH2O 4μl，标准品4μl；稀释后的标准品、稀释后的待测DNA文库以及NTC(文库稀释液)做好平行孔(2个)，根据仪器说明书加DYE，采用三步法进行qPCR。

[0079] 3)待测DNA文库浓度计算：根据标准曲线和稀释后的待测DNA文库的Ct值计算稀释后的待测DNA文库的浓度，依据文库平均长度进行校正，进一步根据文库稀释度获得待测DNA文库浓度。

[0080] 实施例3

[0081] 利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，包括：5个不同GC含量的标准品(标准品是线性DNA片段，包含有P5/P7接头引物序列，扩增片段大小为600bp，其GC含量见表1)，文库稀释液(pH＝8.0的10mM Tris-HCl和浓度为1mM的EDTA以及0.05mg/ml的tRNA的混合物)，基于抗体法热启动的新型染料法qPCR预混液TransNGS Green qPCR SuperMix，引物(Primer Premix)，ddH2O；其中，所述引物为

[0082] Primer P5:5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3’(SEQ ID NO:1所示)[0083] Primer P7:5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’(SEQ ID NO:2所示)[0084] 利用上述试剂盒精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法，包括：

[0085] 1)标准品选择：根据待测DNA文库GC含量(可以从基因库获知常见模式生物的基因组GC含量，例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/)，从表2中选择与待测样品DNA文库GC含量最为接近的标准品；

[0086] 2)制作标准曲线与待测DNA文库qPCR：测定待测DNA文库的平均长度，使用文库稀释液梯度稀释标准品与待测DNA文库后，进行qPCR，获得稀释后的标准品和待测DNA文库的Ct值，以稀释后标准品的Ct值为纵坐标和以稀释后标准品的Ct值对应的Log[pM]为横坐标绘制标准曲线；

[0087] 其中，

[0088] 稀释标准品的个数为4个，表5给出了配制好的4个10x梯度稀释的稳定标准品，其浓度范围为0.01-10pM，拷贝数为6×103-6×106个/μl。

[0089] 表5预稀释好标准品浓度与拷贝数

[0090]

[0091] qPCR的体系为总体积10μl:TransNGS Green qPCR SuperMix 5μl，引物1μl，ddH2O 2μl，标准品2μl；稀释后的标准品、稀释后的待测DNA文库以及NTC(文库稀释液)做好平行孔(3个)，根据仪器说明书加DYE，采用三步法进行qPCR。

[0092] 3)待测DNA文库浓度计算：根据标准曲线和稀释后的待测DNA文库的Ct值计算稀释后的待测DNA文库的浓度，依据文库平均长度进行校正，进一步根据文库稀释度获得待测DNA文库浓度。

[0093] 实验例1

[0094] 按照实施例1方法比较同一浓度的5个不同GC含量DNA标准品(表1)的Ct值，倍数换算结果见表6，从表中可以看出，使用M3(50％)作比较，各标准品之间差异明显，特别是M1(25％)与M5(75％)，跟M3相比超过了2倍，这表明不充分考虑不同文库的GC含量的影响，只是单一的标准品设计将严重影响文库的准确定量，低估或高估的文库定量都会影响测序质量与效果。如果定量富含GC/AT的文库，单一的标准品会导致定量结果偏低，而过低估计文库的大小，容易导致clusters或多、重模板太多，数据质量不高或者测序失败，因此很有必要设计多个不同GC含量的标准品。

[0095] 表6同一浓度的5个不同GC含量DNA标准品的Ct值与定量差异对比

[0096]

[0097] 实验例2

[0098] 按照实施例1方法比较同一浓度的5个不同GC含量DNA标准品扩增曲线与熔解曲线，如图3与4所示，从图中可以看出：同一浓度的5个不同GC含量DNA标准品扩增曲线与熔解曲线都不同，GC含量越高，Tm值也越高，因此，其标准曲线也会不一样。

[0099] 实验例3

[0100] 按照实施例1方法绘制表1中50％GC含量的标准品的扩增曲线与标准曲线(详见图5和6)，数据显示相邻一组标准品之间的ΔCt值在3.2-3.5之间，扩增效率为98.8％，R2值为
0.996。

[0101] 实验例4

[0102] 用TE作为稀释液代替实施例1所用的文库稀释液，其他同实施例1，分别按照表3的浓度梯度稀释6个M3(50％)的标准品，进行qPCR，分别获得Ct值(表7)，构建标准曲线，结果显示使用文库稀释液，相邻标准品之间的ΔCt值在3.2-3.5之间，扩增效率为99.7％，斜率为-3.35，R2值为0.995，而使用TE稀释液，相邻标准品之间的ΔCt值远超出了3.2-3.5这个范围，其斜率为-3.82，扩增效率只有82.2％，不符合90％-110％的标准，因此，本发明方法的文库稀释液要明显优于TE稀释液，能有效提高定量结果的准确性。

[0103] 表7文库稀释液与TE预稀释的6个标准品的qPCR结果

[0104]

[0105] 实验例5

[0106] 使用文库稀释液，把构建好的文库进行10x梯度稀释，取稀释了103-108倍的文库(L1-L6)，按照实施例1方法制定这个文库扩增曲线，如图7所示，从图中可以看出相邻一组文库稀释品之间的ΔCt值在3.2-3.5之间，扩增效率为97.6％，R2值为0.992，而使用TE进行文库梯度稀释，获得的曲线没有达到扩增标准。

[0107] 实验例6

[0108] 分别以超声打断的250ng人类和大肠杆菌基因组DNA作为模板，用文库构建试剂盒制备了两个连接有P5/P7接头的DNA文库L1和L2，进行高保证扩增(8个循环)，使用磁珠DNA分选试剂盒对文库进行片段筛选(400-600bp)，用安捷伦高灵敏度DNA分析试剂盒分析扩增的DNA片段，获得到这2个文库的平均的片段大小和大致质量浓度(详见表8)。

[0109] 每个文库使用文库稀释液进行10倍梯度稀释到10000倍，然后再稀释2倍。因为人的基因组GC含量大致为41％，因此选择37.5％的标准品M2，而大肠杆菌基因组DNA的GC含量为50％左右，选择50％的标准品M3，按照实施例1方法进行qPCR文库定量，所有梯度稀释后的DNA标准品和稀释过后的文库都要进行3个重复，NTC同样需要重复3个，文库定量数据分析详见表8。

[0110] 表8文库数据分析结果

[0111]

[0112] 实验例7

[0113] 分别使用天蓝色链霉菌(基因组GC含量约72％)与拟南芥(基因组GC含量约36％)的基因组构建二代测序文库，按照实验例7把构建好的文库进行10x梯度稀释，稀释到10000x和20000x后，按照实施例1方法分别以5个不同GC含量的标准品(表1)绘制标准曲线并进行文库定量，标准曲线如图8所示，详细数据见表9，结果都满足对标准曲线的要求。分别以这5条标准曲线计算天蓝色链霉菌(图9)与拟南芥(图10)这两个DNA文库的浓度，数据显示定量结果差异明显，如果是以M3(50％)作为标准品，其定量结果明显会偏小(M1,M2,M4,M5 vs M3统计分析，p值都小于0.001，n＝4)。而过低估计文库的大小，上样增多，容易导致clusters或多重模板太多，测序结果质量不高，甚至测序失败，造成不必要的浪费。按照本发明专利，天蓝色链霉菌的DNA文库应该选择GC含量为75％的标准品(M5)，而拟南芥则选择GC含量为37.5％的标准品(M2)进行qPCR文库定量最为合适，文库定量结果会更加精确，获取更高质量的测序结果。

[0114] 表9 5个不同GC含量DNA标准品的标准曲线数据对比

[0115]

[0116] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。