与特发性男性不育相关的精浆代谢小分子标志物及其检测方法和应用

摘要

本发明属于分析化学及临床医学领域，公开了与特发性男性不育相关的精浆代谢小分子标志物及其检测方法和应用。该标志物为精浆代谢小分子乙酰肉碱和/或色氨酸，采用UPLC‑Q exactive MS方法检测，该标志物可用于特发性男性不育的辅助诊断与监测，具有较高的灵敏度和特异度，具有临床推广价值。

权利要求

1.与特发性男性不育相关的精浆代谢小分子标志物在制备特发性男性不育诊断或监测试剂盒中的应用，该标志物为精浆代谢小分子乙酰肉碱和色氨酸。

说明书

与特发性男性不育相关的精浆代谢小分子标志物及其检测方

法和应用

发明领域

[0001] 本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及与特发性男性不育相关的精浆代谢小分子标志物及其基于UPLC-Q exactive MS的检测方法和应用。

背景技术

[0002] 据WHO统计,全世界约有15％的育龄夫妇遭受不育的困扰。我国由于人口基数大，新婚夫妇中不孕不育的患者人数远超过百万，因男性因素导致的不育高于50％。男性不育中目前仍有约40％～75％找不到原因，称为特发性男性不育症。特发性男性不育造成了极为严重的疾病负担。

[0003] 事实上，特发性男性不育诊断非常困难。WHO男性不育的标准是夫妻婚后同居1年以上，未采取避孕措施，由于男方原因造成女方不孕者。然而，同居1年的诊断标准，大大耽误了对男性不育进行早期治疗和干预的时间；由于现实原因很多夫妻并不能保证严格的同居1年，使得最后的男性不育判断变得非常困难；而且为了排除女方原因，女方还需要进行详细的检查，带来了沉重的经济和医疗负担。传统的精液参数检查只关注精子数量、运动度、精液量、pH和液化时间等常规参数，不能全面地反应精液的全部状况。而且，男性不育经常表现为常规精液参数无明显异常，也使得传统的精液参数检查并不能有效诊断男性不育。除此之外因为受到禁欲时间等因素的影响，常规精液参数常规分析结果还表现为较大的波动性。因而，临床诊断往往需要参考多次精液常规分析，给医生和患者带来了负担。因而，临床上亟需用于特发性男性不育的新的诊断方法。

[0004] 代谢组学(Metabolomics/Metabonomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，它是通过考察生物体系在遗传改变或受刺激或扰动后，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。所谓代谢组(Metabolome)是基因组的下游产物也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子质量小于1000的内源性小分子，这些内源性代谢小分子涉及糖代谢、能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢、核酸代谢、辅酶代谢等。

[0005] 正常状态下的生物体是一个完整的系统，生物体液、细胞和组织中的代谢物处于一个稳定的平衡状态。机体由于遗传或者后天原因发生了病理变化，这一平衡就被打破，代谢产物和代谢过程也产生了相应的变化。通过代谢组学分析了解代谢小分子在疾病过程中的变化，可以帮助人们寻找有关的生物标志物(biomarker)，可以辅助疾病的诊断，也可以帮助人们通过小分子物质本身涉及的代谢通路了解疾病的发病机制并为药物研发提供特异性的靶标。近年来，代谢组学在人类各类疾病的研究中在疾病的早期诊断中取得了诸多具有重大意义的研究成果，如心血管疾病、糖尿病和癌症，相关论文发表在学术期刊《Nature》、《Nature medicine》、《Journal of hepatology》和《Cancer research》上，展现了代谢小分子在人类疾病诊断中巨大的潜力与价值。男性不育的根本原因是精液的问题。精浆作为精液的液体成分可以很好地反映精液的质量改变，而且具有无创，容易采集的优点。然而，采用代谢组学分析精浆代谢小分子在特发性男性不育的诊断监测中的应用还未得到相应的关注。

[0006] 目前代谢组学研究常用技术包括液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气象色谱-质谱联用(GC-MS)及核磁共振技术(NMR)。核磁共振技术特点是对待测组分无破坏，样本前处理简单，但灵敏度较低；气相色谱-质谱联用具有较好的灵敏度和重现性，但一般要采用衍生化方法对样本进行前处理，使得实验步骤变得复杂。而LC-MS具有样本处理简单，灵敏度高，临床实用性强的特点。UPLC-Q exactive MS是新一代高分辨质谱与超高效液相的组合，具有相比传统LC-MS更强的灵敏度、特异度和稳定性。故而采用UPLC-Q exactive MSS进行精浆代谢小分子的代谢组学分析，若能发现稳定的与特发性男性不育发病相关的特异精浆代谢小分子作为生物标志物，并研发相应的代谢小分子标志的UPLC-Q exactive MS检测方法，不仅在该领域处于国际领先地位，还可创造令人瞩目的经济效益，对提高我国男性生殖健康水平也将是一次强有力的推动。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供与特发性男性不育相关的精浆代谢小分子标志物。

[0008] 本发明另一个目的是提供上述精浆代谢小分子标志物的检测方法。

[0009] 本发明再有一个目的是提供检测上述精浆代谢小分子标志物的试剂盒。

[0010] 本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

[0011] 与特发性男性不育相关的精浆代谢小分子标志物，该标志物不精浆代谢小分子乙酰肉碱和/或色氨酸。

[0012] 所述的精浆代谢小分子标志物在制备特发性男性不育诊断或监测试剂盒中的应用。

[0013] 一种诊断或监测特发性男性不育的试剂盒，该试剂盒含有检测精浆代谢小分子乙酰肉碱和/或色氨酸的试剂。

[0014] 所述的试剂盒，该试剂盒含有采用UPLC-Q exactive MS方法检测精浆代谢小分子乙酰肉碱和/或色氨酸的试剂。

[0015] 所述的试剂盒，该试剂盒含有下列试剂：

[0016] 乙酰肉碱和/或色氨酸标准品；

[0017] 内标A：肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸中一种或多种物质的同位素内标(氘标，水溶液)；

[0018] 内标B：十五烷酸的同位素内标(氘标，甲醇溶液)；

[0019] 内标C：二十四烷酸的同位素内标(氘标，甲醇溶液)。

[0020] 进一步，该试剂盒还含有：

[0021] Hypersil GOLD C18色谱柱；

[0022] 试剂A：沉淀蛋白用，含100％甲醇；

[0023] 试剂B：流动相用，含0.1％的甲酸的水；

[0024] 试剂C：流动相用，含0.1％的甲酸的乙腈；

[0025] 试剂D：复溶用，超纯水。

[0026] 一种检测如前所述的与特发性男性不育相关的精浆代谢小分子标志物的方法，该方法采用UPLC-Q exactive MS方法，检测精浆中代谢小分子乙酰肉碱和/或色氨酸的含量。

[0027] 上述检测方法中：

[0028] 一、液相条件：

[0029] 液相色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱，柱温为40℃；

[0030] 流动相A为含0.1％甲酸的水，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈，流速为400μL/min；

[0031] 仪器梯度为：0-3min 1％B，3-10min 1％到99％B，10-13min 99％B，13-13.1min 99％到1％B，13.1-17min 1％B；(各梯度中流动相A的量与对应的流动相B的量共100％，下同)

[0032] 进样方式：体积10μl；

[0033] 二、质谱条件

[0034] 采用加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析，正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V；采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000。

[0035] 本发明详细描述如下：

[0036] 本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的精浆样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于UPLC-Q exactive MS的代谢组学方法进行分析。

[0037] 具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

[0038] 一、研究对象选择和分组依据

[0039] 第一阶段 筛选阶段

[0040] 随机纳入明确诊断的特发性男性不育148人和健康对照148人，共296人。

[0041] A组：健康对照组(148人)：

[0042] 1.年龄在19至39岁之间；

[0043] 2.体质指数在17至31之间；

[0044] 3.生殖能力健康的男性，而且6-8个月后有了健康的后代；

[0045] 4.无全身重大疾病。

[0046] B组：特发性男性不育疾病组(148人)：

[0047] 1.年龄与对照组匹配；

[0048] 2.体质指数与对照组匹配

[0049] 3.尝试怀孕12个月没有成功，而配偶没有不孕疾病的男性；。

[0050] 4.无明确男性不育病因；

[0051] 5.吸烟饮酒史与对照组匹配；

[0052] 6.民族与对照组匹配；

[0053] 7.无全身重大疾病。

[0054] 第二阶段 验证阶段

[0055] 纳入明确诊断的特发性男性不育15人和健康对照15人，共30人。

[0056] A组：健康对照组(15人)：

[0057] 1.年龄在24到36岁之间；

[0058] 2.体质指数在19至24之间；

[0059] 3.生殖能力健康的男性，而且6-8个月后有了健康的后代；

[0060] 4.无全身重大疾病。

[0061] B组：特发性男性不育疾病组(15人)：

[0062] 1.年龄与对照组匹配；

[0063] 2.体质指数与对照组匹配；

[0064] 3.尝试怀孕12个月没有成功，而配偶没有不孕疾病的男性；

[0065] 4.无明确男性不育病因；

[0066] 5.吸烟饮酒史与对照组匹配；

[0067] 6.民族与对照组匹配；

[0068] 7.无全身重大疾病。

[0069] 二、UPLC-Q exactive MS代谢组学分析和特发性男性不育诊断用代谢小分子筛选和验证

[0070] 1.样本前处理

[0071] 1.1.取10μL精浆、加入10μL内标A，加入10μL内标B，加入10μL内标C，加入甲醇(试剂A)40μL，涡旋30s，沉淀蛋白。

[0072] 1.2.离心机中4℃16000g离心15min，将上清液转移至1.5mL进口EP管，并将上清液在室温条件下于离心浓缩干燥仪中浓缩至干。

[0073] 1.3.用10μL超纯水(试剂D)复溶，待分析。

[0074] 2.仪器检测

[0075] 2.1.分析仪器：UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色谱仪；Q-Exactive高分辨质谱仪。

[0076] 2.2.液相条件：

[0077] 2.2.1.液相色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.9μm,Thermo Scientific,Germany)，柱温为40℃。

[0078] 2.2.2采用的流动相为(A)含0.1％甲酸的水(试剂B)和(B)含0.1％甲酸的乙腈(试剂C)，流速为400μL/min。

[0079] 2.2.3仪器梯度为：0-3min 1％B，3-10min 1％到99％B，10-13min 99％B，13-13.1min99％到1％B，13.1-17min 1％B。

[0080] 2.2.4进样方式：体积10μl。

[0081] 2.3.质谱条件

[0082] 2.3.1加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析。

[0083] 2.3.2采用加热电喷雾电离方式(HESI)，正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V。采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000。

[0084] 3.物质定性

[0085] 代谢小分子定性采用与标准品乙酰肉碱和色氨酸比对色谱信息(保留时间)和质谱信息(精确分子量)，并实时比对样本中同位素内标标准品系列的色谱信息以校正保留时间。

[0086] 4.数据分析：

[0087] 生物标志物筛选采用采用多元Logistic回归确认关键代谢物。

[0088] 5.健康对照组、特发性男性不育组精浆样本中代谢小分子的差异和诊断意义。

[0089] 经过校正年龄、体质指数、吸烟和饮酒史的信息，多元Logistic回归分析发现精浆乙酰肉碱和色氨酸的含量增加显著降低了特发性男性不育的发生。采用随机人群应用上述代谢小分子组合诊断特发性男性不育，灵敏度为93.33％，特异度为86.67％，ROC曲线下面积为0.9822，具有较高的辅助诊断价值。

[0090] 三、诊断试剂盒制备方法

[0091] 根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能诊断或监测特发性男性不育的试剂盒，所述试剂盒含有用于检测与特发性男性不育相关的精浆代谢小分子标志物的试剂，包含测定受试者精浆中稳定存在且可检测的乙酰肉碱和色氨酸的标准品以及辅助分析的内标标准品系列。诊断试剂盒还可以包括一套精浆代谢小分子提取及色谱分离用试剂及器材。

[0092] 本发明的有益效果：

[0093] 本发明人通过采用UPLC-Q exactive MS比较正常对照和特发性男性不育精浆中的代谢小分子，发现了精浆中存在可用于评估是否患有特发性男性不育，具有诊断价值的精浆代谢小分子标志物组合，以及该精浆代谢小分子标志物检测的UPLC-Q exactive MS的应用，研制出可便于临床应用的特发性男性不育诊断、监测试剂盒。

[0094] 本发明采用精浆代谢小分子作为特发性男性不育评价的标志物的优越性在于：

[0095] (1)精浆代谢小分子是一种新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高特发性男性不育诊断的敏感性和特异性，该类小分子生物标志物的成功开发将为特发性男性不育的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

[0096] (2)本发明提供的精浆代谢小分子标志物可用作特发性男性不育的诊断标志物，可在早期辅助诊断特发性男性不育，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

[0097] (3)本发明采用特发性男性不育和健康对照随机人群的精浆样本进行验证，证明了精浆中乙酰肉碱和色氨酸水平在诊断特发性男性不育中具有较高灵敏度和特异度，可作为标志物使用。

[0098] (4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种精浆代谢小分子，应用UPLC-Q exactive MS进行独立人群验证，保证了该精浆代谢生物标志物和诊断方法的可靠性。

[0099] (5)UPLC-Q exactive MS技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，具有较高的临床诊断实用价值。

附图说明

[0100] 图1筛选阶段，经过校正年龄、体质指数、吸烟和饮酒史的信息，多元Logistic回归分析发现精浆乙酰肉碱和色氨酸的含量增加显著降低了特发性男性不育的发生。a未调整混杂因素的单因素Logistic回归结果。b调整年龄、体质指数、吸烟和饮酒史后的多元Logistic回归结果。

[0101] 图2代谢小分子检测水平波动性(均数±标准差)。

[0102] 图3验证阶段，采用精浆乙酰肉碱含量信息制作的正常对照组和特发性男性不育组之间的ROC曲线。

[0103] 图4验证阶段，采用精浆色氨酸含量信息制作的正常对照组和特发性男性不育组之间的ROC曲线。

[0104] 图5验证阶段，采用精浆乙酰肉碱和色氨酸含量信息制作的正常对照组和特发性男性不育组之间的ROC曲线。

具体实施方式

[0105] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

[0106] 实施例1：研究对象选择和分组依据

[0107] 本部分研究对象来自南京医科大学附属医院的首诊特发性男性不育病例及健康生育对照。研究内容和知情同意书均得到南京医科大学伦理委员会的批准，符合相关法规的要求。病例和对照在了解内容后签署了知情同意书。所有研究对象均进行了完整的体格检查，并完成了一份包括个人基础资料、生活习惯、职业和环境暴露、遗传危险因素、性功能与生殖功能、疾病史和体力活动的调查问卷。第一阶段纳入了符合要求的148例特发性男性不育病例和148例健康对照；第二阶段符合要求的15例特发性男性不育病例和15例健康对照作为特发性男性不育精浆代谢小分子生物标志物的筛选实验对象。具体的样品归类标准如下：

[0108] 第一阶段 筛选阶段

[0109] 随机纳入明确诊断的特发性男性不育148人和健康对照148人，共296人。

[0110] A组：健康对照组(148人)：

[0111] 1.年龄在19至39岁之间；

[0112] 2.体质指数在17至31之间；

[0113] 3.生殖能力健康的男性，而且6-8个月后有了健康的后代；

[0114] 4.无全身重大疾病。

[0115] B组：特发性男性不育疾病组(148人)：

[0116] 1.年龄与对照组匹配；

[0117] 2.体质指数与对照组匹配

[0118] 3.尝试怀孕12个月没有成功，而配偶没有不孕疾病的男性；。

[0119] 4.无明确男性不育病因；

[0120] 5.吸烟饮酒史与对照组匹配；

[0121] 6.民族与对照组匹配；

[0122] 7.无全身重大疾病。

[0123] 第二阶段 验证阶段

[0124] 纳入明确诊断的特发性男性不育15人和健康对照15人，共30人。

[0125] A组：健康对照组(15人)：

[0126] 1.年龄在24到36岁之间；

[0127] 2.体质指数在19至24之间；

[0128] 3.生殖能力健康的男性，而且6-8个月后有了健康的后代；

[0129] 4.无全身重大疾病。

[0130] B组：特发性男性不育疾病组(15人)：

[0131] 1.年龄与对照组匹配；

[0132] 2.体质指数与对照组匹配；

[0133] 3.尝试怀孕12个月没有成功，而配偶没有不孕疾病的男性；

[0134] 4.无明确男性不育病因；

[0135] 5.吸烟饮酒史与对照组匹配；

[0136] 6.民族与对照组匹配；

[0137] 7.无全身重大疾病。

[0138] 实施例2：UPLC-MS代谢组学特发性男性不育生物标志物筛选

[0139] 1.样本前处理

[0140] 1.1.取10μL精浆、加入10μL内标A，加入10μL内标B，加入10μL内标C，加入甲醇(试剂A)40μL，涡旋30s，沉淀蛋白。

[0141] 1.2.离心机中4℃16000g离心15min，将上清液转移至1.5mL进口EP管，并将上清液在室温条件下于离心浓缩干燥仪中浓缩至干。

[0142] 1.3.用10μL超纯水(试剂D)复溶，待分析。

[0143] 2.仪器检测

[0144] 2.1.分析仪器：UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色谱仪；Q-Exactive高分辨质谱仪。

[0145] 2.2.液相条件：

[0146] 2.2.1液相色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.9μm,Thermo Scientific,Germany)，柱温为40℃。

[0147] 2.2.2采用的流动相为(A)含0.1％甲酸的水(试剂B)和(B)含0.1％甲酸的乙腈(试剂C)，流速为400μL/min。

[0148] 2.2.3仪器梯度为：0-3min 1％B，3-10min 1％到99％B，10-13min 99％B，13-13.1min99％到1％B，13.1-17min 1％B。

[0149] 2.2.4进样方式：体积10μl。

[0150] 2.3.质谱条件

[0151] 2.3.1加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析。

[0152] 2.3.2采用加热电喷雾电离方式(HESI)，正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V。采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000。

[0153] 3.物质定性

[0154] 代谢小分子定性采用与标准品乙酰肉碱和色氨酸比对色谱信息(保留时间)和质谱信息(精确分子量)，并实时比对样本中同位素内标标准品系列的色谱信息以校正保留时间。

[0155] 4.数据分析：

[0156] 生物标志物筛选采用采用多元Logistic回归确认关键代谢物。

[0157] 5.健康对照组、特发性男性不育组精浆样本中代谢小分子的差异和诊断意义。

[0158] 经过校正年龄、体质指数、吸烟和饮酒史的信息，多元Logistic回归分析发现精浆乙酰肉碱和色氨酸的含量增加显著降低了特发性男性不育的发生(图1)。

[0159] 实施例3精浆代谢小分子的稳定性分析

[0160] 采用实施例2的方法对精浆乙酰肉碱和色氨酸水平的稳定性进行评价(间隔时间为2周)。结果显示，精浆中乙酰肉碱和色氨酸测定水平稳定(图2)，具备作为诊断/监测标志物的特性。

[0161] 实施例4代谢小分子组合对特发性男性不育的诊断

[0162] 根据上述UPLC-Q exactive MS代谢组学方法，本发明人通过对随机人群15病例和15对照的精浆样品检测乙酰肉碱和色氨酸，以此绘制ROC曲线并评估诊断的灵敏性和特异性，进而评估检测精浆中这2个代谢小分子水平对特发性男性不育的评估能力。

[0163] 乙酰肉碱的灵敏度为93.33％,特异度为80.00％，ROC曲线下面积为0.8933(图3)；色氨酸灵敏度为80.00％，特异度为73.33％，ROC曲线下面积为0.8267(图4)。

[0164] 组合乙酰肉碱和色氨酸的灵敏度为93.33％，特异度为86.67％，ROC曲线下面积为0.9822(图5)。

[0165] 故而组合乙酰肉碱和色氨酸具有较好地诊断特发性男性不育的能力。

[0166] 实施例5用于特发性男性不育精浆代谢小分子检测和诊断试剂盒的制作

[0167] 首先通过UPLC-Q exactive MS的方法确定正常对照和特发性男性不育精浆中具有较高丰度的代谢小分子。然后，在其中通过基于UPLC-Q exactive MS的代谢组学技术筛选与特发性男性不育相关的代谢小分子，作为是否为特发性男性不育的诊断指标。优选将筛选出的对应精浆代谢小分子的数量控制在2个，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。采用这2个精浆代谢小分子，既可以保障较好的灵敏度与特异度，又能节省成本，减轻患者的负担，还能减少检测时间，具有快速、准确、经济的优点，便于临床推广使用，当然采用其中1个标志物也可以，采用2个标志物效果更好。此试剂盒包括一批精浆代谢小分子检测用试剂和耗材，其中代谢小分子的定性和定量采用乙酰肉碱和色氨酸的标准品，辅助分析采用内标A：肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸八种物质的氘标同位素内标。内标B：十五烷酸的氘标同位素内标。内标C：二十四烷酸的氘标同位素内标。其它还有用于UPLC色谱分离的配套反向色谱柱(Hypersil GOLD C18色谱柱，100mm×2.1mm,粒径1.9μm)、用于沉淀精浆蛋白的试剂(100％甲醇)，用于流动相的试剂(含0.1％的甲酸的水和含0.1％的甲酸的乙腈)，用于提取代谢小分子的试剂(100％超纯水)。此试剂盒的价值在于只需要10μl精浆，即可检测精浆代谢小分子标志物的含量，再通过含量诊断特发性男性不育，并易于进行动态监测和观察治疗效果。

[0168] 具体试剂盒组成如下：

[0169] 乙酰肉碱标准品

[0170] 色氨酸标准品

[0171] 内标A(肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸八种物质的氘标同位素内标水溶液)

[0172] 内标B(十五烷酸的氘标同位素内标甲醇溶液)

[0173] 内标C(二十四烷酸的氘标同位素内标甲醇溶液)

[0174] 进一步，还可以含有：

[0175] 色谱柱(Thermo 100mm×2.1mm,粒径1.9μm，Hypersil GOLD C18色谱柱)[0176] 试剂A(100％甲醇)

[0177] 试剂B(含0.1％的甲酸的水)

[0178] 试剂C(含0.1％的甲酸的乙腈)

[0179] 试剂D(100％超纯水)。

[0180] 主要参考文献

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