一种采用色谱法鉴定福建琯溪蜜柚的方法

摘要

本发明公开了一种采用色谱法鉴定福建琯溪蜜柚的方法，首先采用乙腈对蜜柚外表皮、内表皮、内果皮及果肉等各部位中的化学组分进行提取，然后同时采用气相色谱仪、氢火焰离子检测器和液相色谱‑紫外检测器进行检测，对福建琯溪蜜柚各部位中化学组分进行色谱定性分析，准确地检测出福建琯溪蜜柚中的蛇床子素、柠檬烯、α‑亚油酸、棕榈酸、谷甾醇、油酸酰胺和诺卡酮等特异性物质，成功建立蜜柚特异性物质色谱指纹图谱。本发明方法操作简单、定性准确、检测快速，是一种全新的快捷、准确、简易的蜜柚原产地溯源及品质鉴定方法。

权利要求

1.一种采用色谱法鉴定福建琯溪蜜柚的方法，其特征在于，首先采用乙腈对蜜柚外表皮、内表皮、内果皮及果肉中的有机物进行提取，然后同时采用气相色谱仪、氢火焰离子检测器和液相色谱-紫外检测器进行检测，对福建琯溪蜜柚各部位中有机物进行色谱定性分析，准确地检测出福建琯溪蜜柚中的蛇床子素、柠檬烯、α-亚油酸、棕榈酸、谷甾醇、油酸酰胺和诺卡酮，成功建立蜜柚特异性物质色谱指纹图谱；

1）采用气相色谱仪、氢火焰离子检测器鉴定福建琯溪蜜柚的方法，操作步骤如下：

1.1）气相色谱仪的色谱柱初始温度为室温，升温速率10 ℃/min升至温度280 ℃，为满足试样中所有成分的峰完全分离，结合各物质沸点，确定气相色谱最优分析条件如下：气相色谱分析仪分析条件

色谱柱：30 m × 0.25 mm DB-17色谱柱；载气：N2；载气流速：1 mL/min；进样量：1 μL；

气化室温度：260 ℃；检测器温度： 280 ℃；检测器为FID检测器；

1.2）外标物溶液的配制：根据外标物的质量分数，分别称取不同质量的蛇床子素、α-亚油酸、棕榈酸和诺卡酮，分别用乙腈加入到10 mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成浓度为1000mg/L外标物溶液，并配成浓度为100mg/L的蛇床子素、α-亚油酸、棕榈酸和诺卡酮的混合标准外标溶液；

1.3）检测样品的制备：准确称取5g鲜样品于100mL离心管中，加入25mL乙腈，涡旋2min，超声30min，4500 r/min 离心3min，抽取上清液1.5mL，经0.22μm微膜过滤，待测样品的蛇床子素、α-亚油酸、棕榈酸和诺卡酮；

2）采用液相色谱-紫外检测器鉴定福建琯溪蜜柚的方法，操作步骤如下：

2.1）液相色谱仪以254 nm 为紫外吸收波长，梯度洗脱，为满足试样中所有成分的峰完全分离，结合各物质极性，确定液相色谱最优分析条件如下：液相色谱分析仪分析条件

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB C18 250 mm × 4.6 mm × 5 µm 色谱柱；流动相：A为水相，B为乙腈；洗脱流速：1 mL/min；色谱柱温度：30℃；进样量：10μL；梯度洗脱程序：水A%: 乙腈B%为70:30，洗脱0～15min、水A%: 乙腈B%为40:60，洗脱15～20min、水A%: 乙腈B%为

40:60，洗脱20～40min、水A%: 乙腈B%为20:80，洗脱40～45min、水A%: 乙腈B%为20:80，洗脱45～65min、水A%: 乙腈B%为70:30，洗脱65～70min；检测器为紫外检测器；

2.2）外标物溶液的配制：根据外标物的质量分数，分别称取不同质量的柠檬烯、谷甾醇和油酸酰胺，分别用乙腈溶解加入到10 mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成浓度为

1000mg/L外标物溶液，并配成浓度为100mg/L的柠檬烯、谷甾醇和油酸酰胺的混合标准外标溶液；

2.3）检测样品的制备：准确称取5g鲜样品于100mL离心管中，加入25mL乙腈，涡旋2min，超声30min，4500 r/min 离心3min，抽取上清液1.5mL，经0.22μm微膜过滤，待测样品的柠檬烯、谷甾醇和油酸酰胺。

说明书

一种采用色谱法鉴定福建琯溪蜜柚的方法

技术领域

[0001] 本发明属于分析化学色谱法领域。具体是一种采用色谱法鉴定福建琯溪蜜柚的方法，本方法同时利用气相色谱和液相色谱法对福建琯溪蜜柚中的化学组分进行定性分析。

背景技术

[0002] 柚子(citrus junos tanaka)，又名文旦，是芸香科柑橘亚科柚子属植物，我国是世界上柚类种植面积最大，产量居第2位的生产大国。我国柚类品种资源丰富、品种(品系)繁多，目前主栽品种有蜜柚、琯溪蜜柚、玉环柚等，占全国柚子栽培面积的80％左右，种植面积均达0.37万公顷以上，年产量超过1.2万吨，主要分布于福建、浙江、台湾、广西、广东等多个省份。琯溪蜜柚原产于福建省平和县，已有500多年栽培历史。1995年通过全国农作物品种审定委员会审定。2009年平和县种植50多万公顷，年总产量达100多万吨，年创产值15亿多元，成为福建省平和县果业支柱产业，也是果农致富的重要途径。琯溪蜜柚已先后注册了“琯溪”商标、“平和琯溪蜜柚”证明商标，获得了国家、“绿色食品”认证和国家质检总局原产地标志认证，分别在美国、英国、法国等17个国家和地区进行商标国际注册，被推荐为与欧盟交换保护的十大地理标志产品之一，被认定为“中国名牌农产品”，但是随着柚子的营养价值和药用价值日益受到重视，假冒名优品种柚子的现象时有发生，品质等级划分和原产地的鉴定技术就显得尤为重要。本发明同时利用气相色谱和液相色谱技术手段对福建琯溪蜜柚的化学组分进行定性分析，成功建立蜜柚特异性物质色谱指纹图谱。因此，建立一种简单、准确、快速的色谱分析方法，对福建琯溪蜜柚子的原产地溯源和鉴定具有重要的意义。

[0003] 针对柚子的鉴定技术，目前，顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(中国农业大学学报,2011,16(6):52)，感官评价和气质联用技术(现代食品科技,2014,30(10):274)，化学成分系统预试法(中国民族民间医药，2010，5:35-36)，高效液相色谱-质谱联用技术(色谱，2007，25(5):770-771)，色谱-质谱联用技术(色谱，2016，34(6):558-566)等方法已被用于柚子的定性分析。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术简单快速，适合检测柚子中的挥发性成分，但不合适柚子中的非挥发性成分检测；高效液相色谱-质谱联用技术高效准确，适合柚子用的非挥发性成分检测，但不适合挥发性成分的检测。目前没有发现报道对蜜柚采用气相色谱或液相色谱法进行检测鉴定。

发明内容

[0004] 本发明为了克服现有鉴定技术的不足，提供一种采用色谱法鉴定福建琯溪蜜柚的方法，对福建琯溪蜜柚中的化学组分定性鉴定。

[0005] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

[0006] 一种采用色谱法鉴定福建琯溪蜜柚的方法，首先采用乙腈对蜜柚外表皮、内表皮、内果皮及果肉等各部位中的有机物进行提取，然后同时采用气相色谱仪、氢火焰离子检测器和液相色谱-紫外检测器进行检测，对福建琯溪蜜柚各部位中有机物进行色谱定性分析，准确地检测出福建琯溪蜜柚中的蛇床子素、柠檬烯、α-亚油酸、棕榈酸、谷甾醇、油酸酰胺和诺卡酮等特异性物质，成功建立蜜柚特异性物质色谱指纹图谱：

[0007] 1)采用气相色谱仪、氢火焰离子检测器鉴定福建琯溪蜜柚的方法，操作步骤如下：

[0008] 1.1)气相色谱仪的色谱柱初始温度为室温，升温速率10℃/min升至温度50～280℃，为满足试样中所有成分的峰完全分离，结合各物质沸点，确定气相色谱最优分析条件如下：

[0009] 气相色谱分析仪分析条件

[0010] 色谱柱：30m×0.25mm DB-17色谱柱；载气：N2；载气流速：1mL/min；色谱柱温度：120℃；进样量：1μL；气化室温度：260℃；检测器温度：280℃；检测器为FID检测器；

[0011] 1.2)外标物溶液的配制：根据外标物的质量分数，分别称取不同质量的蛇床子素、α-亚油酸、棕榈酸和诺卡酮，分别用乙腈加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成浓度为1000mg/L外标物溶液，并配成浓度为100mg/L的蛇床子素、α-亚油酸、棕榈酸和诺卡酮的混合标准外标溶液；

[0012] 1.3)检测样品的制备：准确称取5g样品(鲜重)于100mL离心管中，加入25mL乙腈，涡旋2min，超声30min，4500r/min离心3min，抽取上清液1.5mL，经0.22μm微膜过滤，待测样品的蛇床子素、α-亚油酸、棕榈酸和诺卡酮；

[0013] 2)采用液相色谱-紫外检测器鉴定福建琯溪蜜柚的方法，操作步骤如下：

[0014] 2.1)液相色谱仪以254nm为紫外吸收波长，梯度洗脱，为满足试样中所有成分的峰完全分离，结合各物质极性，确定液相色谱最优分析条件如下：

[0015] 液相色谱分析仪分析条件

[0016] 色谱柱：Zorbax Eclipse XDB C18 250mm×4.6mm×5μm色谱柱；流动相：A为水相，B为乙腈；洗脱流速：1mL/min；色谱柱温度：30℃；进样量：10μL；梯度洗脱程序：水A％:乙腈B％为70:30，洗脱0～15min、水A％:乙腈B％为40:60，洗脱15～20min、水A％:乙腈B％为40:60，洗脱20～40min、水A％:乙腈B％为20:80，洗脱40～45min、水A％:乙腈B％为20:80，洗脱
45～65min、水A％:乙腈B％为70:30，洗脱65～70min；检测器为紫外检测器；

[0017] 2.2)外标物溶液的配制：根据外标物的质量分数，分别称取不同质量的柠檬烯、谷甾醇和油酸酰胺，分别用乙腈溶解加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成浓度为1000mg/L外标物溶液，并配成浓度为100mg/L的蛇床子素、α-亚油酸、棕榈酸和诺卡酮的混合标准外标溶液；

[0018] 2.3)检测样品的制备：准确称取5g鲜样品于100mL离心管中，加入25mL乙腈，涡旋2min，超声30min，4500r/min离心3min，抽取上清液1.5mL，经0.22μm微膜过滤，待测样品的蛇床子素、α-亚油酸、棕榈酸和诺卡酮。

[0019] 本发明的气相色谱仪为Agilent7890A气相色谱仪，色谱柱为分离效能高、分离速度快的石英毛细柱，运用氢火焰检测器进行检测，对样品中的各组分与外标物进行一一对比，准确的检测出福建琯溪蜜柚中的化学组分。液相色谱仪为Water-e2695高效液相色谱仪，色谱柱为Zorbax Eclipse XDB C18反相柱，运用紫外检测器，对样品中的各组分与外标物进行一一对比，准确的检测出福建琯溪蜜柚中的化学组分。

[0020] 本发明与现有的技术相比，具有以下的优点：

[0021] 1.改变以往以感官评价的方法判断柚子产地和品质在技术上科学性的不足。

[0022] 2.从色谱技术测定内涵物差异性上对蜜柚的产地、品质进行鉴定，结果更客观，更准确更科学。

[0023] 3.同时采用气相色谱和液相色谱技术，既可以检测出挥发性物质，又可以检测出极性物质，结果更科学可靠。

[0024] 4.在色谱柱不超载的范围内，定性结果与进样量重复性无关。

[0025] 5.操作简单，定性准确，检测快速，适用于蜜柚及其它柚子中化学组分的定性分析。

附图说明

[0026] 图1为外标物蛇床子素的气相色谱图。

[0027] 图2为外标物诺卡酮的气相色谱图。

[0028] 图3为外标物棕榈酸的气相色谱图。

[0029] 图4为外标物α-亚油酸的气相色谱图。

[0030] 图5混合标准外标物的气相色谱图。

[0031] 图6为外标物谷甾醇的液相色谱图。

[0032] 图7为外标物油酸酰胺的液相色谱图。

[0033] 图8为外标物柠檬烯的液相色谱图。

[0034] 图9混合标准外标物的液相色谱图。

[0035] 图10为福建琯溪蜜柚外表皮样品的气相色谱图。

[0036] 图11为福建琯溪蜜柚内表皮样品的气相色谱图。

[0037] 图12为福建琯溪蜜柚内果皮样品的气相色谱图。

[0038] 图13为福建琯溪蜜柚果肉样品的气相色谱图。

[0039] 图14为福建琯溪蜜柚外表皮样品的液相色谱图。

[0040] 图15为福建琯溪蜜柚内表皮样品的液相色谱图

[0041] 图16为福建琯溪蜜柚内果皮样品的液相色谱图

[0042] 图17为福建琯溪蜜柚果肉样品的液相色谱图

具体实施方式

[0043] 以下实施例中应用的仪器与试剂包括：

[0044] 仪器与材料：Agilent 7890A气相色谱仪，带氢火焰离子检测器(FID)；DB-17型石英毛细管色谱柱，30m×0.25mm；载气为纯度大于99.999％的氮气，燃气为纯度大于99.999％的氢气，助燃气为0.5MPa的压缩空气；Water-e2695高效液相色谱仪，带紫外检测器和色谱工作站；Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱，250mm×4.6mm×5μm。

[0045] 试剂：乙腈(分析纯、色谱纯)、超纯水。

[0046] 外标物：蛇床子素、柠檬烯、α-亚油酸、棕榈酸、谷甾醇、油酸酰胺和诺卡酮。

[0047] 样品：福建琯溪蜜柚采自福建樟州平和县文峰镇柴船村坎下。

[0048] 实施例1

[0049] 采用气相色谱仪、氢火焰离子检测器鉴定福建琯溪蜜柚的方法，具体操作步骤如下：

[0050] 1.气相色谱仪的色谱柱初始温度为室温，升温速率10℃/min升至温度50～280℃，为满足试样中所有成分的峰完全分离，结合各物质沸点，确定气相色谱最优分析条件如下：

[0051] 气相色谱分析仪分析条件

[0052] 色谱柱：30m×0.25mm DB-17色谱柱；载气：N2；载气流速：1mL/min；色谱柱温度：120℃；进样量：1μL；气化室温度：260℃；检测器温度：280℃；检测器为FID检测器。

[0053] 2.外标物溶液的配制：根据外标物的质量分数，分别称取不同质量的蛇床子素、α-亚油酸、棕榈酸和诺卡酮，分别用乙腈溶解加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成1000mg/L外标物溶液，并配成浓度为100mg/L的混合标准外标物溶液。经气相色谱检测，其检测结果如附图1、图2、图3、图4和图5所示，图1为蛇床子素气相谱图；图2为诺卡酮气相色谱图；图3为棕榈酸气相色谱图；图4为α-亚油酸气相色谱图；图5为混合标准外标物气相色谱图。

[0054] 3.样品的制备：准确称取5g样品(鲜重)于100mL离心管中，加入25mL乙腈，涡旋2min，超声30min，4500r/min离心3min，抽取上清液1.5mL，经0.22μm微膜过滤，经气相色谱检测，其检测结果如附图10、图11、图12和图13所示，图10为外表皮样品谱图；图11为内表皮样品谱图；图12为内果皮样品谱图；图13为果肉样品谱图。

[0055] 实施例2

[0056] 采用液相色谱-紫外检测器鉴定福建琯溪蜜柚的方法，具体操作步骤如下：

[0057] 1.液相色谱仪以254nm为紫外吸收波长，梯度洗脱，为满足试样中所有成分的峰完全分离，结合各物质极性，确定液相色谱最优分析条件如下：

[0058] 液相色谱分析仪分析条件

[0059] 色谱柱：Zorbax Eclipse XDB C18 250mm×4.6mm×5μm色谱柱；流动相：A为水相，B为乙腈；洗脱流速：1mL/min；色谱柱温度：30℃；进样量：10μL；梯度洗脱程序：水A％:乙腈B％为70:30，洗脱0～15min、水A％:乙腈B％为40:60，洗脱15～20min、水A％:乙腈B％为40:60，洗脱20～40min、水A％:乙腈B％为20:80，洗脱40～45min、水A％:乙腈B％为20:80，洗脱
45～65min、水A％:乙腈B％为70:30，洗脱65～70min；检测器为紫外检测器；

[0060] 2.外标物溶液的配制：根据外标物的质量分数，分别称取不同质量的柠檬烯、谷甾醇和油酸酰胺，分别用乙腈溶解加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成1000mg/L外标物溶液，并配成浓度为100mg/L的混合标准外标溶液。经液相色谱检测，其检测结果如附图6、图7、图8和图9所示，图6为谷甾醇的液相色谱图；图7为油酸酰胺的液相色谱图；图8为柠檬烯的液相色谱图；图9为混合标准外标物的液相色谱图。

[0061] 3.样品的制备：准确称取5g样品(鲜重)于100mL离心管中，加入25mL乙腈，涡旋2min，超声30min，4500r/min离心3min，抽取上清液1.5mL，经0.22μm微膜过滤，经液相色谱检测，其检测结果如附图14、图15、图16和图17所示，图14为外表皮样品的液相色谱图；图15为内表皮样品的液相色谱图；图16为内果皮样品的液相色谱图；图17为果肉样品的液相色谱图。