一种快速区分单增李斯特菌与斯氏李斯特菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种快速区分单增李斯特菌与斯氏李斯特菌的检测方法，利用顶空气相色谱‑质谱联用技术检测单增李斯特菌与斯氏李斯特菌液态发酵代谢的挥发性产物，根据两种细菌产生的代谢挥发性产物种类不同，区分单增李斯特菌与斯氏李斯特菌。本发明采用的方法比现有的传统生化实验鉴定时间缩短1‑2天，可以快速区分平板上的单增李斯特菌与斯氏李斯特菌，实现当天筛选。该方法自动化程度高，有效降低一线检测人员接触食源致病菌的几率，减少食源致病菌对人和环境污染的风险。

权利要求

1.一种快速区分单增李斯特菌与斯氏李斯特菌的检测方法，其特征在于，利用顶空气相色谱-质谱联用技术检测单增李斯特菌与斯氏李斯特菌液态发酵代谢的挥发性产物，根据两种细菌产生的代谢挥发性产物种类不同，区分单增李斯特菌与斯氏李斯特菌；

所述的挥发性产物是十二醇，单增李斯特菌的液态发酵代谢的挥发性产物中可以检测到十二醇，斯氏李斯特菌的液态发酵代谢的挥发性产物中检测不到十二醇。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法具体包括下列步骤：（1）单增李斯特菌与斯氏李斯特菌的培养物制备

接种环转接菌株到灭菌的营养肉汤培养基中，30 40℃，100 200 r/min条件下，摇床振~ ~荡培养8 24h；吸取该培养物5 10mL转入20 mL顶空瓶内，加盖密封，作为测试样品；

~ ~

其中，营养肉汤组分为：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉 3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，葡萄糖1.0 g/L；

（2）HS-GC-MS分析

顶空（HS）进样条件：加热箱温度30 60℃，定量环温度：85℃，传输线温度：100℃，样品~平衡时间：30 60 min；色谱柱压力：7.7 psi；填充压力：15 psi；加压时间：0.2 min；进样持~续时间：1.0 min，拔针时间：0.5 min；

气相色谱（GC）条件：30 m × 250 μm × 0.25μm的色谱柱；分流进样，分流比为5:1，隔垫吹扫流量为3 mL/min；升温程序：初始温度35 55℃保持2 10 min，以3 10℃/min升至120~ ~ ~

200℃；再以5 10℃/min升至250℃，保持1 5min，进样口温度：250℃ ；载气：高纯氦(He)，~ ~ ~流速：1 mL/min；

质谱（MS）条件：离子源EI，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70 eV，传输线温度280℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：33 300 u，溶剂延迟：1 3 min；

~ ~

（3）代谢挥发性产物的定性与定量

MS结果经计算机检索谱库进行定性分析，同时由软件系统完成手动对照检索；采用提取离子流方式报告挥发性物质的峰面积，其中，两种细菌产生的代谢挥发性产物种类不同，单增李斯特菌的液态发酵代谢的挥发性产物中可以检测到十二醇，并且采用面积归一法计算十二醇的相对含量为10% 30%，斯氏李斯特菌的液态发酵代谢的挥发性产物中检测不到~十二醇。

说明书

一种快速区分单增李斯特菌与斯氏李斯特菌的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用顶空气相色谱-质谱联用(Headspace gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS)技术快速区分单增李斯特菌与斯氏李斯特菌的检测方法。

背景技术

[0002] 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)简称单增李斯特菌，是一种能够引起人兽共患病的食源性致病菌。单增李斯特菌可污染许多食品，包括生家禽、家畜肉、发酵香肠和海产品等。WHO将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。它在自然界中分布广泛，4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，极易污染食品而引起食物中毒和李斯特菌病(由单增李斯特菌引起的急性传染病)的暴发，尤其是在欧美国家经常发生，给人类的健康及畜牧业的生产带来严重的威胁。近年来，欧美国家因食品感染的李斯特菌病患者呈上升趋势：2014年9月，丹麦发生一起因食用香肠中毒事件，12人死亡，还有至少20人被李斯特菌感染。经调查，疑似使用了被单增李斯特菌污染的原料肉。2015年4月9日，美国疾病控制预防中心宣布，美国至少8人因食用冰淇淋产品后，感染单增李斯特菌而患病就医，已经导致3人死亡。美国疾病预防控制中心(CDC)估计，美国每年约有2600人感染单增李斯特菌，其中约1500人罹患李斯特菌病住院治疗，约260人死亡。世界粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)风险评估报告(JEMRA，2004)中指出，李斯特菌病的平均死亡率为20～30％。2001年11月以来，我国质检部门多次从美国、加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等二十多家肉类加工厂进口的猪腰、猪肚、猪耳、小排等三十多批近千吨猪副产品中检出单增李斯特菌等食源致病菌。

[0003] 单增李斯特菌的鉴定多采用传统的生化反应实验和溶血试验等，该方法所需时间长，一般情况下需要5～7天，很难满足快速鉴定的需要。国家标准《GB 4789.30-2010》中，溶血试验：单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)在刺种点周围都产生狭小的透明溶血环，两者难以区分；协同溶血试验(cAMP)：单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，两者也无法区分。近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，增菌液中往往含有PCR抑制剂，从而影响PCR的扩增结果。斯氏李斯特氏菌和单增李斯特菌都属于李斯特菌属，采用免疫学检测方法，操作简便，可在同一时间内检测大量样品，但由于菌体及鞭毛抗原交叉反应的存在，难以进行李斯特菌属种间特异性鉴别。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速区分单增李斯特菌与斯氏李斯特菌的检测方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

[0005] 本发明的主要原理为：利用顶空气相色谱-质谱联用(Headspace  gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS)技术检测单增李斯特菌与斯氏李斯特菌液态发酵代谢的挥发性产物，根据两种细菌产生的代谢挥发性产物种类不同，区分单增李斯特菌与斯氏李斯特菌。

[0006] 具体包括下列步骤：

[0007] 1、单增李斯特菌与斯氏李斯特菌的培养物制备

[0008] 接种环转接菌株到灭菌的营养肉汤培养基中，30～40℃，100～200r/min条件下，摇床振荡培养8～24h。吸取该培养物5～10mL转入20mL顶空瓶内，加盖密封，作为测试样品。

[0009] 其中，营养肉汤组分为：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，葡萄糖1.0g/L。

[0010] 2、HS-GC-MS分析

[0011] 顶空(HS)进样条件：加热箱温度30～60℃，定量环温度：85℃，传输线温度：100℃，样品平衡时间：30～60min；色谱柱压力：7.7psi；填充压力：15psi；加压时间：0.2min；进样持续时间：1.0min，拔针时间：0.5min。

[0012] 气相色谱(GC)条件：色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；分流进样，分流比为5:1，隔垫吹扫流量为3mL/min；升温程序：初始温度35～55℃保持2～10min，以3～10℃/min升至120～200℃；再以5～10℃/min升至250℃，保持1～5min，进样口温度：250℃；载气：高纯氦(He)，流速：1mL/min。

[0013] 质谱(MS)条件：离子源EI，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度280℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：33～300u，溶剂延迟：1～3min。

[0014] 3、代谢挥发性产物的定性与定量

[0015] MS结果经计算机检索谱库进行定性分析，同时由软件系统完成手动对照检索。采用提取离子流方式报告挥发性物质的峰面积。

[0016] 其中，两种细菌产生的代谢挥发性产物种类不同，区分化合物为十二醇，单增李斯特菌的液态发酵代谢的挥发性产物中可以检测到十二醇，并且采用面积归一法计算十二醇的相对含量为10％～30％，而斯氏李斯特菌的液态发酵代谢的挥发性产物中未检测到十二醇。

[0017] 本发明的有益效果：

[0018] 本发明的方法作为一种筛选工具，比现有的传统生化实验鉴定时间缩短1-2天，可以快速区分平板上的单增李斯特菌与斯氏李斯特菌，实现当天筛选。相对于PCR方法和免疫方法，该筛选方法自动化程度更高，降低一线检测人员接触食源致病菌的几率，减少食源致病菌对人和环境污染的风险。

具体实施方式

[0019] 下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。

[0020] 图1是单增李斯特菌ATCC 13932与斯氏李斯特菌ATCC 35967产生的挥发性化合物的总离子流色谱图。

[0021] 图2是单增李斯特菌ATCC 19114与斯氏李斯特菌ATCC 35867产生的挥发性化合物的总离子流色谱图。

[0022] 实施例1

[0023] (1)单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 13932与斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)ATCC 35967的培养物制备

[0024] 采用接种环，无菌操作转接单增李斯特菌ATCC 13932到5mL的灭菌营养肉汤培养基中，36℃，150r/min条件下，摇床振荡培养12h。吸取全部培养物转入20mL安捷伦钳口顶空样品瓶内，加盖密封，作为单增李斯特菌待测试培养物。

[0025] 采用接种环，无菌操作转接斯氏李斯特菌ATCC 35967到5mL的灭菌营养肉汤培养基中，36℃，150r/min条件下，摇床振荡培养12h。吸取全部培养物转入20mL安捷伦钳口顶空样品瓶内，加盖密封，作为斯氏李斯特菌待测试培养物。

[0026] 其中，营养肉汤组分为：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，葡萄糖1.0g/L。购自北京陆桥技术责任有限公司。

[0027] (2)培养物的顶空气相色谱-质谱联用法分析

[0028] 采用美国安捷伦公司Agilent 7890B-5977A系列气相色谱/质谱联用系统(配有Agilent7697A顶空自动进样器)对单增李斯特菌待测试培养物、斯氏李斯特菌待测试培养物进行挥发性产物的化学分析。顶空进样、气相色谱和质谱条件如下：

[0029] 顶空(HS)进样条件：加热箱温度52℃，定量环温度：85℃，传输线温度：100℃，样品平衡时间：50min；色谱柱压力：7.7psi；填充压力：15psi；加压时间：0.2min；进样持续时间：1.0min，拔针时间：0.5min。

[0030] 气相色谱(GC)条件：HP-INNOWax色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；分流进样，分流比为5:1，隔垫吹扫流量为3mL/min；升温程序：初始温度40℃保持5min，以3℃/min升至140℃；再以6℃/min升至250℃，保持5min，进样口温度：250℃；载气：高纯氦(He)，流速：1mL/min。

[0031] 质谱(MS)条件：离子源EI，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度280℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：33～300u，溶剂延迟：2.2min。

[0032] 3、代谢挥发性产物的定性与定量

[0033] 采用安捷伦GCMS Chemstation软件中的谱库(NIST11.L)对气相色谱-质谱结果进行化合物的定性分析，同时由NIST MS Search 2.0软件系统完成手动对照检索，要求正反向匹配因子(Match)都大于700(良好匹配)，可能性(Prob.％)大于60。采用提取离子流方式计算挥发性物质的峰面积，利用面积归一法计算挥发性化合物的相对含量。选取相对含量大于1％的代表性挥发性化合物作为区分单增李斯特菌与斯氏李斯特菌的化合物种类(表1)。

[0034] 表1单增李斯特菌ATCC 13932与斯氏李斯特菌ATCC 35967产生的各种挥发性化合物

[0035]

[0036] 注：CAS编号是化学物质登录号。

[0037] 单增李斯特菌ATCC 13932与斯氏李斯特菌ATCC 35967产生的挥发性化合物的总离子流色谱图(图1)可以直观显示出两种细菌的化合物种类差别。其中，斯氏李斯特菌ATCC 35967的挥发性化合物(图1-A)中未检测到十二醇，而在单增李斯特菌ATCC 13932的挥发性化合物(图1-B)检测到十二醇(相对含量16.12％)。十二醇，又名月桂醇，具有颇弱但很持久的油脂气息，在大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌的VCs中普遍存在[1]，可以用来区别单增李斯特菌ATCC 13932与斯氏李斯特菌ATCC 35967。

[0038] 实施例2

[0039] (1)单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 19114与斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)ATCC 35867的培养物制备

[0040] 采用接种环，无菌操作转接单增李斯特菌ATCC 19114到5mL的灭菌营养肉汤培养基中，36℃，150r/min条件下，摇床振荡培养12h。吸取全部培养物转入20mL安捷伦钳口顶空样品瓶内，加盖密封，作为单增李斯特菌待测试培养物。

[0041] 采用接种环，无菌操作转接斯氏李斯特菌ATCC 35867到5mL的灭菌营养肉汤培养基中，36℃，150r/min条件下，摇床振荡培养12h。吸取全部培养物转入20mL安捷伦钳口顶空样品瓶内，加盖密封，作为斯氏李斯特菌待测试培养物。

[0042] 营养肉汤(Nutrient Broth)购自北京陆桥技术责任有限公司。

[0043] (2)培养物的顶空气相色谱-质谱联用法分析

[0044] 采用美国安捷伦公司Agilent 7890B-5977A系列气相色谱/质谱联用系统(配有Agilent 7697A顶空自动进样器)对单增李斯特菌待测试培养物、斯氏李斯特菌待测试培养物进行挥发性产物的化学分析。顶空进样、气相色谱和质谱条件如下：

[0045] 顶空(HS)进样条件：加热箱温度55℃，定量环温度：85℃，传输线温度：100℃，样品平衡时间：50min；色谱柱压力：7.7psi；填充压力：15psi；加压时间：0.2min；进样持续时间：1.0min，拔针时间：0.5min。

[0046] 气相色谱(GC)条件：HP-INNOWax色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；分流进样，分流比为5:1，隔垫吹扫流量为3mL/min；升温程序：初始温度40℃保持5min，以3℃/min升至140℃；再以6℃/min升至250℃，保持5min，进样口温度：250℃；载气：高纯氦(He)，流速：1mL/min。

[0047] 质谱(MS)条件：离子源EI，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度280℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：33～300u，溶剂延迟：2.2min。

[0048] 3、代谢挥发性产物的定性与定量

[0049] 采用安捷伦GCMS Chemstation软件中的谱库(NIST11.L)对气相色谱-质谱结果进行化合物的定性分析，同时由NIST MS Search 2.0软件系统完成手动对照检索，要求正反向匹配因子(Match)都大于700(良好匹配)，可能性(Prob.％)大于60。采用提取离子流方式计算挥发性物质的峰面积，利用面积归一法计算挥发性化合物的相对含量。选取相对含量大于1％的代表性挥发性化合物作为区分单增李斯特菌与斯氏李斯特菌的化合物种类(表2)。

[0050] 表2单增李斯特菌ATCC 19114与斯氏李斯特菌ATCC 35867产生的各种挥发性化合物

[0051]

[0052]

[0053] 注：CAS编号是化学物质登录号。

[0054] 单增李斯特菌ATCC 19114与斯氏李斯特菌ATCC 35867产生的挥发性化合物的总离子流色谱图(图2)可以直观显示出两种细菌的化合物种类差别。其中，单增李斯特菌ATCC 19114的挥发性化合物(图2-A)检测到十二醇(相对含量14.45％)，而在斯氏李斯特菌ATCC 
35867的挥发性化合物(图2-B)中未检测到十二醇。十二醇，又名月桂醇，具有颇弱但很持久的油脂气息，在大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌的VCs中普遍存在，可以用来区别单增李斯特菌ATCC 19114与斯氏李斯特菌ATCC 35867。

[0055] 当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。