用于检测多特异性结合物的结合搭档的方法

摘要

本文报道了用于检测样品中的多特异性抗体的游离抗原的方法，其中待检测的抗原可以被多特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：孵育包含游离抗原和多特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合。

权利要求

1.用于体外确定游离结合搭档的存在和/或量的方法，所述游离结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异的结合，其中，在检测游离结合搭档前，通过孵育样品与特异结合多特异性结合物的第二结合特异性的单特异性结合物，耗尽存在于样品中的与多特异性结合物结合的结合搭档部分，随后确定游离的结合搭档的存在和/或量；其中所述单特异性结合物结合到固相上。

2.根据权利要求1的方法，其中游离结合搭档是被分析物。

3.根据权利要求2的方法，其中所述被分析物是第一抗原或靶。

4.根据权利要求1的方法，其中所述单特异性结合物是第二抗原。

5.用于确定多特异性结合物的游离第一结合搭档的存在和/或量的体外方法，其中所述结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：-孵育包含游离第一结合搭档和多特异性结合物的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性结合物的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合；

-确定耗尽了多特异性结合物的样品中的游离的第一结合搭档的量；

其中所述第二抗原结合到固相上。

6.用于确定多特异性结合物的游离第一结合搭档的存在和/或量的体外方法，其中所述结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异的结合，其中方法包括步骤：-孵育包含第一结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异结合多特异性结合物的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，和-确定耗尽了多特异性结合物的样品中的游离的第一结合搭档的量；其中所述单特异性结合物结合到固相上。

7.根据权利要求6的方法，其中方法包括步骤：

-孵育包含第一结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异结合多特异性结合物的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，-在确定游离结合搭档的存在或量之前，从样品中耗尽单特异性结合物-多特异性结合物复合物，和-确定耗尽了多特异性结合物的样品中的游离的第一结合搭档的量。

8.根据权利要求6的方法，其中所述单特异性结合物为第二抗原。

9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中多特异性结合物选自抗体或包含抗体或抗体片段与非抗体多肽的融合多肽。

10.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中多特异性结合物为包含抗体或抗体片段与可溶性受体的融合多肽，或包含抗体或抗体片段与肽结合分子的融合多肽。

11.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中多特异性结合物是抗体。

12.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中多特异性结合物是双特异性抗体，或三特异性抗体，或四特异性抗体，或五特异性抗体，或六特异性抗体。

13.根据权利要求11的方法，其中抗体是双特异性抗体。

14.根据权利要求1、2、3、4、6、7或8中任一项的方法，其中单特异性结合物是抗独特型抗体。

15.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中结合特异性是结合位点。

16.根据权利要求15中的方法，其中结合位点是成对的抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。

17.根据权利要求4或5或8的方法，其中第二抗原是生物素化的，而固相包被了链霉抗生物素。

18.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中固相是包被了链霉抗生物素的顺磁珠或包被了链霉抗生物素的琼脂糖珠。

19.使用免疫测定用于免疫学确定样品中的多特异性结合物的游离结合搭档的存在和/或量的方法，其中所述结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异的结合，其中方法包括步骤：-孵育包含游离结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异结合多特异性结合物的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，和-确定耗尽了多特异性结合物的样品中的游离结合搭档的量；

其中所述单特异性结合物结合到固相上。

20.权利要求19的方法，其中所述单特异性结合物为第二抗原。

21.根据权利要求4、5、8和20中任一项的方法，其中第二抗原是包含至少两种第二抗原的混合物，所述至少两种第二抗原与固相缀合的位点不同。

22.根据权利要求21的方法，其中位点是第二抗原的氨基酸序列的氨基酸位置。

23.根据权利要求1至4和19中任一项的方法，其中待检测的结合搭档是多肽。

24.根据权利要求5至8中任一项的方法，其中第一结合搭档是多肽。

25.根据权利要求4、5、8和20中任一项的方法，其中第二抗原是多肽。

26.根据权利要求4、5、8和20中任一项的方法，其中第二抗原与固相的结合是通过化学结合来实施的，所述化学结合经由N-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)，不同赖氨酸的ε-氨基，多肽的氨基酸骨架的羧基-、巯基-、羟基-和/或酚-官能团，和/或多肽的碳水化合物结构的糖醇基。

27.根据权利要求4、5、8和20中任一项的方法，其中第二抗原是这样的混合物，其包含通过至少两种不同的氨基与固相缀合的第二抗原。

28.根据权利要求4、5、8和20中任一项的方法，其中第二抗原通过被动吸附与固相缀合。

29.根据权利要求4、5、8和20中任一项的方法，其中第二抗原通过特定的结合对缀合用于固定。

30.根据权利要求4、5、8和20中任一项的方法，其中第二抗原与生物素缀合，且通过固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素实施固定。

31.用于确定样品中的多特异性抗体的游离第一抗原的存在和/或量的体外方法，其中待检测的抗原可以被多特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，其中方法包括步骤：-孵育包含游离第一抗原和多特异性抗体的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合，-在确定游离抗原的存在或量之前，从样品中耗尽第二抗原-多特异性抗体复合物，和

-确定耗尽了多特异性抗体的样品中的游离第一抗原的量；

其中所述第二抗原结合到固相上。

32.根据权利要求1至8和19和31中任一项的方法，其中样品包括多特异性抗体、游离第一抗原和多特异性抗体-抗原复合物，并且检测多特异性抗体的游离第一抗原。

33.根据权利要求4、5、8、20和31中任一项的方法，其中第二抗原是与顺磁珠缀合的。

34.根据权利要求31的方法，其中第二抗原是生物素化的，而固相包被了链霉抗生物素。

35.根据权利要求19或31的方法，其中固相是包被了链霉抗生物素的顺磁珠或包被了链霉抗生物素的琼脂糖珠。

36.根据权利要求19或31的方法，其中结合特异性是结合位点。

37.根据权利要求36的方法，其中结合位点是成对的抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。

38.根据权利要求31的方法，其中方法包括下列步骤：-孵育包含多特异性抗体、结合多特异性抗体的第一抗原和游离第一抗原的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合，形成第二抗原-多特异性抗体复合物，和-从样品中去除第二抗原-多特异性抗体复合物。

39.根据权利要求31或38中任一项的方法，其中第二抗原-多特异性抗体复合物是第二抗原-多特异性抗体复合物和第二抗原-多特异性抗体-第一抗原复合物的混合物。

40.根据权利要求31的方法，其中方法包括下列步骤：-孵育包含第一抗原和多特异性抗体的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合，形成第二抗原-多特异性抗体复合物，和-从样品中去除第二抗原-多特异性抗体复合物，和

-确定耗尽了多特异性抗体的样品中的第一抗原的量。

41.根据权利要31的方法，其中确定第一抗原的量包括下列步骤：-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，所述捕获抗体特异的结合第一抗原，形成捕获抗体-第一抗原复合物，和-关联形成的捕获抗体-第一抗原复合物与样品中的第一抗原的量。

42.根据权利要求31中任一项的方法，其中确定第一抗原的量包括下列步骤：-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，所述捕获抗体特异的结合第一抗原，形成捕获抗体-第一抗原复合物，-孵育捕获抗体-第一抗原复合物与示踪抗体，借此捕获抗体和示踪抗体结合第一抗原上的非重叠表位，和-关联形成的捕获抗体-第一抗原-示踪抗体复合物与样品中的抗原的量。

43.根据权利要求31的方法，其中确定第一抗原的量包括下列步骤：-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，所述捕获抗体特异的结合第一抗原，形成捕获抗体-第一抗原复合物，-孵育捕获抗体-第一抗原复合物与示踪抗体，借此捕获抗体和示踪抗体结合第一抗原上的非重叠表位，-孵育捕获抗体-第一抗原-示踪抗体复合物与包含可检测标记的检测抗体，借此检测抗体在示踪抗体的可变结构域以外的表位上特异的结合示踪抗体，和-关联形成的捕获抗体-第一抗原-示踪抗体复合物与样品中的第一抗原的量。

44.根据权利要求31的方法，其中多特异性抗体是具有第一结合特异性和第二结合特异性的双特异性抗体，所述第一结合特异性特异的结合第一抗原或抗原上的第一表位，所述第二结合特异性特异的结合第二抗原或抗原上的第二表位。

45.根据权利要求31的方法，其中第一抗原和第二抗原是相同的抗原，第一结合特异性结合抗原上的第一表位，第二结合特异性结合抗原上的第二表位，借此第二表位是与第一表位不重叠的表位，而与第一结合特异性的结合不干扰与第二结合特异性结合。

46.根据权利要求31的方法，其中所述方法包括步骤：-在确定第一抗原的存在或量之前，从样品中耗尽形成的复合物。

47.根据权利要求4、5、8、20和31中任一项的方法，其中第二抗原是标记的第二抗原。

48.根据权利要求4、5、8、20和31中任一项的方法，其中第二抗原是通过特定的结合对固定在固相上的。

49.根据权利要求48的方法，其中特定的结合对是生物素和链霉抗生物素。

50.根据权利要求31的方法，其中方法包括以下步骤作为第二步骤：-孵育在第一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合第一抗原的抗体。

说明书

用于检测多特异性结合物的结合搭档的方法

[0001] 本申请为2013年1月29日提交的、发明名称为“用于检测多特异性结合物的结合搭档的方法”的PCT申请PCT/EP2013/051604的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2014年7月30日，申请号为201380007278.5。

[0002] 本发明涉及用于检测/确定样品中的游离的(即，未复合的)多特异性结合物的结合搭档的方法，所述结合搭档(binding partner)可以被样品中的多特异性结合物(multispecific binder)特异性结合，其中在检测游离的结合搭档之前，从样品中耗尽了与多特异性结合物结合的结合搭档。耗尽的多特异性结合物可用于检测/确定复合的结合搭档。

[0003] 发明背景

[0004] 含有抗体的标准固相免疫测定涉及在固相上吸附/固定的抗体(捕获抗体)、抗原和针对与酶或可检测的标记(示踪抗体)缀合的抗原的另一表位的抗体之间形成复合物。在测定中，形成夹心物(sandwich)：固相/捕获抗体/抗原/示踪抗体。在夹心物等催化的反应中，抗体-缀合酶的活性与孵育基质中的抗原浓度成比例。抗独特型抗体测定提及在例如US 5,219,730；WO 87/002778；EP 0  139  389和EP 0 170 302中。Wadhwa，M.等人(J.Immunol.Methods 278(2003)1-17)报道了用于检测、测量和表征由生物治疗剂诱导的不理想抗体的对策。EP 1 917 854中报道了用于生产抗独特型抗体的方法。

[0005] Chen，Y.-P.等人(Clin.Vac.Immunol.14(2007)720-725)报道了通过同时针对人红细胞和乙肝病毒表面抗原的双特异性双抗体介导的凝集测定快速检测乙肝病毒表面抗原。Porter，R.等报道了利用自我装配的单层修饰电极的电活性免疫测定系统(EASI测定)(Biosensors Bioelec.16(2001)9-12)。Berkova，，N.等(Biotechnol.Appl.Biochem.23(1996)163-171)报道了利用hTNF-α和辣根过氧化物酶的双特异性抗体，测量人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)的酶免疫测定法的发展。在EP 0 962 771中，还报道了用于相同目的的检测装置和方法。Reinhartz，H.W.等(Analyst 121(1996)767-771)报道了通过实时相互作用分析研究的双特异性多价抗体，用于研发抗原-抑制的酶联免疫吸附测定。Doppalapudi，V.R.等(Proc.Natl.Acad.Sci.107(2010)22611-22616)报道了化学生成双特异性抗体。

[0006] 发明概述

[0007] 本文报道了用于检测样品中的游离(即，未复合的)结合搭档的存在，或用于确定样品中的游离(即，未复合的)结合搭档的量的方法，所述结合搭档可以被多特异性结合物至少一个结合特异性，即，第一结合特异性特异的结合。

[0008] 已发现，在确定游离的结合搭档的量之前，从样品中耗尽被多特异性结合物特异的结合的结合搭档，即，结合搭档-多特异性结合物-复合物，是有利的。

[0009] 本文报道的方法通过如下孵育样品，实现耗尽多特异性结合物，所述样品或者与结合搭档(即，第二结合搭档)孵育，所述结合搭档可以被多特异性结合物的不同(即，第二)结合特异性所特异的结合，所述结合特异性不结合待确定的结合搭档(即，第一结合搭档)；所述样品或者与单特异性结合物结合，所述单特异性结合物特异的结合多特异性结合物的一个结合特异性，借此，单特异性结合物特异结合多特异性结合物的结合特异性，该结合特异性不结合待确定的结合搭档(参见图2)。

[0010] 本文报道的一个方面是用于确定样品中的双特异性抗体的(第一)抗原的存在和/或量的体外方法，借此待检测的抗原可以被双特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，从而使抗原与双特异性抗体复合(抗原-双特异性抗体-复合物)，包括步骤：

[0011] -孵育包含抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合。

[0012] 在一个实施方案中，方法包括步骤：

[0013] -孵育包含抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和

[0014] -检测抗原-双特异性抗体-抗独特型抗体的复合物，从而确定双特异性抗体的抗原的存在和/或量。

[0015] 在一个实施方案中，方法包括步骤：

[0016] -孵育包含抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和

[0017] -孵育在第一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合抗原的抗体，从而确定样品中的双特异性抗体的抗原的存在和/或量。

[0018] 在一个实施方案中，方法用于确定与双特异性抗体复合的双特异性抗体的抗原的存在和/或量。

[0019] 在一个实施方案中，方法包括下列步骤：

[0020] -提供包含抗原和双特异性抗体的样品，其中至少90％的抗原与双特异性抗体复合，

[0021] -孵育包含抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和

[0022] -孵育在第一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合抗原的抗体，从而确定样品中的双特异性抗体的抗原的存在和/或量。

[0023] 在一个实施方案中，方法包括下列步骤：

[0024] -孵育包含抗原和双特异性抗体的样品与一定量的双特异性抗体，以提供其中至少90％的抗原被双特异性抗体复合的样品，

[0025] -孵育包含被双特异性抗体复合的抗原的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和

[0026] -孵育在前一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合抗原的抗体，从而确定样品中的双特异性抗体的抗原的存在和/或量。

[0027] 在一个实施方案中，双特异性抗体的量为约1μg/ml至10μg/ml，优选约1.5μg/ml。

[0028] 在一个实施方案中，双特异性抗体的量是1mg/ml样品。

[0029] 在一个实施方案中，至少95％的抗原是与双特异性抗体复合的。在一个实施方案中，至少98％的抗原是与双特异性抗体复合的。

[0030] 本文报道的一个方面是用于确定样品中的双特异性抗体的结合抗体的(第一)抗原的量的体外方法，借此抗原可以被双特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：

[0031] -孵育第一等份的包含抗原和双特异性抗体的样品与一定量的双特异性抗体，以提供其中至少90％的抗原被双特异性抗体复合的样品，

[0032] -孵育包含被双特异性抗体复合的抗原的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和

[0033] -孵育在前一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合抗原的抗体，从而确定样品中的双特异性抗体的抗原的存在和/或量，和确定样品中存在的抗原总量，

[0034] -孵育第二等份的包含抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和

[0035] -孵育形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合抗原的抗体，从而确定样品中存在的双特异性抗体的游离抗原的量，和

[0036] -通过在样品中存在的抗原总量与样品中存在的游离抗原的量之间的差异，确定双特异性抗体的抗体结合型抗原的量。

[0037] 在一个实施方案中，双特异性抗体的量为约1μg/ml至10μg/ml，优选约1.5μg/ml。

[0038] 在一个实施方案中，双特异性抗体的量是1mg/ml样品。

[0039] 本文报道的一个方面是用于体外确定结合搭档(抗原、靶、被分析物)的存在和/或量的方法，所述结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异的结合，其中，在检测结合搭档前，通过孵育样品与第二结合搭档或特异结合多特异性结合物的第二结合特异性的单特异性结合物，耗尽存在于样品中的与多特异性结合物结合的结合搭档部分，所述第二结合搭档可以被多特异性结合物的第二结合特异性特异的结合。

[0040] 在一个实施方案中，待检测的结合搭档是未复合的结合搭档或游离结合搭档。

[0041] 因此，本文报道的一个方面是用于确定多特异性结合物的(第一)结合搭档的存在和/或量的体外方法，其中所述结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：

[0042] -孵育包含(第一)结合搭档和多特异性结合物的样品与第二结合搭档，所述第二结合搭档可以被多特异性结合物的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合。

[0043] 在一个实施方案中，方法包括步骤：

[0044] -孵育包含(第一)结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异结合多特异性结合物的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，和[0045] -确定耗尽了多特异性结合物的样品中的(游离的第一)结合搭档的量。

[0046] 在一个实施方案中，方法包括步骤：

[0047] -孵育包含(第一)结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异结合多特异性结合物的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异，[0048] -在确定游离结合搭档的存在或量之前，从样品中耗尽单特异性结合物-多特异性结合物复合物，和

[0049] -确定耗尽了多特异性结合物的样品中的(游离的第一)结合搭档的量。

[0050] 通过与被多特异性结合物的第二结合特异性特异结合的第二结合搭档孵育，从样品中去除/耗尽多特异性结合物。同时，还从样品中去除(第一)结合搭档-多特异性结合物-复合物。

[0051] 在一个实施方案中，多特异性结合物选自抗体、包含抗体或抗体片段与非抗体多肽的融合多肽，包含抗体或抗体片段与可溶性受体的融合多肽，或包含抗体或抗体片段与肽结合分子的融合多肽。

[0052] 在一个实施方案中，多特异性结合物是抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体，或三特异性抗体，或四特异性抗体，或五特异性抗体，或六特异性抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。

[0053] 在一个实施方案中，单特异性结合物是抗独特型抗体。

[0054] 在一个实施方案中，结合特异性是结合位点或成对的抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。

[0055] 在一个实施方案中，第二结合搭档或单特异性结合物是与固相结合的。

[0056] 在一个实施方案中，第二结合搭档是生物素化的，而固相包被了链霉抗生物素。在一个实施方案中，固相是包被了链霉抗生物素的顺磁珠或包被了链霉抗生物素的琼脂糖珠。

[0057] 本文报道的一个方面是使用免疫测定用于免疫学确定样品中的多特异性结合物的结合搭档的存在和/或量的方法，其中在确定结合搭档之前，从样品中耗尽多特异性结合物。

[0058] 在本文报道的所有方面的一个实施方案中，结合搭档是游离结合搭档，即，结合搭档没有被多特异性结合物结合或复合。

[0059] 在一个实施方案中，第二结合搭档是生物素化的第二结合搭档，并通过链霉抗生物素与固相缀合。

[0060] 在本文报道的方法的一个实施方案中，第二结合搭档是包含至少两种第二结合搭档的混合物，所述至少两种第二结合搭档与固相缀合的位点不同。在一个实施方案中，位点是第二结合搭档的氨基酸序列的氨基酸位置。

[0061] 在一个实施方案中，第一结合搭档是多肽。

[0062] 在一个实施方案中，第二结合搭档是多肽。

[0063] 在一个实施方案中，多肽与其缀合搭档的缀合是通过化学结合来实施的，所述化学结合经由N-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)，不同赖氨酸的ε-氨基，多肽的氨基酸骨架的羧基-、巯基-、羟基-和/或酚-官能团，和/或多肽的碳水化合物结构的糖醇基。

[0064] 在一个实施方案中，第二结合搭档是这样的混合物，其包含通过至少两种不同的氨基与固相缀合的第二结合搭档。这类通过不同氨基的偶联可以通过如下实施：第一步，ε-氨基的一部分与化学保护剂酰基化，例如通过柠康酰化(citraconylation)。在第二步，通过剩余氨基实施缀合。之后，去除柠康酰化作用，结合搭档通过剩余的游离氨基与固相缀合，即，获得的结合搭档通过未被柠康酰化保护的氨基与固相缀合。合适的化学保护剂在未保护的侧链胺上形成键，与N-末端的键不同且较不稳定。许多这类化学保护剂是已知的(参见例如EP 0 651 761)。在一个实施方案中，化学保护剂包括环状二羧酸酸酐，例如马来酸酐或柠康酸酐。

[0065] 在一个实施方案中，第二结合搭档通过被动吸附与固相缀合。被动吸附是例如Butler，J.E.在“Solid Phases in Immunoassay”(1996)205-225和Diamandis，E.P.和Christopoulos，T.K.(编者)在“Immunoassay”(1996)Academic Press(San Diego)中描述的。

[0066] 在一个实施方案中，第二结合搭档通过特定的结合对缀合(固定)。在一个实施方案中，这类结合对(第一组分/第二组分)选自链霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、抗体/抗原(参见例如，Hermanson，G.T.等人，Bioconjugate Techniques，Academic Press(1996))、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。在一个实施方案中，第二结合搭档与生物素缀合，且通过固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素实施固定。

[0067] 本文报道的一个方面是用于确定样品中的多特异性抗体的(第一)抗原的存在和/或量的方法，其中待检测的抗原可以被多特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：

[0068] -孵育包含多特异性抗体、结合了多特异性抗体的(第一)抗原和游离(第一)抗原的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合。

[0069] 在一个实施方案中，方法包括步骤：

[0070] -孵育包含多特异性抗体、结合了多特异性抗体的(第一)抗原和游离(第一)抗原的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合，和

[0071] -确定耗尽了多特异性抗体的样品中的(第一)抗原的量。

[0072] 在一个实施方案中，方法包括步骤：

[0073] -孵育包含(第一)抗原和多特异性抗体的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合，

[0074] -在确定游离抗原的存在或量之前，从样品中耗尽第二抗原-多特异性抗体复合物，和

[0075] -确定耗尽了多特异性抗体的样品中的(第一)抗原的量。

[0076] 通过与可以被多特异性抗体的第二结合特异性特异结合的第二抗原孵育，从样品中去除多特异性抗体。同时，还从样品中去除(第一)抗原-多特异性抗体-复合物。

[0077] 在一个实施方案中，样品包括多特异性抗体、游离(第一)抗原和多特异性抗体-抗原复合物，检测多特异性抗体的游离(第一)抗原。

[0078] 在一个实施方案中，第二抗原是与顺磁珠缀合的。

[0079] 在一个实施方案中，第二抗原是与固相缀合的。

[0080] 在一个实施方案中，第二抗原是生物素化的，而固相包被了链霉抗生物素。在一个实施方案中，固相是包被了链霉抗生物素的顺磁珠或包被了链霉抗生物素的琼脂糖珠。

[0081] 在一个实施方案中，结合特异性是结合位点。在一个实施方案中，结合位点是成对的抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。

[0082] 在一个实施方案中，方法包括下列步骤：

[0083] -孵育包含多特异性抗体、结合多特异性抗体的(第一)抗原和游离(第一)抗原的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合，形成第二抗原-多特异性抗体复合物，和

[0084] -从样品中去除第二抗原-多特异性抗体复合物。

[0085] 在一个实施方案中，第二抗原-多特异性抗体复合物是第二抗原-多特异性抗体复合物和第二抗原-多特异性抗体-(第一)抗原复合物的混合物。

[0086] 在一个实施方案中，方法包括下列步骤：

[0087] -孵育包含(第一)抗原和多特异性抗体的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合，形成第二抗原-多特异性抗体复合物，和

[0088] -从样品中去除第二抗原-多特异性抗体复合物，和

[0089] -确定耗尽了多特异性抗体的样品中的(第一)抗原的量。

[0090] 在一个实施方案中，确定(第一)抗原的量包括下列步骤：

[0091] -孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，所述捕获抗体特异的结合(第一)抗原，形成捕获抗体-(第一)抗原复合物，和

[0092] -关联形成的捕获抗体-(第一)抗原复合物与样品中的(第一)抗原的量。

[0093] 在一个实施方案中，确定(第一)抗原的量包括下列步骤：

[0094] -孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，所述捕获抗体特异的结合(第一)抗原，形成捕获抗体-(第一)抗原复合物，

[0095] -孵育捕获抗体-(第一)抗原复合物与示踪抗体，借此捕获抗体和示踪抗体结合(第一)抗原上的非重叠表位，和

[0096] -关联形成的捕获抗体-(第一)抗原-示踪抗体复合物与样品中的抗原的量。

[0097] 在一个实施方案中，确定(第一)抗原的量包括下列步骤：

[0098] -孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，所述捕获抗体特异的结合(第一)抗原，形成捕获抗体-(第一)抗原复合物，

[0099] -孵育捕获抗体-(第一)抗原复合物与示踪抗体，借此捕获抗体和示踪抗体结合(第一)抗原上的非重叠表位，

[0100] -孵育捕获抗体-(第一)抗原-示踪抗体复合物与包含可检测标记的检测抗体，借此检测抗体在示踪抗体的可变结构域以外的表位上特异的结合示踪抗体，和

[0101] -关联形成的捕获抗体-(第一)抗原-示踪抗体复合物与样品中的(第一)抗原的量。

[0102] 在一个实施方案中，多特异性抗体是具有第一结合特异性和第二结合特异性的双特异性抗体，所述第一结合特异性特异的结合第一抗原或抗原上的第一表位，所述第二结合特异性特异的结合第二抗原或抗原上的第二表位。

[0103] 在一个实施方案中，第一抗原和第二抗原是相同的抗原，第一结合特异性结合抗原上的第一表位，第二结合特异性结合抗原上的第二表位，借此第二表位是与第一表位不重叠的表位，而与第一结合特异性的结合不干扰与第二结合特异性结合。

[0104] 在一个实施方案中，方法包括步骤：

[0105] -在确定(第一)抗原的存在或量之前，从样品中耗尽形成的复合物。

[0106] 本文报道的一个方面是用于确定样品中的多特异性抗体的(第一)抗原的存在和/或量的体外方法，借此待检测的抗原可以被多特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：

[0107] -孵育包含(第一)抗原的样品与双特异性抗体和第二抗原的复合物或双特异性抗体和抗独特型抗体的复合物，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性。

[0108] 在一个实施方案中，第二抗原是标记的第二抗原。在一个实施方案中，第二抗原是通过特定的结合对固定在固相上的。在一个实施方案中，特定的结合对是生物素和链霉抗生物素。

[0109] 在一个实施方案中，方法包括以下步骤作为第二步骤：

[0110] -孵育在第一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合第一抗原的抗体。

[0111] 本文报道的一个方面是用于确定样品中的双特异性抗体的(第一)抗原的存在和/或量的体外方法，其中待检测的抗原可以被双特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：

[0112] -孵育包含(第一)抗原的样品与双特异性抗体和第二抗原或双特异性抗体和抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中第二抗原或抗独特型抗体被固相结合。

[0113] 在一个实施方案中，方法包括以下步骤作为第二步骤：

[0114] -孵育在第一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合第一抗原的抗体，借此确定样品中的双特异性抗体的(第一)抗原的量。

[0115] 本文报道的一个方面是用于确定样品中与双特异性抗体复合的双特异性抗体的(第一)抗原(第一抗原-双特异性抗体-复合物)的存在和/或量的体外方法，其中待检测的抗原可以被双特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：

[0116] -孵育包含(第一)抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合。

[0117] 在一个实施方案中，方法包括以下步骤作为第二步骤：

[0118] -孵育在第一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合第一抗原的抗体，借此确定样品中与双特异性抗体复合的双特异性抗体的(第一)抗原(第一抗原-双特异性抗体-复合物)的量。

[0119] 在一个实施方案中，方法包括步骤：

[0120] -在确定(第一)抗原的存在或量之前，从样品中耗尽形成的复合物。

[0121] 发明详述

[0122] 本文报道了用于预处理样品，检测临床前和临床样品中的多特异性结合物的“游离和/或总结合搭档”的体外方法，所述多特异性结合物例如双特异性抗体/药物。

[0123] 已发现在检测游离结合搭档之前，从样品中耗尽多特异性结合物是有利的。

[0124] 已发现为了将样品中几乎所有的结合搭档转化为所定义的复合物，孵育样品和样品的多特异性结合物是有利的。

[0125] 已发现使用抗独特型抗体捕获多特异性结合物是有利的。

[0126] 本文报道了可以被治疗性多特异性抗体的第二结合特异性特异结合的第二结合搭档的用途，用于确定(游离的第一)抗原的水平，所述抗原能够但尚未被多特异性治疗性抗体的第一结合特异性结合。第二抗原用于从样品中耗尽多特异性抗体和多特异性抗体-待检测抗原-复合物。

[0127] 因此，本文报道了用于确定多特异性结合物的游离(第一)结合搭档(抗原、靶和被分析物)的体外方法，所述游离结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异性地结合，其中在确定游离结合搭档之前，通过孵育样品和能够被多特异性结合物的第二结合特异性所特异性结合的并且随之从样品中耗尽多特异性结合物和多特异性结合物-(第一)结合搭档-复合物的第二结合搭档，从样品中耗尽多特异性结合物，其中第二结合特异性不同于第一结合特异性。

[0128] 在下文中，用这样的多特异性抗体和抗原示例本文报道的方法，作为多特异性结合物的实施方案，所述多特异性抗体特异性结合多种抗原或相同抗原上的多个表位，作为(第一)结合搭档的实施方案，所述(第一)抗原被多特异性抗体的第一结合特异性特异的结合。

[0129] 本文中的术语“抗体”是广义使用的，涵盖了各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其表现出理想的抗原结合活性。

[0130] 在某些实施方案中，抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同的位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一个结合特异性是针对第一抗原的，另一个结合特异性是针对不同的第二抗原的。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合相同抗原的2个不同的表位。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体是特异性结合第一和第二抗原的双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体具有i)特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位的第一结合特异性，和ii)特异性结合第二抗原或相同抗原上的第二表位的第二结合特异性。在一个实施方案中，相同抗原上的第二表位是不重叠的表位。

[0131] 多特异性抗体描述在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792或WO 
2010/145793中。

[0132] “抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

[0133] 抗体的“类”指抗体重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中若干可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类型的免疫球蛋白对应的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。

[0134] 术语“游离抗原”表示这样的抗原，其可以被抗体的结合特异性特异的结合，但目前还没有结合该结合特异性。在一个实施方案中，游离抗原是未结合抗体的抗原或未与抗体复合的抗原。

[0135] 术语“Fc-区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，其含有恒定区的至少一部分。术语包括天然序列Fc-区和变体Fc-区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc-区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc-区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外说明，否则Fc-区或恒定区的氨基酸残基编号是根据EU编号系统的，也被称为EU指数，如Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242。

[0136] “框架”或“FR”指除超变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般出现在VH(或VL)的下列序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

[0137] “人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞生产的抗体的氨基酸序列，或源自利用人抗体储库或其他人抗体编码序列的来自非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这一定义具体排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

[0138] “人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常2个可变结构域，其中所有的或基本上所有的HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，而所有的或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选的可包括至少一部分源自人抗体的抗体恒定区。抗体的“人源化形态”，例如非人抗体，指经过了人源化作用的抗体。

[0139] 如本文中使用的，术语“超变区”或“HVR”指抗体可变结构域中序列高度变化和/或形成结构定义的环(“超变环”)的每个区域。一般而言，天然的四链抗体包括6个HVR；3个在VH中(H1、H2、H3)，3个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包括来自超变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性的超变环出现在第26-32位(L1)、第50-52位(L2)、第91-96位(L3)、第26-32位(H1)、第53-55位(H2)和第96-101位(H3)氨基酸残基(Chothia，C.和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的第24-34位、L2的第
50-56位、L3的第89-97位、H1的第31-35B位、H2的第50-65位和H3的第95-102位氨基酸残基(Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication 
91-3242)。除了VH中的CDR1外，CDR一般包括形成超变环的氨基酸残基。CDR还包括“特异性决定残基”或“SDR”，是接触抗原的残基。包含在CDR区域中的SDR被称为缩写-CDR或a-CDR。
示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出现在L1的第31-34位、L2的第50-55位、L3的第89-96位、H1的第31-35B位、H2的第50-58位和H3的第95-
102位氨基酸残基(Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)。除非另外指出，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中是根据Kabat等人，见上文编号的。

[0140] 如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除可能的变体抗体外，包含在群体中的单个抗体是相同的和/或结合相同表位，例如含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制品的过程中产生的突变，这类变体一般只以微量存在。与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，单克隆抗体制品的每个单克隆抗体都针对抗原上的单个决定子。因此，修饰词“单克隆”表示从基本均质的抗体群体中获得的抗体的特征，而不被视为要求通过任何特定的方法生产抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了这类方法和其他用于制备单克隆抗体的示例性方法。

[0141] “多肽”是由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，不论其是天然或合成产生的。少于约20个氨基酸残基的多肽可以被称为“肽”，而由2个或多个多肽组成的分子，或者包含一个多于100个氨基酸残基的多肽的分子可以被称为“蛋白质”。多肽还可以包含非氨基酸组分，如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以由表达多肽的细胞添加，并可随细胞类型改变。在本文中，按照多肽的氨基酸骨架的结构或编码其的核酸定义多肽。
一般不具体指出添加物，如碳水化合物基团，但其可存在。

[0142] 术语“可变区”或“可变结构域”指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构，每个结构域包含4个保守的框架区(FR)和3个超变区(HVR)(参见例如Kindt，T.J.等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman和Co.，N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域足以产生抗原-结合特异性。此外，可以使用结合抗原的抗体的VH或VL结构域，分别筛选互补VL或VH结构域文库，分离结合特定抗原的抗体(参见例如Portolano，S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等人，Nature 352(1991)624-628)。

[0143] 术语“抗独特型抗体”表示特异性结合亲本抗体的结合特异性(如结合位点)的抗体，即，针对例如亲本抗体的抗原结合位点。在一个实施方案中，抗独特型抗体特异性结合亲本抗体的一个或多个CDR。在一个实施方案中，亲本抗体是治疗性抗体。在一个实施方案中，亲本抗体是多特异性抗体。在一个实施方案中，亲本抗体是双特异性抗体。

[0144] 如果通过表面等离振子共振(SPR)测定检测到信号降低50％或更多，在一个实施方案中，降低75％或更多，则两个表位是重叠的，所述SPR使用固定的抗体和可溶性抗原，或反之亦然，其中研究的表位的浓度是20-50nM，需要检测表位重叠的抗体的浓度是100nM。可选的，可以使用这样的方法，其中结合相同抗原的两个抗体的表位重叠是在竞争性测试系统的帮助下确定的。出于该目的，例如在基于细胞的酶免疫测定(ELISA)的帮助下，应用表达重组抗原表位的细胞，测试需要检测表位重叠的抗体是否与其它抗体竞争结合固定抗原。出于该目的，孵育固定抗原与标记形态的抗体和需要确定表位重叠的过量抗体。通过检测结合的标记，可以简单地验证表位重叠。如果关于已知抗体，确定了在相同浓度下，信号降低大于70％，在一个实施方案中，降低大于80％，或在更高浓度下(在一种情形中，105-倍过量的需要被测定表位重叠的抗体)，替换大于80％，在一个实施方案中，替换大于90％，则存在表位一致性或重叠，且两种抗体结合相同抗原上相同的或重叠的表位。

[0145] 不同的免疫测定的原则描述在例如Hage，D.S.(Anal.Chem.71(1999)294R-304R)中。Lu，B.等人(Analyst 121(1996)29R-32R)报道了定向固定抗体，用于免疫测定。例如Wilchek，M.，和Bayer，E.A.，在Methods Enzymol.184(1990)467-469报道了抗生物素蛋白-生物素-介导的免疫测定。

[0146] 多肽和单克隆抗体及其恒定结构域含有多个反应性氨基酸侧链，用于偶联结合搭档，如表面、蛋白质、聚合物(例如，PEG、纤维素或聚苯乙烯)、酶或结合对的成员。氨基酸的化学反应基是例如氨基(赖氨酸、α-氨基)、巯基(胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)、羧酸基(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。这类方法描述在例如Aslam M.和Dent，A.的“Bioconjugation”，MacMillan Ref.Ltd.1999，第50-100页中。

[0147] 最常见的多肽和抗体的反应基团之一是氨基酸赖氨酸的脂肪族ε-胺。一般而言，几乎所有的多肽和抗体都含有丰富的赖氨酸。在高于pH 8.0时(pKa＝9.18)，赖氨酸胺是相当好的亲核基团，因此简单完全的与多种试剂反应，形成稳定的键。胺-反应试剂主要与赖氨酸和蛋白质的α-氨基反应。反应性酯，特别是N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)酯，是最常应用的修饰胺基的试剂。用于在含水环境中反应的最佳pH是pH 8.0至9.0。异硫氰酸盐/酯是胺修饰试剂，与蛋白质形成硫脲键。它们在含水溶液中与蛋白质胺反应(最佳是在pH 9.0至9.5)。醛类在温和的含水条件下与脂肪族或芳香族胺类、肼类和酰肼类反应，形成亚胺中间物(希夫氏碱)。希夫氏碱可以用温和的或强的还原剂(如硼氢化钠或氰硼氢化钠)选择性还原，衍生出稳定的烷基胺键。用于修饰胺类的其他试剂是酸酐。例如，二乙烯三胺五乙酸酸酐(DTPA)是含有2个胺-反应性酸酐基的双功能螯合剂。它可以与氨基酸的N-末端和ε-氨基反应，形成酰胺键。打开酸酐环，生成多价的金属螯合臂，其能够与配位复合物中的金属紧密结合。

[0148] 多肽和抗体中另一种常见的反应基是来自含硫氨基酸——胱氨酸及其还原产物半胱氨酸(或二分之一胱氨酸)的巯基残基。半胱氨酸含有游离的巯基，比胺更亲核，一般是蛋白质中的最反应性官能团。巯基一般在中性pH下是反应性的，因此可以在存在胺的条件下与其他分子选择性偶联。由于游离的巯基是相对反应性的，具有这些基团的蛋白质的基团通常以二硫基或二硫键的氧化形态存在。在这类蛋白质中，用试剂如二硫苏糖醇(DTT)还原二硫键是生成反应性游离巯基必需的。巯基反应试剂是多肽上将偶联巯基以形成硫醚偶联产物的试剂。这些试剂在弱酸性至中性pH下快速的反应，因此可以在存在胺基的条件下选择性反应。文献报道了若干种硫醇化交联剂的用途，如Traut试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷)、琥珀酰亚氨基(乙酰硫基)乙酸酯(SATA)和磺基琥珀酰亚氨基6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)，用于提供通过反应性氨基导入多个巯基的有效方式。卤乙酰基衍生物(例如碘乙酰胺)形成硫醚键，并且也是用于巯基修饰的试剂。其他有效的试剂是马来酰亚胺。马来酰亚胺与巯基反应性试剂的反应基本上和与碘乙酰胺的反应相同。马来酰亚胺在弱酸性至中性pH下快速的反应。

[0149] 多肽和抗体中的另一类常见反应基是羧酸。多肽和抗体在C-末端位置上、在天冬氨酸和谷氨酸的侧链中含有羧酸基。羧酸在水中相对较低的反应性通常导致难以利用这类基团选择性的修饰多肽和抗体。当进行修饰时，通常利用水溶性碳二亚胺将羧酸基转化为反应性酯，并且所述羧酸基与亲核试剂如胺、酰肼或肼反应。含胺的试剂应该是弱碱性的，从而在存在赖氨酸的更强碱性的ε-氨基的条件下，与活化的羧酸选择性反应，形成稳定的酰胺键。当pH升高到高于8.0时，可以发生蛋白质交联。

[0150] 高碘酸钠可用于将与抗体相连的碳水化合物部分中的糖的醇部分氧化为醛。每个醛基可以与针对羧酸所述的胺、酰肼或肼反应。由于碳水化合物部分主要出现在抗体的可结晶片段(Fc)区中，可以通过定点修饰远离抗原结合位点的碳水化合物来实现缀合。形成希夫氏碱中间物，可以通过用氰硼氢化钠(温和的和选择性的)或硼氢化钠(强)水溶性还原剂还原中间物，将其还原成烷基胺。

[0151] 术语“样品”包括但不限于来自活物或之前的活物的任意量的物质。这类活物包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其他动物。在一个实施方案中，样品获得自猴子尤其食蟹猴、或兔、或小鼠、或大鼠。在一个实施方案中，这类物质包括但不限于来自个体的全血、血清或血浆，这是临床常规中最普遍使用的样品源。

[0152] 术语“固相”表示非液体的物质，包括由例如聚合物、金属(顺磁、铁磁颗粒)、玻璃和陶瓷的材料制成的颗粒(包括微粒和珠子)；凝胶物质，如硅石、矾土和聚合物凝胶；毛细管，可由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物质；电极；微滴定板；固体条(stripe)；和比色杯、试管或其他分光光度计的样品容器。固相组分与惰性固体表面的区别在于“固相”在其表面上含有至少一个部分预期与样品中的物质相互作用。固相可以是固定组分，如试管、条、比色杯或微滴定板，或者可以是不固定的组分，如珠子和微粒。可以使用多种允许蛋白质和其他物质非共价或共价连接的微粒。这类颗粒包括聚合物颗粒，如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸酯)；金粒，如金纳米颗粒和金胶体；以及陶瓷颗粒，如硅石、玻璃和金属氧化物颗粒。参见例如，Martin，C.R.等，Analytical Chemistry-News&Features，70(1998)322A-327A，或Butler，J.E.，Methods 22(2000)4-23。

[0153] 在一个实施方案中，从色素原(荧光或发光的基团和染料)、酶、NMR-活性基、金属颗粒或半抗原(如地高辛配基)中选择可检测的标记。可检测的标记还可以是可以光可激活的交联基团，例如，叠氮基或1H-氮杂环丙烯基。还在一个实施方案中，可以通过电化学发光检测的金属螯合物是发出信号的基团，特别优选的是钌螯合物，例如，钌(双吡啶)32+螯合物。合适的钌标记基团描述在例如EP 0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511和WO 92/14138中。

[0154] 本文中报道了用于确定样品中的多特异性抗体的(游离第一)抗原的存在和/或量的方法，包括能被多特异性抗体的一个结合特异性特异结合的固相固定的第二抗原，所述结合特异性不是多特异性抗体中特异性结合待确定的(游离第一)抗原的结合特异性，用于在确定(游离第一)抗原的量之前，从样品中耗尽复合形态的或非复合形态的多特异性抗体。

[0155] 在一个实施方案中，方法包括在确定游离(第一)抗原的存在或量之前，从样品中耗尽第二抗原-多特异性抗体-复合物。

[0156] 在一个实施方案中，通过抗原桥接免疫测定法，确定耗尽了多特异性抗体的样品中的(游离第一)抗原的存在和/或量。在一个实施方案中，免疫测定法包括捕获抗体和示踪抗体，其中捕获抗体与固相缀合，而示踪抗体与可检测的标记缀合。

[0157] 本文报道的一个方面是用于确定样品中的多特异性抗体的(游离第一)抗原的存在和/或量的体外方法，其中待检测的抗原可以被多特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：

[0158] -孵育包含(第一)抗原和多特异性抗体的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体中不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合，从而从样品中去除多特异性抗体。

[0159] 本领域技术人员已知，由于热动力学平衡，包含抗原和可以特异性结合抗原的抗体的样品包括游离抗原、结合抗体的抗原和游离抗体的混合物。

[0160] 在一个实施方案中，方法包括下列步骤：

[0161] -孵育包含(第一)抗原和多特异性抗体的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体中不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合，形成第二抗原-多特异性抗体复合物，和

[0162] -从样品中去除第二抗原-多特异性抗体复合物。

[0163] 在一个实施方案中，方法包括下列步骤：

[0164] -孵育包含(第一)抗原和多特异性抗体的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体中不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合，形成第二抗原-多特异性抗体复合物，

[0165] -从样品中去除第二抗原-多特异性抗体复合物，和

[0166] -确定耗尽了多特异性抗体的样品中的(第一)抗原的量。

[0167] 在一个实施方案中，方法包括步骤：

[0168] -在确定游离(第一)抗原的存在或量之前，从样品中耗尽第二抗原-多特异性抗体-复合物。

[0169] 在一个实施方案中，方法包括步骤：

[0170] -孵育包含(第一)抗原和多特异性抗体的样品与第二抗原，所述第二抗原可以被多特异性抗体中不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合，

[0171] -在确定游离(第一)抗原的存在或量之前，从样品中耗尽第二抗原-多特异性抗体复合物，和

[0172] -确定耗尽了多特异性抗体的样品中的(第一)抗原的量。

[0173] 在一个实施方案中，通过抗原桥接免疫测定法，确定(第一)抗原的存在和/或量。

[0174] 在一个实施方案中，确定(第一)抗原的存在和/或量是确定游离(第一)抗原的量。

[0175] 在一个实施方案中，确定(第一)抗原的存在和/或量包括下列步骤：

[0176] -孵育耗尽了多特异性抗体的样品与特异结合(第一)抗原的捕获抗体，形成捕获抗体-抗原复合物，和

[0177] -关联所形成的捕获抗体-(第一)抗原复合物的量与样品中的抗原的量。

[0178] 在一个实施方案中，确定(第一)抗原的存在和/或量包括下列步骤：

[0179] -孵育耗尽了多特异性抗体的样品与特异结合(第一)抗原的捕获抗体，形成捕获抗体-(第一)抗原复合物，

[0180] -孵育捕获抗体-(第一)抗原复合物与示踪抗体，其中所述捕获抗体和示踪抗体结合(第一)抗原上的非重叠表位，和

[0181] -关联所形成的捕获抗体-(第一)抗原-示踪抗体复合物与样品中的(第一)抗原的量。

[0182] 在一个实施方案中，示踪抗体包括可检测的标记。

[0183] 在一个实施方案中，确定(第一)抗原的存在和/或量包括下列步骤：

[0184] -孵育耗尽了多特异性抗体的样品与特异结合(第一)抗原的捕获抗体，形成捕获抗体-(第一)抗原复合物，

[0185] -孵育捕获抗体-(第一)抗原复合物与示踪抗体，其中所述捕获抗体和示踪抗体结合(第一)抗原上的非重叠表位，

[0186] -孵育捕获抗体-(第一)抗原-示踪抗体复合物与包含可检测标记的检测抗体，其中检测抗体在示踪抗体的可变结构域以外的表位上特异的结合示踪抗体，和

[0187] -关联所形成的捕获抗体-(第一)抗原-示踪抗体复合物与样品中的(第一)抗原的量。

[0188] 在一个实施方案中，捕获抗体和示踪抗体结合位于(第一)抗原上的非重叠表位。

[0189] 在本文报道的方法的一个实施方案中，(第一)抗原是游离的(第一)抗原。

[0190] 在一个实施方案中，第二抗原和/或捕获抗体是与固相缀合的。

[0191] 用于本文报道的方法中的第二抗原和/或捕获抗体可以与固相缀合。在一个实施方案中，缀合是通过化学结合来实施的，所述化学结合经由N-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、抗原或抗体的氨基酸骨架的羧基-、巯基-、羟基-和/或酚-官能团，和/或抗原和/或抗体的碳水化合物结构的糖醇基。在一个实施方案中，第二抗原和/或捕获抗体是至少两种与固相缀合的第二抗原和/或抗体的混合物，其中至少两种与固相缀合的第二抗原和/或抗体与固相缀合的位点不同。例如，与固相缀合的至少两种第二抗原和/或两种抗体的混合物可包括通过氨基酸骨架的氨基酸与固相的缀合，和通过碳水化合物结构的糖醇基与固相的缀合。此外，例如，与固相缀合的至少两种第二抗原和/或两种抗体的混合物可包括通过其氨基酸骨架的不同氨基酸残基与固相缀合的第二抗原和/或抗体。表述方式“不同的氨基酸残基”表示两种不同类型的氨基酸，如赖氨酸和天冬氨酸，或酪氨酸和谷氨酸，或氨基酸骨架中在第二抗原和/或抗体氨基酸序列中不同位置上的两个氨基酸残基。在后一种情况下，氨基酸可以是相同种类或不同种类的。表述方式“抗体位点不同”表示位点类型的不同，例如氨基酸或糖醇基，或(例如第二抗原和/或抗体与固相缀合的位置上)氨基酸骨架的氨基酸数不同。相同的应用也可以用于本文报道的方法中使用的示踪抗体。

[0192] 在方法的一个实施方案中，免疫测定包括捕获抗体、示踪抗体和检测抗体，其中捕获抗体是针对通过链霉抗生物素与固相缀合的抗原的生物素化抗体，示踪抗体是针对与地高辛配基缀合的抗原的抗体，和检测抗体是针对与辣根过氧化物酶缀合的地高辛配基的抗体。

[0193] 用于从包含抗原X和/或抗原Y的样品中耗尽由特异结合抗原X和抗原Y的双特异性抗体组成的复合物的一般方法(分别用于确定抗原X或抗原Y)，包括下列步骤：

[0194] -装配特异性结合抗原X和抗原Y的双特异性抗体(抗X/Y抗体)的复合物：

[0195] 室温孵育恒定浓度的抗原X与递增量的双特异性单克隆抗体1小时，所述抗体的第一结合特异性特异的结合抗原X，第二结合特异性特异的结合抗原Y(抗X/Y抗体)。之后，使用该样品作为耗尽步骤中的阳性对照。

[0196] -耗尽步骤：

[0197] 为了耗尽与抗X/Y抗体结合的抗原X，将生物素化的抗原Y-BI与约10μg/ml包被了磁性链霉抗生物素的珠子(SA-beads)结合。每个样品洗涤600μl SA-beads，并用磁性分离器从上清液中分离。将600μl含有生物素化的抗原Y的溶液与SA-beads混合，室温孵育约1小时。通过用磁性分离器洗涤珠子3次，去除过多的未结合的抗原。然后，孵育包被了抗原Y的珠子和约250μl含有抗X/Y抗体与抗原X的复合物的样品。混合物在室温下孵育振荡约1小时。在孵育后，用磁性分离器分离样品与珠子。采集上清液用于在ELISA中分析“游离”抗原X(参见例如实施例2)。将剩余的珠子转移到ELECSYS容器中，根据标准的用户指导性操作规程，用ELECSYS 2010分析仪分析与珠子结合的抗原X(结合双特异性抗体的抗原X)。

[0198] 为了耗尽与抗X/Y抗体结合的抗原Y，将生物素化的抗原X(X-BI)与约10μg/ml包被了磁性链霉抗生物素的珠子(SA-beads)结合。每个样品洗涤600μl SA-beads，并用磁性分离器从上清液中分离。将600μl含有生物素化的抗原X的溶液与SA-beads混合，室温孵育约1小时。通过用磁性分离器洗涤珠子3次，去除过多的未结合的抗原X。然后，孵育抗原X珠子和约250μl含有抗X/Y抗体与抗原Y的复合物的样品。混合物在室温下孵育振荡约1小时。在孵育后，用磁性分离器分离样品与珠子。采集上清液用于在ELISA中分析“游离”抗原Y(参见例如实施例2)。将剩余的珠子转移到ELECSYS容器中，根据标准的用户指导性操作规程，用ELECSYS 2010分析仪分析与珠子结合的抗原Y(结合双特异性抗体的抗原Y)。

[0199] 为了确定多特异性抗体在体内的药物动力学特性，可以确定游离第一抗原、游离第二抗原、游离多特异性抗体，以及多特异性抗体-第一和/或第二抗原-复合物的分布或量。

[0200] 本文报道的一个方面是适用于确定双特异性抗体的游离(第一)抗原的存在和/或量的体外方法，其中(第一)抗原可以被双特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：

[0201] -孵育包含(第一)抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体中不同于第一结合特异性的第二结合特异性。

[0202] 在一个实施方案中，方法包括步骤：

[0203] -孵育包含(第一)抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体中不同于第一结合特异性的第二结合特异性，

[0204] -从样品中去除抗独特型抗体-双特异性抗体复合物，和

[0205] -确定耗尽了双特异性抗体的样品中的抗原的量。

[0206] 抗独特型抗体可以与固相结合。

[0207] 可以通过使用包含捕获分子、示踪分子和检测分子的桥接测定的免疫学确定，实施对双特异性抗体的检测。

[0208] 捕获分子可以与固相结合。捕获分子一般可以是双特异性抗体的任何结合搭档(例如，一种抗原)、双特异性抗体的一般性复合剂(例如，在全长抗体的情况下，是Fc-受体或抗Fc-区抗体)，或特异的结合双特异性抗体的一个结合特异性的抗独特型抗体。

[0209] 示踪分子可以是多特异性结合物的任何结合搭档(例如，双特异性抗体的一种抗原，但如果一种抗原用作捕获分子，则使用不同抗原作为示踪分子)、双特异性抗体的一般性复合剂(例如，在全长抗体的情况下，是Fc-受体，条件是该分子还没有用作捕获分子，或者在全长抗体的情况下，是抗Fc-区抗体，条件是如果相同类型的抗体还用作捕获分子，则该抗体结合不同表位)、或结合对的第一搭档(如果双特异性抗体是用结合对的第二搭档衍生的)(条件是使用与固定捕获分子所用的结合对不同的结合对)、或特异的结合双特异性抗体的结合特异性的抗独特型抗体(条件是其与如果作为捕获分子使用的抗独特型抗体结合不同的结合特异性)。

[0210] 本文报道的一个方面是用于确定样品中与双特异性抗体复合的双特异性抗体的(第一)抗原(第一抗原-双特异性抗体-复合物)的存在和/或量的体外方法，其中待检测的抗原可以被双特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：

[0211] -孵育包含(第一)抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合。

[0212] 在一个实施方案中，抗独特型抗体-双特异性抗体-(第一)抗原-复合物是在方法的第一步骤中形成的。

[0213] 在一个实施方案中，方法包括以下步骤作为第二步骤：

[0214] -孵育在第一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合(第一)抗原的抗体，从而确定样品中与双特异性抗体复合的双特异性抗体的(第一)抗原((第一)抗原-双特异性抗体-复合物)的存在和/或量。

[0215] 确定总抗原、结合抗体的抗原和游离抗原有助于监控治疗性抗体的治疗。例如，在特异结合ANG2和VEGF的双特异性抗体的情况下，作用机制是阻断两种抗原结合其相应的受体。在缺少游离配体的条件下，阻断信号通路。因此，确定游离抗原和结合抗体的抗原的分数的可能性对治疗有影响，特别是对于确定剂量和给药频率。总抗原代表游离的和结合(抗体)的抗原的总和。

[0216] 在治疗患者的过程中，患者中平行的存在抗原和治疗性抗体，并形成其复合物。因此，在体内存在结合抗体的抗原与游离抗原之间的平衡。在体外，可以通过例如稀释样品或通过用于检测或捕获的选择的抗体，影响平衡的分布。特别是对于游离抗原，在“体内”存在的量和“体外”确定的量之间，可存在潜在的差别。除了预治疗方法外，还可以通过分析确定结合抗体的抗原和总抗原，之后，基于上述确定游离抗原来进一步克服。通常，用于确定结合抗体的抗原和总抗原的测定方式的设置不同，例如在用于确定结合抗体的抗原的测定和用于确定总抗原的测定之间，测定类型可能不同，用于捕获和检测的抗体可能不同，孵育步骤的顺序和时间可能不同。

[0217] 相反，在实施例9和图13中描述了一种测定，上述测定可用于确定总抗原和结合抗体的抗原。这一独特的特征是由(治疗性)抗体的双特异性赋予的并且利用了针对第二结合特异性的抗独特型抗体。

[0218] 在体内样品，例如血浆样品，中直接确定结合的靶。

[0219] 简而言之，通过体外添加过量的双特异性抗体，将存在于样品中的游离抗原转化为结合抗体的抗原。因此，通过再次实施与针对上述结合靶的完全相同的测定，确定总抗原。体外添加或不添加双特异性抗体的测定之间的差异反映了转化靶的量，即，最初存在的游离靶。

[0220] 提供下列实施例和附图以帮助理解本发明，但所附权利要求陈述了本发明的实际范围。应理解，在不脱离本发明精神的条件下，可以对所述方法进行修饰。

[0221] 附图描述

[0222] 图1结合药物的靶(与双特异性抗体结合的抗原)和游离靶(游离抗原)之间的平衡[0223] 图2通过使用HER3耗尽与双特异性抗c-MET/HER3抗体结合的c-MET；固定在包被了链霉抗生物素的磁珠上的生物素化HER3；在孵育这些磁珠与样品(例如，血清样品)后，通过固定的HER3结合和耗尽双特异性抗c-MET/HER3抗体；共-耗尽与双特异性抗体结合的c-MET；游离c-MET(未与双特异性抗体结合的)仍然位于样品的上清中。

[0224] 图3用于检测c-MET的夹心ELISA：生物素化抗c-MET抗体与链霉抗生物素包被的微滴度板结合；固定的抗c-MET抗体特异的结合游离的c-MET，而第二种，DIG标记的抗c-MET抗体允许检测结合的c-MET；所述测定用于检测耗尽后的样品上清中的“游离的”c-MET。

[0225] 图4(A)免疫耗尽前后的缓冲液中的c-MET的测定信号水平：制备含100ng/ml c-MET和递增量的双特异性抗c-MET/HER3抗体的样品；用与磁珠结合的生物素化HER3耗尽bsmAb和结合的c-MET的复合物；图表显示了ELISA确定的耗尽前后的c-MET浓度。

[0226] 图4(B)免疫耗尽前后的血清中的c-MET测定信号水平：制备含100ng/ml c-MET和递增量的双特异性抗c-MET/HER3抗体的样品；用与磁珠结合的生物素化HER3耗尽bsmAb和结合的c-MET的复合物；图表显示了ELISA确定的耗尽前后的c-MET浓度。

[0227] 图5(A)借助于其他抗原，检测双特异性抗体的抗原的ELISA：生物素化HER3与链霉抗生物素包被的微滴度板结合，并用于固定双特异性抗c-MET/HER3抗体；c-MET与固定的双特异性抗c-MET/HER3抗体结合；第二抗c-MET抗体(DIG标记的)与多克隆的HRP标记的抗DIG抗体一起允许检测结合的c-MET。

[0228] 图5(B)借助于针对该双特异性抗体的其他结合特异性的抗独特型抗体，检测双特异性抗体的抗原的ELISA：针对结合特异性的生物素化抗独特型抗体(其特异的结合HER3(idmAb-BI))与链霉抗生物素包被的微滴度板结合，并用于固定双特异性抗c-MET/HER3抗体；c-MET与固定的双特异性抗c-MET/HER3抗体结合；第二抗c-MET抗体(DIG标记的)与多克隆的HRP标记的抗DIG抗体一起允许检测结合的c-MET。

[0229] 图6借助于其他抗原，检测双特异性抗体的抗原的ELISA的校准曲线。

[0230] 图7用抗ANG2/VEGF抗体(双特异性抗体结合的VEGF)检测VEGF的夹心ELISA：将针对双特异性抗体的ANG2结合特异性的生物素化抗独特型抗体与链霉抗生物素包被的微滴度板结合。固定的抗独特型抗ANG2抗体与抗ANG2/VEGF抗体形成复合物。第二种地高辛配基标记的抗VEGF抗体用于检测与双特异性抗体结合的VEGF。

[0231] 图8用抗ANG2/VEGF抗体检测VEGF复合物的ELISA的校准曲线。向含有500μg/ml抗ANG2/VEGF抗体的血清中添加0ng/ml至50ng/ml连续稀释的VEGF，并在室温孵育1小时。如实施例6所述分析样品。

[0232] 图9用于检测ANG2与抗ANG2/VEGF抗体的复合物(被双特异性抗体结合的ANG2)的夹心ELISA：针对双特异性抗体的VEGF结合特异性的生物素化抗独特型抗体与链霉抗生物素包被的微滴度板结合。固定的抗独特型的抗VEGF抗体的抗体与抗ANG2/VEGF抗体形成复合物。第二种地高辛配基标记的抗ANG2抗体用于检测结合的ANG2。

[0233] 图10用于检测ANG2与抗ANG2/VEGF抗体的复合物的ELISA的校准曲线。向含有5μg/ml抗ANG2/VEGF抗体的血清中添加0ng/ml至5000ng/ml连续稀释的ANG2，并在室温孵育1小时。如实施例7所述分析样品。

[0234] 图11用于检测VEGF与抗ANG2/VEGF抗体的复合物(被双特异性抗体结合的VEGF)的夹心ELISA：生物素化抗VEGF抗体与链霉抗生物素包被的微滴度板结合。固定的抗VEGF抗体与抗ANG2/VEGF抗体-VEGF复合物形成复合物。地高辛配基标记的抗独特型的抗ANG2抗体的抗体用于检测结合抗体的复合物。

[0235] 图12用于检测VEGF与抗ANG2/VEGF抗体的复合物的ELISA的校准曲线。向含有抗ANG2/VEGF抗体的血清中添加0ng/ml至10ng/ml连续稀释的VEGF，并在室温孵育1小时。

[0236] 图13用于检测ANG2与抗ANG2/VEGF抗体的复合物(双特异性抗体结合的ANG2)的夹心ELISA：通过孵育样品与双特异性抗-ANG2/VEGF抗体，将游离的ANG2转化为抗体结合的ANG2。针对双特异性抗体的VEGF结合特异性的生物素化的抗独特型抗体与链霉抗生物素包被的微滴度板结合。固定的抗独特型的抗-VEGF抗体的抗体与ANG2-抗-ANG2/VEGF抗体复合物形成复合物。特异性结合不同于抗-ANG2/VEGF抗体的ANG2上的表位的第二地高辛配基标记的抗-ANG2抗体用于检测总ANG2。

[0237] 实施例1

[0238] 在双特异性药物分子的情况下，耗尽结合药物的靶(结合抗体的抗原)[0239] A)装配双特异性抗c-MET/HER3抗体和c-MET的复合物

[0240] 将恒定浓度的c-MET与递增量的双特异性抗体在室温孵育1小时，所述双特异性抗体的第一结合特异性特异结合c-MET，第二结合特异性特异结合HER3(双特异性抗c-MET/HER3抗体)。然后，于耗尽步骤中使用这些样品作为阳性对照。

[0241] B)耗尽步骤

[0242] 为了耗尽与双特异性抗c-MET/HER3抗体结合的c-MET，将生物素化HER3(HER3-BI)与10μg/ml包被了磁性链霉抗生物素的珠子(SA beads)结合。每个样品洗涤600μl SA-beads，并用磁性分离器从上清液中分离。将约600μl含有HER3-BI的溶液与SA-Beads混合，室温孵育1小时。通过用磁性分离器洗涤珠子3次，去除过多的未结合的HER3-BI。然后，孵育包被了抗原的珠子和250μl含有双特异性抗c-MET/HER3抗体和c-MET的复合物的样品。样品在室温下孵育振荡1小时。在孵育后，用磁性分离器分离样品与珠子。采集上清液，用于在ELISA中分析“游离”c-MET(参见实施例2)。

[0243] 实施例2

[0244] 用于检测c-MET的ELISA

[0245] 将针对c-MET的生物素化单克隆抗体包被到第一步中的链霉抗生物素微滴度板上。将耗尽步骤的上清液样品(参见实施例1)稀释10倍，添加到用抗c-MET抗体包被的微滴度板的孔中。包含在样品中的游离c-MET被包被在微滴度板的孔中的抗c-MET抗体结合。在室温孵育1小时后，洗涤平板3次，去除样品。然后，向孔中加入具有与包被抗体不同的特异性(即，表位)的单克隆DIG标记的抗c-MET抗体，再在室温孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，向平板添加多克隆的HRP标记的抗DIG抗体，再孵育1小时。使用ABTS底物溶液触发显色反应(参见图3)。

[0246] 实施例3

[0247] 耗尽人血清和缓冲液中的药物结合的c-MET

[0248] 根据实施例1，将双特异性抗c-MET/HER3抗体分别稀释为20/10/5/1/0.5/0.1和0μg/ml的浓度，与恒定浓度的100ng/ml c-MET孵育。在两种不同的基质中进行稀释：

[0249] ·PBS/BSA缓冲液

[0250] ·人混合血清(Trina，NHS Base matrix)

[0251] 样品在室温下孵育振荡1小时。然后，如实施例1所述耗尽样品。

[0252] 使用HER3-BI捕获c-MET与双特异性抗c-MET/HER3抗体的复合物。

[0253] 在耗尽后，如实施例2所述，在c-MET ELISA中测量上清液。

[0254] 如图4(A)所示，通过免疫耗尽，去除与双特异性抗c-MET/HER3抗体结合的c-MET。在存在5μg/ml或更多双特异性抗体时，耗尽后的c-MET信号与测定背景信号近似。

[0255] 在图4(B)所示的血清样品中观察到相似的行为。

[0256] 实施例4

[0257] 借助其他抗原检测双特异性抗体的抗原的ELISA

[0258] A)检测样品中的(总)c-MET的量

[0259] 将生物素化HER3与第一步中的链霉抗生物素微滴度板结合。与之平行的是，用样品/标准预孵育双特异性抗c-MET/HER3抗体1小时。在预孵育过程中，样品中的c-MET与双功能性抗c-MET/HER3抗体结合。在洗涤链霉抗生物素包被的平板后，将c-MET和抗c-MET/HER3抗体的预孵育混合物添加到平板中，室温孵育1小时。在从样品中去除未结合组分的另一个洗涤步骤后，加入地高辛配基标记的抗c-MET抗体(结合c-MET上与双功能性抗c-MET/HER3抗体不同的表位)，孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，向平板加入多克隆的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗DIG抗体，孵育1小时。使用ABTS底物溶液触发显色反应(参见图5(A))。

[0260] B)检测样品中(预存在的)双特异性抗c-MET/HER3抗体和c-MET的复合物[0261] 将生物素化HER3与第一步中的链霉抗生物素微滴度板结合。在洗涤平板后，将样品和标准添加到平板中，室温孵育1小时。双特异性抗c-MET/HER3抗体和c-MET的复合物与固定的HER3-BI结合。在另一个洗涤步骤后，加入地高辛配基标记的抗c-MET抗体(特异的结合c-MET上与双功能性抗c-MET/HER3抗体不同的表位)，孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，向平板加入多克隆的HRP标记的抗DIG抗体，孵育1小时。使用ABTS底物溶液触发显色反应(参见图5(A))。

[0262] 实施例5

[0263] 借助于针对该双特异性抗体的第二结合特异性的抗独特型抗体，检测双特异性抗体的第一抗原的ELISA

[0264] a)检测样品中的(总)c-MET的量

[0265] 将针对特异结合HER3的结合特异性的生物素化抗独特型抗体(抗独特型的抗HER3抗体的抗体-BI)与第一步中的链霉抗生物素微滴度板结合。与之平行的是，用样品或标准预孵育双特异性抗c-MET/HER3抗体1小时。在预孵育步骤中，样品中的c-MET被双特异性抗c-MET/HER3抗体特异的结合。在洗涤链霉抗生物素包被的平板后，将c-MET和双特异性抗c-MET/HER3抗体的预孵育混合物添加到平板中，室温孵育1小时。在另一个去除未结合组分的洗涤步骤后，加入地高辛配基标记的抗c-MET抗体(特异的结合c-MET上与双特异性抗c-MET/HER3抗体不同的表位)，孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，向平板加入多克隆的HRP标记的抗DIG抗体，再孵育1小时。使用ABTS底物溶液触发显色反应(参见图5(B))。

[0266] b)检测样品中(预存在的)抗c-MET/HER3抗体和c-MET的复合物

[0267] 将针对特异结合HER3的结合特异性的生物素化抗独特型抗体(抗独特型的抗HER3抗体的抗体-BI)与第一步中的链霉抗生物素包被的微滴度板结合。在洗涤平板后，将样品和标准添加到平板中，室温1小时。抗c-MET/HER3抗体和c-MET的复合物被固定的抗独特型抗体捕获。在另一个洗涤步骤后，加入地高辛配基标记的抗c-MET抗体(特异的结合c-MET上与双特异性抗c-MET/HER3抗体不同的表位)，孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，向平板加入多克隆的HRP标记的抗DIG抗体，孵育1小时。使用ABTS底物溶液触发显色反应(参见图5(B))。

[0268] 实施例6

[0269] 用于检测VEGF与抗ANG2/VEGF双特异性抗体的复合物的ELISA

[0270] 将生物素化的单克隆抗独特型的抗ANG2抗体的抗体包被在链霉抗生物素包被的微滴度板(MTP)上，所述抗体特异的结合抗ANG2/VEGF抗体的ANG2结合特异性。将具有未知量的VEGF与抗ANG2/VEGF抗体的复合物的样品稀释10倍，添加到包被了抗独特型的抗ANG2抗体的抗体的MTP的孔中。特异结合ANG2和VEGF的双特异性抗体被固定的抗独特型抗体复合，所述抗独特型抗体针对双特异性抗体的ANG2结合特异性的CDR。还结合双特异性抗体和VEGF的复合物。在室温孵育1小时时间后，去除样品/上清液，之后再洗涤平板3次。之后，向孔中加入单克隆的地高辛配基标记的抗VEGF抗体(其结合VEGF上不同于待检测的双特异性抗ANG2/VEGF抗体的表位)，室温孵育1小时。在洗涤步骤后，向平板加入多克隆的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗地高辛配基抗体(抗DIG抗体)，孵育1小时。在去除上清液和洗涤后，添加ABTS底物溶液用于显色反应(参见图7)。

[0271] 实施例7

[0272] 用于检测ANG2与双特异性抗ANG2/VEGF抗体的复合物的ELISA

[0273] 将生物素化的单克隆抗独特型抗体包被在链霉抗生物素包被的微滴度板(MTP)上，所述抗体特异的结合抗ANG2/VEGF抗体的VEGF结合特异性。将具有未知量的ANG2与抗ANG2/VEGF抗体的复合物的样品稀释10倍，添加到包被了抗独特型的抗VEGF抗体的抗体的MTP的孔中。特异结合ANG2和VEGF的双特异性抗体被固定的抗独特型抗体复合，所述抗独特型抗体针对双特异性抗ANG2/VEGF抗体的VEGF结合特异性的CDR。还结合双特异性抗体和ANG2的复合物。在室温孵育1小时后，去除样品/上清液，再洗涤平板3次。之后，向孔中加入单克隆的地高辛配基标记的抗ANG2抗体(其特异的结合不同于双特异性抗ANG2/VEGF抗体的ANG2结合特异性的表位)，室温孵育1小时。在洗涤步骤后，向平板加入多克隆的HRP标记的抗地高辛配基抗体，孵育1小时。在去除上清液和洗涤后，添加ABTS底物溶液用于显色反应(参见图9)。

[0274] 实施例8

[0275] 用于检测VEGF与双特异性抗ANG2/VEGF抗体的复合物的ELISA

[0276] 将针对VEGF的生物素化单克隆抗体包被在链霉抗生物素包被的微滴度板(MTP)上。洗涤后，将具有未知量的VEGF与抗ANG2/VEGF抗体的复合物的样品稀释10倍，添加到包被了抗VEGF抗体的MTP的孔中。针对VEGF的固定抗体在不同于双特异性抗ANG2/VEGF抗体的结合位点结合VEGF。VEGF与抗ANG2/VEGF抗体的复合物结合固定的抗VEGF抗体。在室温孵育1小时后，去除样品/上清液，再洗涤平板3次。之后，向孔中加入地高辛标记的单克隆抗独特型抗体(其特异的结合抗ANG2/VEGF抗体的ANG2结合特异性)，室温孵育1小时。在洗涤步骤后，向平板加入多克隆的HRP标记的抗地高辛配基抗体，孵育1小时。在去除上清液和洗涤后，添加ABTS底物溶液用于显色反应(参见图11)。图12显示了相应的校准曲线。

[0277] 实施例9

[0278] 通过将游离ANG2转化为结合抗体的ANG2并与双特异性抗ANG2/VEGF抗体孵育，检测总ANG2的ELISA

[0279] 将特异的结合抗ANG2/VEGF抗体的VEGF结合特异性的生物素化单克隆的抗独特型抗体结合至包被了链霉抗生物素包被的微滴度板(MTP)。将具有未知量的ANG2的第一等份样品与1.5μg/mL双特异性抗ANG2/VEGF抗体孵育1小时，从而将游离ANG2转化为结合抗ANG2/VEGF抗体的ANG2。将第二(即，未孵育的)等份样品和抗体孵育的等份样品稀释10倍，添加到用抗独特型抗体包被的MTP的孔中，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的VEGF结合特异性。双特异性抗体被固定的抗独特型抗体结合。同样的，复合的ANG2通过双特异性抗体被结合。在室温孵育1小时时间后，去除上清液(＝样品)，再洗涤平板3次。之后，向孔中加入单克隆的地高辛配基标记的抗ANG2抗体(其特异的结合于不同于双特异性抗ANG2/VEGF抗体的ANG2结合特异性的表位上)，室温孵育1小时。在洗涤步骤后，向平板加入多克隆的HRP标记的抗地高辛配基抗体，孵育1小时。在去除上清液和洗涤后，添加ABTS底物溶液用于显色反应(参见图13)。从由第一等份获得的结果和第二等份获得的结果之间的差异，计算游离ANG2的量。因此，使用该测定，确定了结合抗体的ANG2和游离ANG2的量。