一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法

摘要

本发明涉及一种水体中微囊藻毒素MC‑LR的选择性光电化学分析方法，通过采用点击化学将石墨烯化学键合修饰到TiO2NTs上，大幅度提高了基底电极的光电化学性能，同时将石墨烯修饰TiO2NTs电极与MC‑LR核酸适配体共同构筑成MC‑LR光电化学适配体传感器，然后用光电化学分析方法确定MC‑LR的标准工作曲线，从而可通过检测待检测样品的光电流密度并结合标准工作曲线即可检测出待检测样品中的MC‑LR浓度。与现有技术相比，本发明具有检测灵敏度高、检测方法简单、选择性高等优点。

权利要求

1.一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制含炔基修饰石墨烯、CuSO4·5H2O和抗坏血酸的THF溶液A，超声分散后将叠氮功能化TiO2NTs置于THF溶液A中，氮气保护下反应，所得产物洗涤干燥后，即得石墨烯修饰TiO2NTs电极；

(2)配制MC-LR核酸适配体水溶液，直接滴凃在步骤(1)制得的石墨烯修饰TiO2NTs电极上，室温下静置，即制得MC-LR光电化学适配体传感器；

(3)配制不同浓度的MC-LR标准溶液，添加到以MC-LR光电化学适配体传感器为工作电极的三电极体系中，室温作用，施加偏压，在可见光激发下采用I-t曲线法进行光电流测定，通过光电流密度的变化量与各MC-LR标准溶液浓度的对数关系绘制标准工作曲线，然后将含MC-LR的待检测样品添加到三电极体系中，测定光电流密度，结合标准工作曲线即可得待检测样品的MC-LR浓度。

2.根据权利要求1所述的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，其特征在于，步骤(1)中所述的炔基修饰石墨烯通过以下步骤制备而成：配制氧化石墨烯水溶液，超声分散后，加入N2H4·H2O，再加入NH3·H2O调节pH至11，得到混合液A，搅拌反应，再加入4-乙炔基苯胺和亚硝酸异戊酯，得到混合液B，继续搅拌反应，冷却至室温，分离洗涤干燥后，得到炔基修饰石墨烯。

3.根据权利要求2所述的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，其特征在于，炔基修饰石墨烯的制备过程中：所述的氧化石墨烯通过Hummers法制备得到，氧化石墨烯水溶液的浓度为1～4g/L，N2H4·H2O的浓度为0.5～3v/v％，混合液B中4-乙炔基苯胺与亚硝酸异戊酯的浓度分别为

0.1～2wt％和0.2～4v/v％；超声分散的时间为0.5～3h；

混合液A的搅拌反应时间为0.5～2h，反应温度为70～95℃；混合液B搅拌反应的时间为

10～20h，反应温度为60～90℃；洗涤为将分离产物用去离子水和稀HCl洗涤直至滤液清澈，干燥温度为40～60℃，干燥时间为10～20h。

4.根据权利要求1所述的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，其特征在于，步骤(1)中所述的叠氮功能化TiO2NTs通过以下步骤制备而成：以钛板为阳极、铂片为阴极于NH4F和H2O的乙二醇混合液中恒电位阳极氧化，然后置于管式炉中煅烧，得到直立有序的TiO2NTs，然后将直立有序的TiO2NTs置于APTES乙醇溶液中浸泡，水洗晾干后，得到表面氨基修饰TiO2NTs，再将表面氨基修饰TiO2NTs置于含4-叠氮基苯甲酸和EDC·HCl的THF溶液B中，氮气保护下反应，反应产物洗涤晾干后，即得到叠氮基功能化TiO2NTs。

5.根据权利要求4所述的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，其特征在于，叠氮功能化TiO2NTs的制备过程中：钛板阳极氧化的温度为15～30℃，氧化时间为2～4h，电位为20～50V，乙二醇混合液中NH4F的浓度为0.1～0.4wt％，H2O的浓度为1～3wt％，管式炉中的煅烧温度为400～500℃，煅烧时间为2～4h；

APTES乙醇溶液的浓度为0.5～2v/v％，TiO2NTs的浸泡时间为6～15h；THF溶液B中4-叠氮基苯甲酸的浓度为6～10g/L，EDC·HCl的浓度为15～30g/L，表面氨基修饰TiO2NTs的反应温度为室温，反应时间为20～30h。

6.根据权利要求1所述的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，其特征在于，步骤(1)中THF溶液A中炔基修饰石墨烯的浓度为0.5～2g/L，CuSO4·5H2O为3～

8g/L，抗坏血酸的浓度为10～15g/L；超声分散的时间为10～30min，反应温度为室温，反应时间为20～30h。

7.根据权利要求1所述的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，其特征在于，步骤(2)中MC-LR核酸适配体的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

8.根据权利要求1所述的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，其特征在于，步骤(2)中MC-LR核酸适配体的水溶液的浓度为5～15μmol/L，石墨烯修饰TiO2NTs电极的面积为5～10mm×5～10mm，滴凃在石墨烯修饰TiO2NTs电极上的MC-LR核酸适配体水溶液为10～50μL，静置时间为10～30min。

9.根据权利要求1所述的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，其特征在于，步骤(3)中所述的三电极体系以MC-LR光电化学适配体传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，0.1～0.2M pH为7.4的PBS缓冲溶液为支持电解质；步骤(3)中室温作用的时间为30～60min，偏压为0.3～0.6V。

说明书

一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种光电化学分析和环境检测技术领域，尤其是涉及一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法。

背景技术

[0002] 在过去几十年中，随着地表水的富营养化和全球气候的改变，每年都会导致蓝藻水华的大量爆发。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)就是由水体中蓝绿藻如微囊藻属、鱼腥藻属、颤藻属等产生的具有生物活性的单环七肽化合物。微囊藻毒素化学结构稳定，且容易在生物体内积累富集。在已经发现和确认结构的90多种微囊藻毒素中，微囊藻毒素-LR(MC-LR)最为普遍，毒性最强。MC-LR的分子式为C49H74N10O12，分子量为995.2。MC-LR表现出很强的肝毒性，通过肝脏中有机阴离子转运蛋白进入肝脏，抑制蛋白磷酸酶1和2A的活性从而对肝脏造成损伤，最后可能导致人和动物的死亡。MC-LR还是一种肿瘤促进剂，人和动物通过饮水、透析和食物链等方式长期摄入，增加了罹患肿瘤的几率。世界卫生组织(WHO)规定饮用水中MC-LR最大含量为1μg/L。因此，实现MC-LR的快速、高选择性和高灵敏检测具有重要的现实意义和环境意义。

[0003] MC-LR的常用检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LC-MS)、毛细管电泳、蛋白磷酸酶抑制法(PPIA)等，上述方法虽然具有较高的灵敏度，但所用仪器昂贵、样品前处理复杂、分析耗时、对分析人员要求较高等缺点。光电化学分析方法是光化学和电化学技术的结合，具有电化学仪器价格低廉、信号响应迅速、灵敏度高、易于在线检测等优点，同时可采用不同的激发光和不同的检测方法，排除更多背景干扰，具有更高的灵敏度。但是，光电化学分析过程中产生的强氧化能力的·OH，能对不同分子进行无差异性氧化，从而导致选择性检测效果并不理想。

[0004] 中国专利201310120054.7公开了一种检测生物体内微囊藻毒素MC-LR的方法，包括微囊藻毒素MC-LR的提取、微囊藻毒素MC-LR的富集、分离与纯化、UPLC-MS定性分析和外标法定量分析步骤。该专利的对MC-LR的检测方法虽然灵敏度较高，但是样品前处理较为复杂，同时因为色谱分析时的·OH的无差别氧化而导致检测的精准度不理想。

发明内容

[0005] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法。

[0006] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

[0007] 一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，包括以下步骤：

[0008] (1)配制含炔基修饰石墨烯、CuSO4·5H2O和抗坏血酸的THF溶液A，超声分散后将叠氮功能化TiO2 NTs置于THF溶液A中，氮气保护下反应，所得产物洗涤干燥后，即得石墨烯修饰TiO2 NTs电极；

[0009] (2)配制MC-LR核酸适配体水溶液，直接滴凃在步骤(1)制得的石墨烯修饰TiO2 NTs电极上，室温下静置，即制得MC-LR光电化学适配体传感器；

[0010] (3)配制不同浓度的MC-LR标准溶液，添加到以MC-LR光电化学适配体传感器为工作电极的三电极体系中，室温作用，施加偏压，在可见光激发下采用I-t曲线法进行光电流测定，通过光电流密度的变化量与各MC-LR标准溶液浓度的对数关系绘制标准工作曲线，然后将含MC-LR的待检测样品添加到三电极体系中，测定光电流密度，结合标准工作曲线即可得待检测样品的MC-LR浓度。

[0011] 步骤(1)中所述的炔基修饰石墨烯通过以下步骤制备而成：

[0012] 配制氧化石墨烯水溶液，超声分散后，加入N2H4·H2O对氧化石墨烯进行还原，再加入NH3·H2O调节pH至11，得到混合液A，搅拌反应，再加入4-乙炔基苯胺和亚硝酸异戊酯，得到混合液B，继续搅拌反应，冷却至室温，分离洗涤干燥后，得到炔基修饰石墨烯；

[0013] 炔基修饰石墨烯的制备过程中：

[0014] 所述的氧化石墨烯通过Hummers法制备得到，氧化石墨烯水溶液的浓度为1～4g/L，N2H4·H2O的浓度为0.5～3v/v％，混合液B中4-乙炔基苯胺与亚硝酸异戊酯的浓度分别为0.1～2wt％和0.2～4v/v％；超声分散的时间为0.5～3h。

[0015] 混合液A的搅拌反应时间为0.5～2h，反应温度为70～95℃；混合液B搅拌反应的时间为10～20h，反应温度为60～90℃；洗涤为将分离产物用去离子水和稀HCl洗涤直至滤液清澈，干燥温度为40～60℃，干燥时间为10～20h。

[0016] 步骤(1)中所述的叠氮功能化TiO2 NTs通过以下步骤制备而成：

[0017] 以钛板为阳极、铂片为阴极于NH4F和H2O的乙二醇混合液中恒电位阳极氧化，然后置于管式炉中煅烧，得到直立有序的TiO2 NTs，然后将直立有序的TiO2 NTs置于APTES乙醇溶液中浸泡，水洗晾干后，得到表面氨基修饰TiO2 NTs，再将表面氨基修饰TiO2 NTs置于含4-叠氮基苯甲酸和EDC·HCl的THF溶液B中，氮气保护下反应，反应产物洗涤晾干后，即得到叠氮基功能化TiO2 NTs。

[0018] 叠氮功能化TiO2 NTs的制备过程中：

[0019] 钛板阳极氧化的温度为15～30℃，氧化时间为2～4h，电位为20～50V，乙二醇混合液中NH4F的浓度为0.1～0.4wt％，H2O的浓度为1～3wt％，管式炉中的煅烧温度为400～500℃，煅烧时间为2～4h；

[0020] APTES乙醇溶液的浓度为0.5～2v/v％，TiO2 NTs的浸泡时间为6～15h；THF溶液B中4-叠氮基苯甲酸的浓度为6～10g/L，EDC·HCl的浓度为15～30g/L，表面氨基修饰TiO2 NTs的反应温度为室温，反应时间为20～30h。

[0021] 步骤(1)中THF溶液A中炔基修饰石墨烯的浓度为0.5～2g/L，CuSO4·5H2O为3～8g/L，抗坏血酸的浓度为10～15g/L；超声分散的时间为10～30min，反应温度为室温，反应时间为20～30h。

[0022] 步骤(2)中MC-LR核酸适配体的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

[0023] 步骤(2)中MC-LR核酸适配体的水溶液的浓度为5～15μmol/L，石墨烯修饰TiO2 NTs电极的面积为5～10mm×5～10mm，滴凃在石墨烯修饰TiO2 NTs电极上的MC-LR核酸适配体水溶液为10～50μL，静置时间为10～30min。

[0024] 步骤(3)中所述的三电极体系以MC-LR光电化学适配体传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，0.1～0.2M pH为7.4的PBS缓冲溶液为支持电解质；步骤(3)中室温作用的时间为30～60min，偏压为0.3～0.6V。

[0025] 采用上述分析方法，分别检测MC-LR标准溶液和干扰物质体系，发现干扰物质对MC-LR的检测干扰小于10％，工作电极的选择性极好，其中，干扰物质体系为将MC-LR与干扰物质混合；干扰物质体系中：MC-LR的浓度与MC-LR标准溶液相同，干扰物质的摩尔浓度为MC-LR的100倍；干扰物质为杀虫单、阿特拉津、草甘膦、氧乐果、百草枯、敌百虫或啶虫眯。

[0026] 本发明采用点击化学将石墨烯化学键合修饰到TiO2 NTs上，大幅度提高了基底电极的光电化学性能，同时为MC-LR核酸适配体提供了作用位点，有力地提高了检测效果。直立有序的TiO2 NTs具有高化学稳定性、低成本、高活性、无腐蚀性、无毒、较高的光电转换效率等优点，但其仅能被波长较短的紫外光激发，且光激发产生的光生电子和空穴易复合使光电转换效率降低，石墨烯具有大的比表面积、良好的吸附性能、透光性能好及高的电子迁移率，将石墨烯与半导体材料结合，制成石墨烯修饰TiO2 NTs电极，能有效促进光生电子和空穴的分离，从而提高其光电化学性能。本发明中所用的MC-LR核酸适配体为采用【Environmental Science and Technology,2012,46,10697-10703】中所述方法筛选得到，其具有超灵敏光电分析技术和具有特异性识别功能，通过将其与石墨烯修饰TiO2 NTs电极构筑成MC-LR光电化学适配体传感器，具有良好的选择性和灵敏度。

[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0028] (1)通过点击化学的方法将石墨烯共价键合到TiO2 NTs上，共价连接使所得电极结构更加稳定，并且大大改善了电极的光电化学性能，实现了检测信号的放大，并且点击化学为实现电极表面石墨烯单层修饰提供了可能，同时使电极材料的光响应拓宽到可见光区，有利于核酸适配体维持较高的生物活性；

[0029] (2)工艺简单：本发明采用石墨烯修饰，石墨烯的sp2杂化六元环结构和DNA链上的核酸碱基通过简单的π-π堆积作用力，可方便的将核酸适配体物理吸附到石墨烯修饰TiO2 NTs电极表面，简化了适配体固定到电极表面的步骤；

[0030] (3)采用光电化学分析方法实现对MC-LR的分析检测，信号变化灵敏，响应迅速，操作简单，分析时间端，选择性高，传感器对MC-LR的检测限低达0.5pg/L，线性检测范围为1.0～497.6pg/L。

具体实施方式

[0031] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0032] 实施例1

[0033] 一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析新方法，其工作电极具体制备过程如下：

[0034] (1)炔基修饰石墨烯的合成(G-alkyne)：用Hummers法制备得氧化石墨烯(GO)，配制成2g/L水溶液，超声分散3h，然后加入浓度为1v/v％的N2H4·H2O对GO进行还原，并用NH3·H2O调混合液pH＝11.00，混合物在90℃下搅拌反应1h。再加入4-乙炔基苯胺和亚硝酸异戊酯使其浓度分别为0.5wt％和0.6v/v％，80℃下剧烈搅拌反应过夜。然后冷却至室温，离心过滤。并用去离子水和稀HCl洗涤直至滤液清澈，50℃真空干燥过夜。

[0035] (2)石墨烯在TiO2 NTs表面的组装：将钛板依次用砂纸打磨抛光清洗后，25℃下以钛板为阳极，铂片为阴极于0.3wt％NH4F和2wt％H2O的乙二醇溶液中恒电位30V阳极氧化3h，然后置于管式炉中500℃煅烧3h，得直立有序的TiO2 NTs。将TiO2 NTs置于1v/v％APTES乙醇溶液中室温浸泡12h，水洗晾干，得表面氨基修饰TiO2 NTs。将氨基修饰TiO2 NTs置于含8.16g/L 4-叠氮基苯甲酸和19.17g/L EDC·HCl的10mL THF溶液中，N2保护下室温反应
24h，用THF、蒸馏水洗涤晾干，得叠氮基功能化TiO2 NTs。配制1g/L G-alkyne、5g/L CuSO4·
5H2O、13.2g/L AA的THF混合溶液，超声分散15min将叠氮基功能化的TiO2 NTs置于混合溶液，N2保护下室温反应24h，然后用THF、蒸馏水洗涤晾干，得石墨烯修饰TiO2 NTs，表示为G/TiO2 NTs。用绝缘胶对制备电极进行封和，控制电极面积10mm×10mm。

[0036] (3)Aptamer/G/TiO2 NTs电极的组装：取50μL 10μmol/L MC-LR核酸适配体直接滴涂于G/TiO2 NTs电极上，室温下静置20min，用蒸馏水洗去非吸附在电极上的适配体，由此制备得到MC-LR光电化学适配体传感器(Aptamer/G/TiO2 NTs)。其中，使用的MC-LR的适配体的碱基序列为：

[0037] 5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’。

[0038] 实施例2

[0039] 采用传统三电极体系，以实施例1制备的Aptamer/G/TiO2 NTs为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，以0.1M pH为7.4的PBS缓冲溶液为支持电解质，向体系中加入不同浓度MC-LR标准溶液，控制MC-LR与适配体室温下作用时间为45min。可见光激发下施加0.3V偏压，采用I-t曲线法测定含不同浓度MC-LR体系的光电流，根据电极的工作面积换算成光电流密度(j)。一定MC-LR浓度范围内，随MC-LR浓度的增加，光电流密度也相应增加，这是由于当MC-LR与电极表面适配体特异性结合后，引起适配体构型的转变，引起部分适配体从电极表面解离，使得电子在溶液和电极界面上的传输阻力减小，导致光电流密度的增大。利用光电流密度的增加值Δj与MC-LR的浓度的对数之间的关系绘制工作曲线，得到对MC-LR的定量检测。Aptamer/G/TiO2 NTs电极对MC-LR的检测限低达0.5pg/L，线性检测范围为1.0～497.6pg/L。

[0040] 实施例3

[0041] 以制备的Aptamer/G/TiO2 NTs为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，以0.1M pH为7.4的PBS缓冲溶液为支持电解质。可见光激发下施加0.3V偏压，采用I-t曲线法分别测定含99.5pg/L MC-LR溶液和干扰物质体系的光电流，干扰物质体系为MC-LR与干扰物质的混合溶液，其中，干扰物质体系中MC-LR的浓度为99.5pg/L，干扰物质的浓度为MC-LR摩尔浓度的100倍，计算相对光电流比率(R)，得到传感器的选择性能。干扰物质包括杀虫单、阿特拉津、草甘膦、氧乐果、百草枯、敌百虫、啶虫眯。结果表明，干扰物质为杀虫单、阿特拉津、草甘膦、氧乐果、啶虫眯时，对MC-LR测定的干扰小于5％；干扰物质为百草枯、敌百虫时，对MC-LR测定的干扰小于10％，体现了Aptamer/G/TiO2NTs良好的选择性。

[0042] 实施例4

[0043] 一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，包括以下步骤：

[0044] (1)炔基修饰石墨烯的合成：用Hummers法制备得氧化石墨烯(GO)，配制成1g/L水溶液，超声分散0.5h后，加入的浓度为0.5v/v％的N2H4·H2O对GO进行还原，加入NH3·H2O调节pH至11，在70℃下搅拌反应0.5h，再加入4-乙炔基苯胺和亚硝酸异戊酯，得到混合液B，保持混合液B中4-乙炔基苯胺的浓度为0.1wt％，亚硝酸异戊酯的浓度为0.2v/v％，在60℃下剧烈搅拌反应10h，冷却至室温，离心过滤，并用去离子水和稀HCl洗涤直至滤液清澈，40℃下真空干燥10h，得到炔基修饰石墨烯；

[0045] (2)叠氮功能化TiO2 NTs的制备：将钛板用金相砂纸打磨抛光清洗后，15℃下以钛板为阳极、铂片为阴极，于含0.1wt％NH4F和1wt％H2O的乙二醇混合液中恒电位20V阳极氧化2h，然后置于管式炉中400℃下煅烧2h，得到直立有序的TiO2NTs，然后将TiO2 NTs置于浓度为0.5v/v％的APTES乙醇溶液中浸泡6h，水洗晾干后，得到表面氨基修饰TiO2 NTs，再将表面氨基修饰TiO2 NTs置于含6g/L的4-叠氮基苯甲酸和15g/L的EDC·HCl的THF溶液B中，氮气保护下室温反应20h，反应产物用THF、蒸馏水洗涤晾干，即得到叠氮基功能化TiO2 NTs；

[0046] (3)石墨烯在TiO2 NTs表面的组装：配制含0.5g/L的炔基修饰石墨烯、3g/L的CuSO4·5H2O、10g/L的抗坏血酸的THF溶液A，超声分散10min后，将步骤(2)制得的叠氮基功能化TiO2 NTs置于THF溶液A中，氮气保护下室温反应20～30h，所得反应产物用THF、蒸馏水洗涤晾干，即得石墨烯修饰TiO2 NTs电极，控制电极面积5mm×5mm；

[0047] (4)MC-LR光电化学适配体传感器的构筑：将MC-LR核酸适配体离心后配制成5μmol/L的水溶液，取10μL直接滴凃于步骤(3)所制得的石墨烯修饰TiO2 NTs电极上，室温下静置10min，即制得MC-LR光电化学适配体传感器(Aptamer/G/TiO2NTs)，其中，使用的MC-LR的适配体的碱基序列为：

[0048] 5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’；

[0049] (5)MC-LR的光电分析：采用传统的三电极体系，以MC-LR光电化学适配体传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，0.1M pH为7.4的PBS缓冲溶液为支持电解质，配制不同浓度的MC-LR标准溶液，以标准加入法添加到以MC-LR光电化学适配体传感器为工作电极的三电极体系中，室温作用30min，施加0.3V偏压，在可见光激发下采用I-t曲线法进行光电流测定，通过光电流密度的变化量与各MC-LR标准溶液浓度的对数关系绘制标准工作曲线，然后将含MC-LR的待检测样品添加到三电极体系中，测定光电流密度，结合标准工作曲线即可得待检测样品的MC-LR浓度。

[0050] 实施例5

[0051] 一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，包括以下步骤：

[0052] (1)炔基修饰石墨烯的合成：用Hummers法制备得氧化石墨烯(GO)，配制成4g/L水溶液，超声分散3h后，加入的浓度为3v/v％的N2H4·H2O对GO进行还原，加入NH3·H2O调节pH至11，在95℃下搅拌反应2h，再加入4-乙炔基苯胺和亚硝酸异戊酯，得到混合液B，保持混合液B中4-乙炔基苯胺的浓度为2wt％，亚硝酸异戊酯的浓度为4v/v％，在90℃下剧烈搅拌反应20h，冷却至室温，离心过滤，并用去离子水和稀HCl洗涤直至滤液清澈，60℃下真空干燥20h，得到炔基修饰石墨烯；

[0053] (2)叠氮功能化TiO2 NTs的制备：将钛板用金相砂纸打磨抛光清洗后，30℃下以钛板为阳极、铂片为阴极，于含0.4wt％NH4F和3wt％H2O的乙二醇混合液中恒电位50V阳极氧化4h，然后置于管式炉中500℃下煅烧4h，得到直立有序的TiO2NTs，然后将TiO2 NTs置于浓度为2v/v％的APTES乙醇溶液中浸泡12h，水洗晾干后，得到表面氨基修饰TiO2 NTs，再将表面氨基修饰TiO2 NTs置于含10g/L的4-叠氮基苯甲酸和30g/L的EDC·HCl的THF溶液B中，氮气保护下室温反应30h，反应产物用THF、蒸馏水洗涤晾干，即得到叠氮基功能化TiO2 NTs；

[0054] (3)石墨烯在TiO2 NTs表面的组装：配制含2g/L的炔基修饰石墨烯、8g/L的CuSO4·5H2O、15g/L的抗坏血酸的THF溶液A，超声分散30min后，将步骤(2)制得的叠氮基功能化TiO2 NTs置于THF溶液A中，氮气保护下室温反应30h，所得反应产物用THF、蒸馏水洗涤晾干，即得石墨烯修饰TiO2 NTs电极，控制电极面积10mm×10mm；

[0055] (4)MC-LR光电化学适配体传感器的构筑：将MC-LR核酸适配体离心后配制成15μmol/L的水溶液，取50μL直接滴凃于步骤(3)所制得的石墨烯修饰TiO2NTs电极上，室温下静置30min，即制得MC-LR光电化学适配体传感器(Aptamer/G/TiO2NTs)，其中，使用的MC-LR的适配体的碱基序列为：

[0056] 5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’；

[0057] (5)MC-LR的光电分析：采用传统的三电极体系，以MC-LR光电化学适配体传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，0.2M pH为7.4的PBS缓冲溶液为支持电解质，配制不同浓度的MC-LR标准溶液，以标准加入法添加到以MC-LR光电化学适配体传感器为工作电极的三电极体系中，室温作用60min，施加0.6V偏压，在可见光激发下采用I-t曲线法进行光电流测定，通过光电流密度的变化量与各MC-LR标准溶液浓度的对数关系绘制标准工作曲线，然后将含MC-LR的待检测样品添加到三电极体系中，测定光电流密度，结合标准工作曲线即可得待检测样品的MC-LR浓度。

[0058] 实施例6

[0059] 一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法，包括以下步骤：

[0060] (1)炔基修饰石墨烯的合成：用Hummers法制备得氧化石墨烯(GO)，配制成2g/L水溶液，超声分散2h后，加入的浓度为0.15v/v％的N2H4·H2O对GO进行还原，加入NH3·H2O调节pH至11，在85℃下搅拌反应1.5h，再加入4-乙炔基苯胺和亚硝酸异戊酯，得到混合液B，保持混合液B中4-乙炔基苯胺的浓度为1wt％，亚硝酸异戊酯的浓度为2v/v％，在80℃下剧烈搅拌反应15h，冷却至室温，离心过滤，并用去离子水和稀HCl洗涤直至滤液清澈，50℃下真空干燥15h，得到炔基修饰石墨烯；

[0061] (2)叠氮功能化TiO2 NTs的制备：将钛板用金相砂纸打磨抛光清洗后，20℃下以钛板为阳极、铂片为阴极，于含0.2wt％NH4F和2wt％H2O的乙二醇混合液中恒电位35V阳极氧化3h，然后置于管式炉中450℃下煅烧3h，得到直立有序的TiO2NTs，然后将TiO2 NTs置于浓度为1v/v％的APTES乙醇溶液中浸泡15h，水洗晾干后，得到表面氨基修饰TiO2 NTs，再将表面氨基修饰TiO2 NTs置于含8g/L的4-叠氮基苯甲酸和25g/L的EDC·HCl的THF溶液B中，氮气保护下室温反应25h，反应产物用THF、蒸馏水洗涤晾干，即得到叠氮基功能化TiO2 NTs；

[0062] (3)石墨烯在TiO2 NTs表面的组装：配制含1g/L的炔基修饰石墨烯、6g/L的CuSO4·5H2O、12g/L的抗坏血酸的THF溶液A，超声分散20min后，将步骤(2)制得的叠氮基功能化TiO2 NTs置于THF溶液A中，氮气保护下室温反应25h，所得反应产物用THF、蒸馏水洗涤晾干，即得石墨烯修饰TiO2 NTs电极，控制电极面积8mm×7mm；

[0063] (4)MC-LR光电化学适配体传感器的构筑：将MC-LR核酸适配体离心后配制成10μmol/L的水溶液，取30μL直接滴凃于步骤(3)所制得的石墨烯修饰TiO2NTs电极上，室温下静置20min，即制得MC-LR光电化学适配体传感器(Aptamer/G/TiO2NTs)，其中，使用的MC-LR的适配体的碱基序列为：

[0064] 5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’；

[0065] (5)MC-LR的光电分析：采用传统的三电极体系，以MC-LR光电化学适配体传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，0.15M pH为7.4的PBS缓冲溶液为支持电解质，配制不同浓度的MC-LR标准溶液，以标准加入法添加到以MC-LR光电化学适配体传感器为工作电极的三电极体系中，室温作用45min，施加0.45V偏压，在可见光激发下采用I-t曲线法进行光电流测定，通过光电流密度的变化量与各MC-LR标准溶液浓度的对数关系绘制标准工作曲线，然后将含MC-LR的待检测样品添加到三电极体系中，测定光电流密度，结合标准工作曲线即可得待检测样品的MC-LR浓度。

[0066] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。