一种γ-谷氨酸转移酶荧光探针及其制备与应用

摘要

本发明公开了一种式(Ⅰ)所示γ‑谷氨酸转移酶荧光探针及其制备与应用，本发明选用的四苯乙烯结构是个聚集诱导发光型的荧光团，具有良好的光谱稳定性以及高荧光量子产率，同时在聚集状态下不会引发荧光淬灭效应。更为重要的是是本申请所合成的探针结构更为简单，化学性质更为稳定，制备更为方便，与其它结构相似的探针相比，优选探针对γ‑谷氨酸转移酶具有极高的选择性，为研究细胞中γ‑谷氨酸转移酶的生理作用提供一种有效的研究工具。其中R1为H、或R2和R3同R1，且R1、R2和R3不同时为H。

权利要求

1.一种γ-谷氨酸转移酶荧光探针，其特征在于所述荧光探针为下列之一：

2.一种权利要求1所述γ-谷氨酸转移酶荧光探针的制备方法，其特征在于所述方法为：将N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯溶于二氯甲烷中，依次加入1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、三乙胺和式(Ⅱ)所示化合物，室温下反应12小时，将反应液分离纯化，获得所述γ-谷氨酸转移酶荧光探针；

所述式(Ⅱ)所示化合物为下列之一：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于式(Ⅱ)所示化合物与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为0.25-0.3:1，所述二氯甲烷体积用量以式(Ⅱ)所示化合物物质的量计为35-40mL/mmol；所述1-羟基苯并三唑与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比为0.6:1，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为0.6:1，三乙胺与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为1:1。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述反应液分离纯化方法为：反应结束后，将反应液减压浓缩至无液体流出，获得浓缩液，将浓缩液以体积比15:1的二氯甲烷和甲醇混合液为展开剂进行薄层层析分离，收集Rf值为0.5的目标产物；再将目标产物加入无水二氯甲烷a中，静置澄清后加入三氟乙酸，室温搅拌反应4h，TLC追踪，完全反应后，旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸至无液体流出，加无水二氯甲烷b重复旋蒸几次，随后加入甲醇溶解，滴入乙醚中，析出固体，过滤，滤饼烘干，获得γ-谷氨酸转移酶荧光探针；所述无水二氯甲烷a体积用量以目标产物质量计为0.16ml/mg，所述三氟乙酸体积用量以目标产物质量计为0.08ml/mg。

5.一种权利要求1所述γ-谷氨酸转移酶荧光探针在检测γ-谷氨酸转移酶中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述γ-谷氨酸转移酶为0～1000U/Lγ-谷氨酸转移酶缓冲溶液。

说明书

一种γ-谷氨酸转移酶荧光探针及其制备与应用

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测细胞内γ-谷氨酸转移酶的荧光染料，具体涉及基于四苯乙烯的新型γ-谷氨酸转移酶类荧光探针的制备方法及应用。(二)背景技术

[0002] γ-谷氨酸转移酶(γ-GGT；EC 2.3.2.2)广泛分布于人体各种组织细胞中，在某些组织的含量尤为丰富，比如肾小管细胞、肝脏细胞和脑毛细血管细胞中。在血细胞以及内皮细胞中也达到了检测含量。人体血清中的γ-谷氨酸转移酶主要来自肝脏，血清中的γ-谷氨酸转移酶含量可以作为肝脏疾病的诊断参数。越来越多的研究也表明γ-谷氨酸转移酶在某些癌细胞中是过量表达的，如宫颈癌细胞、卵巢癌细胞和肝癌细胞中，因此，γ-谷氨酸转移酶的含量也作为癌症诊断的一项重要的参数。目前报道的γ-谷氨酸转移酶探针大多数是基于谷氨酸或者谷胱甘肽作为反应基团。当谷氨酸或者谷胱甘肽被水解后，荧光探针的性质会发生改变。1996年，White等人报道了一类基于香豆素的荧光探针，7位上的氨基被修饰以后荧光淬灭，酶切作用以后，重新生成氨基，荧光得到释放。2014年，Hou等人利用萘酰亚胺荧光基团设计了机理类似的探针，与香豆素相同，萘酰亚胺也是ICT类的探针，4位上的氨基被修饰后荧光淬灭，与γ-谷氨酸转移酶反应后，谷氨酸与萘酰亚胺之间的酰胺键断裂，荧光得到恢复。基于四苯乙烯类染料高荧光量子产率、低细胞毒性、低淬灭性等优点，特别是具有聚集发光的独特荧光特性，我们设计并合成了一种以四苯乙烯为母核的γ-谷氨酸转移酶类荧光探针，这类探针能够成功用于γ-谷氨酸转移酶的活性检测。(三)发明内容

[0003] 本发明目的是提供一种新型γ-谷氨酸转移酶类荧光探针及其制备方法与其快速、灵敏地检测谷氨酸转移酶活性的用途。

[0004] 本发明采用的技术方案是：

[0005] 本发明提供一种式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸转移酶荧光探针，

[0006]

[0007] 其中 R1 为 H、R2和R3同R1，且R1、R2和R3不同时为H。

[0008] 进一步，优选所述γ-谷氨酸转移酶探针为下列之一：

[0009]

[0010] 更优选(Ⅰ-1)和(Ⅰ-2)。

[0011] 本发明还提供一种所述γ-谷氨酸转移酶荧光探针的制备方法，所述方法为：将N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯溶于二氯甲烷中，依次加入1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、三乙胺和式(II)所示化合物，室温下反应12小时，将反应液分离纯化，获得所述式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸转移酶荧光探针；

[0012]

[0013] 式(II)中R1为H、-CH2NH2或-NH2，R2和R3同R1，且R1、R2和R3不同时为H。

[0014] 进一步，优选所述式(II)所示化合物为下列之一：

[0015]

[0016] 进一步，式(II)所示化合物与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为0.25-0.3:1，优选0.25:1，所述二氯甲烷体积用量以式(II)所示化合物物质的量计为35-40mL/mmol，优选35mL/mmol；所述1-羟基苯并三唑与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比为0.6:1，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为0.6:1，三乙胺与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为1:1。

[0017] 进一步，所述反应液分离纯化方法为：反应结束后，将反应液减压浓缩至无液体流出，获得浓缩液，将浓缩液以体积比15:1的二氯甲烷和甲醇混合液为展开剂进行薄层层析分离，收集Rf值为0.5的目标产物；再将目标产物加入无水二氯甲烷a中，静置澄清后加入三氟乙酸，室温搅拌反应4h，反应过程TLC检测式(II)所示化合物的含量，茚三酮显色进行追踪，完全反应后，旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸至无液体流出，加无水二氯甲烷b重复旋蒸几次，随后加入甲醇溶解，滴入乙醚中，析出固体，过滤，滤饼烘干，获得式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸转移酶荧光探针；所述无水二氯甲烷a体积用量以目标产物质量计为0.16ml/mg，所述三氟乙酸体积用量以目标产物质量计为0.08ml/mg。

[0018] 本发明还提供一种所述γ-谷氨酸转移酶荧光探针在检测γ-谷氨酸转移酶中的应用，所述γ-谷氨酸转移酶为0～1000U/Lγ-谷氨酸转移酶缓冲溶液。所述的γ-谷氨酸转移酶的荧光检测的方法为：以化合物(I)作为荧光探针，与含γ-谷氨酸转移酶的PBS缓冲溶液中的γ-谷氨酸转移酶进行反应，生成荧光物质(II-1)或(II-2)，测定在激发波为360nm下的荧光强度变化，从而实现对γ-谷氨酸转移酶的检测。

[0019] 本发明荧光探针的结构中以苯环上氨基与酰胺之间的转化，实现推-拉电子能力的变化，从而达到吸收光谱以及发射波谱蓝移的效果。

[0020] 本发明所述二氯甲烷a和二氯甲烷b均为二氯甲烷，为了便于表述不同步骤用量不同而命名，字母本身没有含义。

[0021] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明选用的四苯乙烯结构是个聚集诱导发光型的荧光团，具有良好的光谱稳定性以及高荧光量子产率，同时在聚集状态下不会引发荧光淬灭效应。更为重要的是是本申请所合成的探针结构更为简单，化学性质更为稳定，制备更为方便，与其它结构相似的探针相比，优选探针对γ-谷氨酸转移酶具有极高的选择性，为研究细胞中γ-谷氨酸转移酶的生理作用提供一种有效的研究工具。(四)附图说明

[0022] 图1为本发明中探针(I-1)的核磁氢谱。

[0023] 图2为本发明中探针(I-2)的核磁氢谱。

[0024] 图3为本发明中探针(I-1)的核磁碳谱。

[0025] 图4为本发明中探针(I-2)的核磁碳谱。

[0026] 图5为本发明中探针(I)在pH为7.4最佳激发与发射波长的测定光谱，a代表探针(I-1)，b代表探针(I-2)，虚线表示最佳激发波长，实线表示最佳发射波长。

[0027] 图6为本发明中探针(I)在不同溶剂中的荧光光谱，a代表探针(I-1)，b代表探针(I-2)。

[0028] 图7为本发明中探针(I)在不同比例的二氯甲烷和乙醇混合溶液中的荧光光谱，a代表探针(I-1)，b代表探针(I-2)。

[0029] 图8为本发明中探针(I-1-7)在pH为7.4的条件下加入500U/Lγ-谷氨酸转移酶后荧光光谱的变化。

[0030] 图9为本发明中探针(I)在pH为7.4的条件下加入500U/Lγ-谷氨酸转移酶后荧光光谱的变化，a代表探针(I-1)，b代表探针(I-2)。

[0031] 图10为本发明中探针(I)在pH为7.4的条件下与不同酶作用的荧光光谱变化，a代表探针(I-1)，b代表探针(I-2)，c代表探针(I-1)与探针(I-2)分别与失活酶以及加入抑制剂体系的作用结果。

[0032] 图11为本发明中探针(I)制备流程图。(五)具体实施方式

[0033] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0034] 本发明所述室温是指25℃。

[0035] 实施例1探针(I-1，I-2和I-5)的合成

[0036] (1)探针(I-1)

[0037] 将N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羟基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室温反应1h后，加入化合物(II-1)(27.3mg，0.07mmol)，室温反应过夜，用旋转蒸发仪浓缩溶剂至无液体流出，浓缩液用薄层层析硅胶板(展开剂：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值为0.5的化合物(III-1)53mg，产率为80.3％。将化合物(III-1)(50mg，0.075mmol)加入到装有8mL无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室温搅拌反应4h。反应过程TLC检测式(II-1)所示化合物的含量，茚三酮显色进行追踪，完全反应后旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸，加二氯甲烷重复旋蒸几次，尽量将TFA抽干。随后加入2ml甲醇溶解剩余固体，将溶液滴入20ml乙醚中，有白色固体析出。过滤得白色固体，烘干，得淡黄色固体16mg，即化合物(I-1)，产率48.2％。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图3。

[0038]

[0039] 化合物(III-1)

[0040] 化合物(I-1)：

[0041] 1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.87–7.70(m,5H),7.63–7.45(m,6H),7.44–7.17(m,7H),4.38(qt,J＝8.7,4.0Hz,2H),3.00–2.84(m,4H),2.50(dddd,J＝19.7,15.1,12.3,
7.4Hz,4H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ171.05,169.98,144.70,143.84,143.71,140.13,
138.62,137.58,137.56,131.40,131.03,128.08,127.98,126.68,125.79,119.01,118.76,
116.71,114.41,112.11,54.97,51.75,31.78,25.83.

[0042] (2)探针(I-2)

[0043] 将步骤(1)中化合物(II-1)改为化合物(II-2)(27.3mg，0.07mmol)，其它操作同步骤(1)，获得探针(I-2)16mg，产率48.2％。核磁氢谱见图2，核磁碳谱见图4。

[0044]

[0045] 化合物(III-2)

[0046] 化合物(I-2)：

[0047] 1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.45–7.23(m,7H),7.08(tdd,J＝9.6,7.4,5.8Hz,6H),7.00–6.92(m,3H),6.87(dd,J＝16.8,8.5Hz,2H),3.95(dtt,J＝19.2,5.9,3.8Hz,2H),
2.55–2.43(m,4H),2.08(ddp,J＝28.1,21.0,7.1Hz,4H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ171.23,
159.36,158.43,140.40,131.61,131.25,128.82,128.64,128.53,128.25,126.83,119.02,
118.97,116.68,114.39,112.10,54.57,51.99,31.94,25.96.

[0048] (3)探针(I-5)

[0049] 将步骤(1)中化合物N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯改为化合物N-叔丁氧羰基-D-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)，其它操作同步骤(1)，获得探针(I-5)168mg，产率50％。

[0050] 1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.42–7.37(m,4H),7.35(dd,J＝8.0,6.7Hz,4H),7.28(ddt,J＝11.5,7.4,2.2Hz,6H),7.14–7.09(m,4H),3.41(t,J＝7.0Hz,1H),3.17–3.10(m,1H),3.07(dd,J＝12.6,3.1Hz,1H),2.80(s,2H),2.78–2.71(m,2H),2.68–2.62(m,1H),
2.62–2.55(m,1H),2.49(tdd,J＝12.8,7.0,2.4Hz,1H),2.37(ddt,J＝12.6,6.9,2.9Hz,
1H),2.14–2.06(m,1H),1.83(s,2H).

[0051]

[0052] 化合物(III-5)。

[0053] 实施例2探针(I-3和I-4)的合成

[0054] (1)探针(I-3)

[0055] 将N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羟基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室温反应1h后，加入化合物(II-3)(27.3mg，0.07mmol)，室温反应过夜，用旋转蒸发仪浓缩溶剂至无液体流出，浓缩液用薄层层析硅胶板(展开剂：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值为0.5的化合物(III-3)43mg，产率为76.8％。将化合物(III-3)(80mg，0.1mmol)加入到装有8mL无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室温搅拌反应4h。反应过程TLC检测式(II-3)所示化合物的含量，茚三酮显色进行追踪，完全反应后旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸，加二氯甲烷重复旋蒸几次，尽量将TFA抽干。随后加入2ml甲醇溶解剩余固体，将溶液滴入20ml乙醚中，有白色固体析出。过滤得白色固体，烘干，得淡黄色固体46mg，即化合物(I-3)，产率80％。

[0056]

[0057] 化合物(III-3)

[0058] 1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.50(s,1H),7.41–7.37(m,2H),7.35–7.27(m,8H),7.25(d,J＝4.7Hz,6H),7.11–7.05(m,2H),4.99–4.88(m,1H),4.32–4.20(m,1H),3.24(t,J＝7.0Hz,1H),2.81(td,J＝12.4,4.1Hz,1H),2.68–2.56(m,1H),2.51(ddd,J＝12.3,
4.8,2.0Hz,1H),2.30(d,J＝1.5Hz,3H),2.15(tdd,J＝12.3,7.1,4.9Hz,1H),0.75(s,2H).[0059] (2)探针(I-4)

[0060] 将步骤(1)中化合物N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯改为化合物N-叔丁氧羰基-D-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)，其它操作同步骤(1)，获得探针(I-4)46mg，产率80％。

[0061] 1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.50(s,1H),7.41–7.37(m,2H),7.35–7.27(m,8H),7.25(d,J＝4.7Hz,6H),7.11–7.05(m,2H),4.99–4.88(m,1H),4.32–4.20(m,1H),3.24(t,J＝7.0Hz,1H),2.81(td,J＝12.4,4.1Hz,1H),2.68–2.56(m,1H),2.51(ddd,J＝12.3,
4.8,2.0Hz,1H),2.30(d,J＝1.5Hz,3H),2.15(tdd,J＝12.3,7.1,4.9Hz,1H),0.75(s,2H).[0062]

[0063] 化合物(III-4)。

[0064] 实施例4探针(I-6)的合成

[0065] 将N-叔丁氧羰基-D-谷氨酸-1-叔丁酯(119.2mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羟基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室温反应1h后，加入化合物(II-1)(27.3mg，0.07mmol)，室温反应过夜，用旋转蒸发仪浓缩溶剂至无液体流出，浓缩液用薄层层析硅胶板(展开剂：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值为0.5的化合物(III-6)73mg，产率为85.4％。将化合物(III-6)(70mg，0.075mmol)加入到装有8mL无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室温搅拌反应4h。反应过程TLC检测式(II-1)所示化合物的含量，茚三酮显色进行追踪，完全反应后旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸，加二氯甲烷重复旋蒸几次，尽量将TFA抽干。随后加入2ml甲醇溶解剩余固体，将溶液滴入20ml乙醚中，有白色固体析出。过滤得白色固体，烘干，得淡黄色固体40.2mg，即化合物(I-6)，产率87％。

[0066]

[0067] 化合物(III-6)

[0068] 1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.87–7.70(m,5H),7.63–7.45(m,6H),7.44–7.17(m,7H),4.38(qt,J＝8.7,4.0Hz,2H),3.00–2.84(m,4H),2.50(dddd,J＝19.7,15.1,12.3,
7.4Hz,4H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ171.05,169.98,144.70,143.84,143.71,140.13,
138.62,137.58,137.56,131.40,131.03,128.08,127.98,126.68,125.79,119.01,118.76,
116.71,114.41,112.11,54.97,51.75,31.78,25.83.

[0069] 实施例4探针(I-7)的合成

[0070] 将N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯(119.2mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羟基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室温反应1h后，加入化合物(II-4)(27.3mg，0.07mmol)，室温反应过夜，用旋转蒸发仪浓缩溶剂至无液体流出，浓缩液用薄层层析硅胶板(展开剂：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值为0.5的化合物(III-7)73mg，产率为85.4％。将化合物(III-7)(40mg，0.04mmol)加入到装有8mL无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室温搅拌反应4h。反应过程TLC检测式(II-4)所示化合物的含量，茚三酮显色进行追踪，完全反应后旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸，加二氯甲烷重复旋蒸几次，尽量将TFA抽干。随后加入2ml甲醇溶解剩余固体，将溶液滴入20ml乙醚中，有白色固体析出。过滤得白色固体，烘干，得淡黄色固体18mg，即化合物(I-7)，产率54％。

[0071]

[0072] 化合物(III-7)

[0073] 1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.50(s,2H),7.41–7.32(m,8H),7.29(td,J＝7.2,6.8,1.9Hz,4H),7.25–7.13(m,6H),5.12–5.02(m,1H),4.76(dd,J＝12.4,1.3Hz,1H),4.32–4.25(m,1H),4.23–4.16(m,1H),3.50(t,J＝7.0Hz,1H),3.43(t,J＝7.1Hz,1H),3.39–3.28(m,
3H),2.86–2.78(m,1H),2.63–2.51(m,2H),2.47–2.41(m,1H),2.33(s,2H),1.96–1.88(m,
1H),1.56–1.42(m,1H).

[0074] 实施例5探针(I)在pH为7.4条件下最佳激发与发射波长的测定

[0075] 准确称取0.2g实施例1制备的探针(I-1)和(I-2)，分别用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，用移液枪各吸取6μL加入到294μL磷酸缓冲液(10mM、pH＝7.4)，测定两个混合液的激发光谱和发射光谱，结果见图5。

[0076] 根据图5的结果可知探针(I-1)和(I-2)的最佳激发与发射波长均是360nm/460nm。从结果可推断出化合物(II-1)，(II-2)在与氨基酸发生反应以后会出现50nm的蓝移。

[0077] 实施例6探针(I)在不同溶剂中的荧光性质

[0078] 准确称取0.2g实施例1制备的探针(I-1)和(I-2)，分别用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，用移液枪各吸取4μL分别加入到294μL的甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、丙酮、乙醇和水中，用荧光酶标仪进行荧光扫描，λex＝360nm荧光谱图见图6。

[0079] 探针(I-1)和(I-2)在二氯甲烷中的荧光强度最高，在四氢呋喃和丙酮中也较强，而在水中强度比在上述非极性溶剂中低很多，说明这些探针的水溶性较好，适合用于生物检测。

[0080] 实施例7探针(I)聚集诱导发光性质的测定

[0081] 准确称取0.2g实施例1制备的探针(I-1)和(I-2)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，用移液枪各吸取6μL加入到294μL不同浓度的二氯甲烷和乙醇混合溶液中(混合溶液中二氯甲烷体积浓度分别为0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，100％)，并测定其在360nm激发下的荧光值。荧光强度曲线见图7。

[0082] 探针(I)在二氯甲烷含量在0-80％变化时，荧光强度基本保持不变，而从80-100％变化时，荧光强度急剧增加。该现象符合聚集诱导发光原理，说明该类探针具有聚集诱导发光性质。

[0083] 实施例8探针(I-1～I-7)在pH为7.4条件下加入500U/Lγ-谷氨酸转移酶后荧光光谱的变化

[0084] 为筛选得到可检测γ-谷氨酸转移酶的最佳探针，在微量离心管中分别加入适量的PBS缓冲液(pH＝7.4)，随后加入γ-谷氨酸转移酶酶液(500U/L)，最后分别加入探针I-1～I-7(20μM)，37℃反应1h后用荧光酶标仪在λex＝360nm下进行全波段扫描，荧光谱图见图8。

[0085] 从图8检测结果可得出，在所有7个探针中，I-1和I-2对γ-谷氨酸转移酶有优异的响应值，而其它5个探针对该酶没有响应，证明了这两个探针具有极高的专一性。

[0086] 实施例9探针(I)在pH为7.4条件下加入500U/Lγ-谷氨酸转移酶后荧光光谱的变化

[0087] 准确称取0.2g实施例1制备的探针(I-1)和(I-2)，分别用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，用移液枪各吸取6μL加入到284μL磷酸缓冲液(10mM pH＝7.4)，分别加入γ-谷氨酸转移酶至终浓度为500U/L，37℃下反应，在不同时间点(分别为0、2、5、10、20、30、40、50、60、70min)测定其荧光值。激发波长为350nm，荧光谱图见图9。

[0088] 从图9检测结果得出当γ-谷氨酸转移酶加入以后，在460nm出会迅速出现一个增强峰，这是γ-谷氨酸转移酶与探针的非特异性结合，而随着γ-谷氨酸转移酶催化水解反应的进行，在460nm处的峰下降，510nm出的荧光强度越来越高。反应进行至60min时，反应基本完全，70min时荧光增强不明显。

[0089] 实施例10探针(I)在pH为7.4条件下的选择性实验

[0090] 准确称取0.2g实施例1制备的探针(I-1)和(I-2)，分别用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，用移液枪各吸取6μL加入到284μL磷酸缓冲液(10mM pH＝7.4)，分别加入热失活处理的γ-谷氨酸转移酶、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸失活处理的γ-谷氨酸转移酶以及胃蛋白酶、α-蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、BSA至终浓度均为500U/L。37℃下反应1小时，测定其荧光值，以不加蛋白为对照。激发波长为360nm，荧光谱图见图10。

[0091] 实验证明，探针(I)的抗干扰能力十分好，即对γ-谷氨酸转移酶的专一性比较好。