快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合、方法及应用

摘要

本发明公开了一种快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合，所述分子标记组合采用CSR238、CSR1297、LG04‑06三对引物组合；本发明还公开了利用上述分子标记组合快速鉴定不同白化茶树品种的方法及含有上述分子标记的试剂盒；本发明可以对市场上的白化茶树品种进行区分鉴定，且鉴定方法简单、快速，可以解决目前市场长期存在的白化茶树品种命名混乱的问题；本发明还公开了一种白化茶树品种的指纹图谱，茶叶销售企业也可利用本发明生成的二维码指纹图谱对公司不同白化茶树品种加工而成的产品进行标注，从而使消费者更加方便的了解产品信息。

权利要求

1.一种快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合，其特征在于，所述分子标记组合采用CSR238、CSR1297、LG04-06三对引物组合；

所述CSR238的引物序列为：

正向引物：TGACCCTACAACAAGACC反向引物：TTGCCAACAAGCACCAC所述CSR1297的引物序列为：

正向引物：CAAATGCATAATGTGGTCGC反向引物：ATTTCCCTCCCTTTCATGCT所述LG04-06的引物序列为：

正向引物：ACAGACCTTCACCCTCTCCATTTC反向引物：GTTTACCTCTGCCTTCGTTCTTCAGC。

2.根据权利要求1所述的快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合，其特征在于，所述白化茶树品种包括：景宁白茶1号、MP1001、千年雪、郁金香、黄叶宝、花叶、安吉黄茶、黄金菊、安吉白茶、天台白茶、四明雪芽、景宁白茶2号、越乡白茶、中黄1号、黄金芽、中黄2号。

3.一种利用分子标记组合快速鉴定不同白化茶树品种的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的分子标记组合来鉴定不同白化茶树品种；

所述白化茶树品种包括：景宁白茶1号、MP1001、千年雪、郁金香、黄叶宝、花叶、安吉黄茶、黄金菊、安吉白茶、天台白茶、四明雪芽、景宁白茶2号、越乡白茶、中黄1号、黄金芽、中黄

2号。

4.根据权利要求3所述的快速鉴定不同白化茶树品种的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)对待测茶树品种提取DNA；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，以CSR238、CSR1297、LG04-06为引物分别进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)的PCR产物进行电泳分离，获得待测样品的分离带型；

(4)对步骤(3)中的样品进行带型统计，对比判定，即可鉴定待测茶树品种。

5.根据权利要求4所述的快速鉴定不同白化茶树品种的方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用待测茶树品种的新鲜幼叶或是成品茶提取DNA。

6.根据权利要求4所述的快速鉴定不同白化茶树品种的方法，其特征在于，所述步骤(4)具体为：对步骤(3)中的样品进行带型统计，将三对引物的扩增结果转换成1和0字符串后与下表的指纹图谱代码进行比对即可鉴定茶树品种；下表的指纹图谱代码由利用所述三对引物扩增16个白化茶树品种得到的等位基因转换成1和0字符串获得；

7.一种快速鉴定不同白化茶树品种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的分子标记组合。

8.一种权利要求1或2所述的快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合在制备试剂盒中的应用。

说明书

快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合、方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及茶树生物技术领域，特别是涉及快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合、方法及应用。

背景技术

[0002] 白茶品种是一类在特定条件下产生的具有不同程度的叶绿素缺失的叶色突变体，属于茶树中的珍稀资源，目前在全国各地均有发现，如浙江的安吉白茶、景宁白茶、黄金芽；江西的黄金菊等。已有的研究表明，这类茶树资源由于代谢机制的特异性，新稍芽叶的叶绿素合成减少，碳代谢受抑制，使其芽叶呈现出不同程度的白化现象，同时由于氮代谢增强，显著提高了游离氨基酸的生成量，使得有些品种资源的游离氨基酸含量能达到6％以上，茶氨酸含量达3％以上。以这类白化突变体为原料制作的茶样，因具有更高的氨基酸含量和更优异的外形，使其经济价值更高，已成为各地茶农增收的重要途径，很多新育成的白化茶树品种苗木市场价格高达1-2元/株。但随着新育成白化茶树品种的增多，以及新品种较高的苗木和成品茶价格，很多不法商贩开始利用茶叶和茶苗品种不易鉴定的特点，以老充新、以次充好。经调研发现，很多茶农经常不确定其购买的茶苗为哪一个品种，出现买到假苗或不合适苗的现象；也有很多茶叶加工企业不确定其加工出的成品茶是源自那一品种，从而无法为消费者提供更加准确的产品信息。而目前尚未有一种有效的手段可以将不同白化茶树茶苗或成品茶的具体品种鉴定区分的方法。因此，如何能创设一种快速、有效的鉴定不同白化茶树品种的分子标记，成为急需改进的目标。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种可以快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合。

[0004] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

[0005] 一种快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合，所述分子标记组合采用CSR238、CSR1297、LG04-06三对引物组合；所述CSR238的引物序列为：正向引物：TGACCCTACAACAAGACC，反向引物：TTGCCAACAAGCACCAC；所述CSR1297的引物序列为：正向引物：CAAATGCATAATGTGGTCGC，反向引物：ATTTCCCTCCCTTTCATGCT；所述LG04-06的引物序列为：正向引物：ACAGACCTTCACCCTCTCCATTTC,反向引物：GTTTACCTCTGCCTTCGTTCTTCAGC。

[0006] 进一步地，所述白化茶树品种包括：景宁白茶1号、MP1001、千年雪、郁金香、黄叶宝、花叶、安吉黄茶、黄金菊、安吉白茶、天台白茶、四明雪芽、景宁白茶2号、越乡白茶、中黄1号、黄金芽、中黄2号。

[0007] 本发明还提供了一种利用上述分子标记组合快速鉴定不同白化茶树品种的方法。

[0008] 进一步地，具体包括如下步骤：

[0009] (1)对待测茶样或茶树苗木提取DNA；

[0010] (2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，以CSR238、CSR1297、LG04-06为引物分别进行PCR扩增；

[0011] (3)对步骤(2)的PCR产物进行电泳分离，获得待测样品的分离带型；

[0012] (4)对步骤(3)中的样品进行带型统计，对比判定，即可鉴定待测茶树品种。

[0013] 进一步地，所述步骤(1)中采用待测茶树品种的新鲜幼叶或是成品茶提取DNA。

[0014] 进一步地，所述步骤(4)具体为：对步骤(3)中的样品进行带型统计，将三对引物的扩增结果转换成1和0字符串后与下表的指纹图谱代码进行比对即可鉴定茶树品种；下表的指纹图谱代码由利用所述三对引物扩增16个白化茶树品种得到的等位基因转换成1和0字符串获得；

[0015]

[0016] 本发明还提供了一种快速鉴定不同白化茶树品种的试剂盒，所述试剂盒包括上述的分子标记组合。

[0017] 本发明还提供了上述快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合在制备试剂盒中的应用。

[0018] 本发明还提供了一种白化茶树品种的指纹图谱，由上述快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合中的三对引物对白化茶树品种扩增得到的等位基因转换成1和0字符串，并利用在线二维码生成器生成。

[0019] 通过采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：

[0020] 1、本发明采用三对分子标记组合或包含其的试剂盒，可以对市场上的白化茶树品种进行区分鉴定，且鉴定方法简单、快速，可以解决目前市场上白化茶树品种混杂的问题，有利于育种工作的开展及白化茶树品种背景信息的确认，

[0021] 2、茶叶销售企业也可利用本发明生成的二维码对公司不同白化茶树品种加工而成的产品进行标注，从而使消费者更加方便的了解产品信息。

附图说明

[0022] 上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

[0023] 图1是16个白化茶树品种Neighbor-Joining聚类图；

[0024] 图2是利用三对分子标记组合(CSR238、CSR1297、LG04-06)对16个白化茶树品种进行扩增的电泳图；

[0025] 图3是16个白化品种的指纹图谱二维码。

具体实施方式

[0026] 实施例1分子标记组合的筛选实验

[0027] 1材料与方法

[0028] 1.1材料

[0029] 供试的16种白化茶树样品(见表1)所示，样品均采自国家茶树种质资源圃杭州分圃。采摘各供试样品无病虫害感染的一芽二叶新梢，液氮迅速冷冻后，于-80℃环境中保存备用。

[0030] 表1供试样品的编号、名称

[0031]

[0032]

[0033] 1.2方法

[0034] 1.2.1基因组DNA提取方法

[0035] 将所有样品在液氮中磨成粉末，采用CTAB法提取基因组DNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，利用ND-1000微量紫外分光光度计测定DNA浓度，后将DNA浓度稀释至工作浓度20ng/ul，用于PCR扩增，剩余原液-20℃保存备用。

[0036] 1.2.2 PCR扩增及产物检测

[0037] 从本实验室设计、筛选的SSR引物中选取62对多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物，用于供试材料的SSR-PCR分析。PCR反应在ABI公司的PCR扩增仪上进行，反应体系为DNA 2ul，Tap DNA polymerase(2U/ul)0.2ul，dNTP(10nmol/L)0.2ul，10×PCR buffer(Mg2+)1ul以及Primer(10umol/L)各0.2ul，PCR扩增程序为94℃预变性4min，然后94℃变性30s，不同温度下退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。扩增产物用
10％的聚丙烯酰胺电泳检测，150V电压下电泳80min，电泳结束后银染法显色。

[0038] 1.2.3数据处理及分析

[0039] 数据处理采用人工读带的方法，将电泳图上目的片段范围内清晰的条带，按照分子量大小，从大到小按照A、B、C、D、E等依次记录，从而建立原始数据库。利用软件POPGENE分析62对引物在16个白化品种中的扩增等位基因数(Observed number of alleles，Na)、有效等位基因(Effective  number  of  alleles，Ne)、观测杂合度(Observed heterozygosity，HO)、期望杂合度(Expected heterozygosity，HE)、Shannon信息指数(Shannon’s information index，I)；利用软件PowerMarker分析基因型数(Genotype)和多态性信息量(Polymorphism information content，PIC)，之后计算16个品种间的Nei’s遗传距离，构建Neighbor-Joining(NJ)系统进化树，进行聚类分析。最后根据62对SSR引物扩增的基因型数及PIC值，从中筛选出扩增条带清晰、PIC值高的作为核心引物，将扩增出的基因型转化为[0，1]数据矩阵，利用在线二维码生成器(http：mh.cli.im)构建分子指纹图谱。

[0040] 2结果与分析

[0041] 2.1 16个白化品种的SSR多态性

[0042] 观测62对引物的谱带，发现除7对引物之外，剩余的55对引物扩增出的谱带均表现出多态性，55对引物的序列见下表2。分析这55对引物的扩增结果(见表3)，发现共扩增出169个等位基因(Na)，平均每对引物扩增出3.07个，最多有5个，最少的只有2个；有效等位基因(Ne)的变异范围在1.06～3.61之间，平均值为2.06；共检测到基因型234个，范围在2～9个之间；引物的观测杂合度(HO)最大值为0.87(CSR231)，最小值为0(CSR88)；期望杂合度(HE)最大值为0.75(CSR1297)，最小值为0.12(CSR1317、CSR1614、CSR1633、CSR1669)；
Shannon信息指数(I)的范围在0.14～1.39之间，平均值为0.79；而多态性信息含量(PIC)变化范围较大，在0.059～0.675之间，平均值为0.401，其中引物CSR1297的PIC值最高，而大于等于平均值的引物有30个，超过总数的一半，这说明这些引物总体上多态性情况尚好，多态性的高低往往与引物鉴别力有关，多态性越高，则鉴别力就越强。

[0043] 表2 55对SSR标记的引物序列表

[0044]

[0045]

[0046] 表3 55个SSR标记在16个茶树品种中的扩增结果

[0047]

[0048]

[0049]

[0050] 2.2 16个白化茶树品种之间亲缘关系分析

[0051] 根据55对SSR引物扩增的等位基因出现频率计算Nei’s遗传距离(D)，结果显示16个白化茶树品种间的遗传距离在0.086～0.532，说明这16个白化品种间的遗传差异比较明显；黄金芽和黄叶宝之间的遗传距离最大，说明此两个品种间的亲缘关系较远。

[0052] 基于Nei’s遗传距离，采用NJ法绘制16个品种的品种聚类图(参见图1)。从聚类图中可以看出，当D≈0.18时，16个品种基本聚为三大类，第Ⅰ类仅有两个品种，分别是黄金菊和花叶；第Ⅱ类包括郁金香、天台白茶等10个品种，而第Ⅲ类则包括中黄2号、黄金芽、中黄1号和越乡白茶等4个品种。相同地理来源的品种基本聚在一起，第Ⅱ和第Ⅲ类聚类的品种大部分都来自浙江省，其中千年雪和四明雪芽均来自浙江省余姚市。

[0053] 利用该聚类图，能够使茶树育种工作者了解现有白化品种资源的谱系关系，从而在选择杂交亲本创制新的白化品种时更加有的放矢。

[0054] 2.3 DNA指纹图谱的构建

[0055] 分析55对SSR引物扩增结果，发现16个品种均具有特征谱带，利用这些特征引物可以快速准确地鉴定出这些品种(表4)。从表4中可以发现，具有特征引物的16个品种中，每个品种都至少有1对引物可以独立鉴别，最多的可达9对，但没有任何一对引物能够将这16个白化品种全部区分开，这就需要采用引物相互组合的方式，通过2对以上的引物进行区分。

[0056] 表4 16个茶树品种的特征引物

[0057]

[0058] 在以上结果的基础上，本发明综合考虑了55对引物扩增条带清晰度、基因型数目及PIC值等因素，遵循以最少的引物鉴定全部品种的原则，筛选出CSR238、CSR1297、LG04-06三对引物，利用这三对引物可将参试的16个品种全部区分开，引物扩增的电泳图参见图2。随后将这三对引物扩增得到的等位基因转换成1和0字符串(表5)，作为每个品种的分子身份证，并利用在线二维码生成器(http：mh.cli.im)建立了这16个白化品种的指纹图谱(图
3)。

[0059] 表5 16个白化茶树品种的指纹图谱代码

[0060]

[0061] 实施例2利用分子标记组合快速鉴定不同白化茶树品种的方法

[0062] 通过实施例1筛选出的三对引物可以用来鉴别目前市场上的主要白化茶树品种，从而解决目前市场上茶树白化苗木命名混杂的问题。

[0063] 如当茶农或茶苗繁育企业完全不清楚某一白化茶树品种的背景信息时，则可以利用本研究筛选出的CSR238、CSR1297、LG04-06三对引物对该品种进行鉴定，具体鉴定方法为：

[0064] (1)对待测茶树品种的新鲜幼叶或是成品茶提取DNA；

[0065] (2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，以CSR238、CSR1297、LG04-06为引物分别进行PCR扩增；

[0066] (3)对步骤(2)的PCR产物进行电泳分离，获得待测样品的分离带型；

[0067] (4)对步骤(3)中的样品进行带型统计，对比判定，即可鉴定待测茶树品种。

[0068] 步骤(4)中对带型统计完之后，可以直接与标准(用上述三对引物扩增16个白化茶树品种所获得的电泳图谱带型)进行对比判定。也可以对步骤(3)中的样品进行带型统计，将三对引物的扩增结果转换成1和0字符串后与表5中的指纹图谱代码进行比对即可鉴定茶树品种。

[0069] 当茶农或茶苗繁育企业需鉴定市场上销售的某一白化茶树品种是否为“景宁白茶1号”时，可利用本项研究筛选出的该品种的任意特征引物之一(CSR829/CSR1297)进行PCR鉴定，鉴定结果如确为该品种的特征带型，则可判定为该白化茶树苗木为“景宁白茶1号”，否则可判定为“否”。

[0070] 实施例3指纹图谱二维码的应用

[0071] 茶叶销售企业可利用本发明实施例1生成的二维码对公司不同白化茶树品种加工而成的产品进行标注，从而使消费者更加方便的了解产品信息。

[0072] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

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