富血小板血浆冻干粉及制法和用途

摘要

本发明涉及富血小板血浆冻干粉及制法和用途。具体涉及从血液中提取富血小板血浆并制备其冻干粉的方法，包括步骤：(a)使全血置含抗凝剂的容器中，使血液和抗凝剂混匀；(b)使该血液置于离心管中，进行一次离心，使之分成三层；(c)将最上层和大部分的间层抽出并转移到新离心管，混合均匀，进行二次离心；(d)弃离心管上层血浆，用剩余血浆使沉淀的血小板重新悬浮，即得富血小板血浆；(e)向该富血小板血浆中添加冻干赋形剂，冷冻干燥，即得。还涉及本发明方法制得的冻干粉，以及其用途，例如用于骨科、口腔科、颌面外科、运动医学以及美容医学。本发明冻干粉中包括冻干赋形剂并且该冻干粉具有优异技术效果。

权利要求

1.从血液中提取富血小板血浆并制备其冻干粉的方法，其包括以下步骤：(a)使采集的全血置于含有抗凝剂的容器中，使血液和抗凝剂充分混匀；

(b)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，使血液分成三层；

(c)将最上层和大部分的中间层抽出并转移到新的离心管中，混合均匀，进行第二次离心；

(d)弃掉离心管上层的血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，即得富血小板血浆；

(e)向该富血小板血浆中添加冻干赋形剂，冷冻干燥，即得，其特征在于：

步骤(a)中，抗凝剂选自乙二胺四乙酸及其盐、枸橼酸钠、枸橼酸葡萄糖溶液、或其组合，在所述抗凝剂中还补充添加了氯化镁和酒石酸钾钠两种试剂，以其用于每1ml血液抗凝计两种试剂用量分别是50μg和100μg；

步骤(e)中，所述冻干赋形剂选自海藻糖、麦芽糖及其组合；冻干赋形剂是以水溶液的形式与所述富血小板血浆以体积比0.5 2.5：1的比例混合均匀，再进行冷冻干燥；在混合液~中冻干赋形剂的浓度为0.5 2.5%；随所述冻干赋形剂还一起添加了乙酸钠；所述乙酸钠在~富血小板血浆与冻干赋形剂的混合液中的浓度为0.01 0.05%。

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2.根据权利要求1的方法，步骤(a)中所述全血是新鲜的全血。

3.根据权利要求1的方法，步骤(a)中所述全血是受试个体的全血，所述受试个体是患者或者健康志愿者。

4.根据权利要求1的方法，乙二胺四乙酸或其盐的用量是每0.5 1.5mg用于1ml血液抗~凝。

5.根据权利要求1的方法，枸橼酸钠的用量是每3 5mg用于1ml血液抗凝。

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6.根据权利要求1的方法，枸橼酸葡萄糖溶液包含：枸橼酸0.48g、枸橼酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml，每1ml血液抗凝使用该枸橼酸葡萄糖溶液0.15 0.2ml。

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7.根据权利要求1的方法，步骤(a)中所述容器是离心管或是采血袋。

8.根据权利要求1的方法，步骤(a)中还包括在使血液和抗凝剂混均后取适量用于测定其中血液中血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。

9.根据权利要求1的方法，最上层是含血小板的血浆层，中间一层是血块黄层且其中含有血小板和白细胞，最底层的是红细胞层。

10.根据权利要求1的方法，步骤(b)中离心的转速为2000 rpm   3000 rpm。

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11.根据权利要求1的方法，步骤(b)中离心的转速为2300 rpm   2500 rpm，时间为3-5 ~min。

12.根据权利要求1的方法，步骤(c)中离心的转速为1400 rpm 1600 rpm，时间为18-22 ~min。

13.根据权利要求1的方法，步骤(c)中所得上层和大部分中间层经混匀后，其中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的1.5 4倍。

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14.根据权利要求1的方法，步骤(c)中还包括在使抽取的最上层和中间层混合均匀后，取适量用于测定其中的血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。

15.根据权利要求1的方法，步骤(d)中，所述弃掉离心管上层的血浆是指弃掉离心管上层至少2/4的血浆。

16.根据权利要求1的方法，步骤(d)中，弃掉离心管上层的血浆后，利用下部剩下的血浆重新使沉淀下来的血小板悬浮。

17.根据权利要求1的方法，步骤(d)所得富血小板血浆中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的8-10倍。

18.根据权利要求1的方法，所述两种试剂是在配制抗凝剂时添加到抗凝剂溶液中的。

19.根据权利要求1的方法，在混合液中冻干赋形剂的浓度为0.5 1.5%。

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20.根据权利要求1的方法，步骤(e)中，使所述富血小板血浆与冻干赋形剂水溶液以1:

0.5 1.5的体积比混合均匀，再进行冷冻干燥。

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21.根据权利要求1的方法，所述乙酸钠在富血小板血浆与冻干赋形剂的混合液中的浓度为0.01 0.02%。

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22.一种包含富血小板血浆的冻干粉，其中包括富血小板血浆、冻干赋形剂，其是照权利要求1 21任一项的方法制备得到的。

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23.权利要求1 21任一项的方法制备得到的冻干粉在制备健康产品中的用途，所述的~健康产品应用于骨科、口腔科、颌面外科、运动医学以及美容医学。

说明书

富血小板血浆冻干粉及制法和用途

技术领域

[0001] 本发明属临床医学技术领域，具体涉及一种制备富含血小板的血浆的方法，更特别涉及一种以获得具有高浓度血小板、高血小板回收率等一个或多个方面的优点的富血小板血浆的制备方法。本发明还涉及由本发明方法制备得到的此种制备富血小板血浆PRP，以及由本发明此种方法制备的富血小板血浆PRP在制备健康产品中的用途。例如，所述的健康产品应用于骨科、口腔科、颌面外科、运动医学以及美容医学。本发明还涉及由本发明所制得的富血小板血浆PRP制备冻干粉的方法和所制得的冻干粉。

背景技术

[0002] 富含血小板的血浆，在本领域通常亦可称为富血小板血浆(Platelet Rich Plasma，PRP)，其是通过离心人或动物自身的全血而得到的含高体积分数血小板的血浆。自从上世纪80年代David R.Knighton等人发现血小板细胞能促进血管增生、胶原合成后，人们便致力于将富血小板血浆(PRP)应用于临床，渴望解决修复能力低下的器官组织的损伤修复问题。但由于当时PRP制备困难，限制了其在临床上的推广。

[0003] 经过几十年的研究，已探索出几种较为合适的富血小板血浆制备方法：手工法(一次离心法、二次离心法和三次离心法)及设备制备法。其中，二次离心法的PRP的提取率最高，在临床的应用也最广。利用二次离心法制备PRP的原理如下：(1)抽取静脉血液并将其注入含抗凝剂的试管内；(2)第1次离心可将血液分为3层，最底端的部分为约占血液总体积分数55％的红细胞；顶端部分为约占总体积分数40％的贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)，主要是纤维蛋白原等血浆成分；中间层为仅占总体积分数5％的血小板浓缩物(platelet concentrate，PC)，即俗称的黄衣层；(3)用移液器吸取PPP和PC以及紧邻PC的部分红细胞，并将其注入另一不含抗凝剂的试管中；(2)以一定的速度和时间再次将其离心并将血浆分为3层，最底端是少量剩余的红细胞，顶端是约占总体积分数80％的PPP，两层之间即富集的血小板；(5)用移液器抽取大部分的PPP，并留取足够的血清来容纳悬浮于其中的富集的血小板，得到PRP。另外，PRP中的血小板在体外较脆弱且容易激活，过高的离心速度会使血小板膜破裂降低其生物活性，而较低的离心速度可使血小板活性在制备过程中保持在最低水平，因此离心时速度不宜过快。而且，在不同的离心次数、离心力和离心时间所制备出的PRP中，血小板的体积分数以及各种生长因子的量和活性各不相同。

[0004] 目前虽能制备出成分较为单一、浓度达标的PRP，但其制备技术仍未完全成熟，大多数人推崇的二次离心法存在着操作复杂、过程漫长、产品污染的风险。我国某公司上市的PRP设备存在着PRP中血小板浓度不高的缺陷，而在美国已经上市的PRP设备，其PRP中血红蛋白浓度未公开，因此可能存在着血小板细胞浓度高但纯度不高的缺陷，而且各个上市的PRP设备，其价格相当昂贵，在临床应用推广方面受到较大限制，尤其在发展中国家的应用。目前，解决PRP制备问题的方法仍值得进一步探究，以得到一种方便快捷、纯度及浓度高、价格低廉的制备方法。

[0005] 人体的血小板除了可以在止血的时候提供凝聚作用外，血小板中还含有很多与创伤愈合和骨头再生有关的多种生长因子。如血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor，PDGF)，转化生长因子(Transforming Growth Factor，TGF)，胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)，表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)以及血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)等等，血小板来源的生长因子，对细胞的分化和增殖起着促进作用，这些生长因子相互之间具有协同响应，与其他促进细胞活性的因子相互作用和影响，共同维持着组织环境的平衡，对伤口愈合、修复和再生有着重要的作用。

[0006] 另外，由于PRP可以从患者自身血液中提取，经提取富集处理后，可用于相关疾病的治疗，因而来源丰富，取材方便，制备方法简单而且可以让身体吸收。自身PRP使用能避免病毒传播和免疫排斥的问题出现。因此PRP被广泛应用到不同的医学领域中。如骨科、口腔科、颌面外科、运动医学以及美容医学。

[0007] PRP在目前为止还没有一个统一的制备方法，PRP的制备原理主要是利用血液中各种成分沉降速度不同，通过离心将血液分层。从而获取含血小板的血浆，并利用离心原理进一步的浓缩以获得高浓度的血小板血浆。人体全血中血小板的浓度一般为1～3×105/ml。研究认为浓缩后的PRP血小板浓度应为全血血小板浓度的3-4倍。研究也发现PRP中血小板浓度的提高能有效提高干细胞的增殖和分化能力以及能够显著增加成纤维细胞的增殖和I型胶原蛋白的表达。

[0008] 因此有效的分离和提高PRP中血小板的浓度成为了整个PRP治疗方案的关键。

[0009] 林庶茹等(CN101402940A，中国专利申请号：200810228726.5，发明名称：一种小鼠血小板的提取方法)公开了一种小鼠血小板的提取方法，小鼠眶静脉取血，置于抗凝离心管中，静置30MIN后离心，800RPM离心10MIN，上清液即为富含血小板的血浆。吸出上清液置于干净试管中，3500RPM离心10MIN，弃去上清液，管底沉淀物为血小板。向试管中滴加50～100ML质量浓度为1％草酸铵溶液，以玻璃棒轻轻搅拌，再加入质量浓度为1％草酸铵溶液2～3ML，静置5MIN，使红细胞溶解。3500RPM离心10MIN，弃去上清，加入血小板洗涤液并反复吹打，使成为血小板混悬液，3300RPM离心10MIN，弃去上清，加入少量血小板洗涤液并反复吹打使之成为混悬液。该血小板将作为抗原免疫豚鼠后，取豚鼠血清给小鼠注射，制备过敏性紫癜模型。此方法操作简单，可以得到高浓度的血小板，并很好地解决血小板纯度不佳的问题。这种针对小鼠血液进行血小板富集的方法虽然据信可以获得浓度达1010的血小板，然而该方法未公开其血小板的收率，并且方法在操作上比较繁杂，难以适用于人血的处理。

[0010] 此外，王悦等(CN 102078644A，中国专利申请号201110053979.5，发明名称：一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法)中公开了一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法,所提取的自体富血小板血浆中含有多种复合生长因子,能够有效地促进组织的修复。由1个注射器、1个静脉输液器连接管、1个静脉留置针塑料卡片和1个静脉输液器针头组成；注射器用以抽取静脉血并充当离心管；静脉输液器针头通过静脉输液器连接管和注射器出口连接,静脉输液器针头用以皮肤血管穿刺、抽取抗凝剂和激活剂并向人体需要部位注射提取后的自体富血小板血浆；静脉输液器连接管可弯曲固定于静脉留置针塑料卡片中。据信这种装置在提升血小板提取的操作性方面是有益的。

[0011] 因此，为了从血液中富集血小板而得到有临床治疗意义的富血小板血浆，探寻一种操作过程简单、收率高、富集的血浆中血小板浓度高的方法，是本领域技术人员迫切期待的。另外，将这种富血小板血浆制备成为冻干粉以便于其应用也是本领域技术人员迫切期待的。

发明内容

[0012] 本发明的目的是探索一种简单和高效地分离和浓缩血浆中血小板的方法；特别是本发明为了从血液中富集血小板而得到有临床治疗意义的富血小板血浆，探寻一种操作过程简单、收率高、富集的血浆中血小板浓度高的方法。本发明人发现利用梯度离心法进行血小板的浓缩和分离，在特定操作条件下可以以高收率地获得含浓度高血小板的血浆。本发明的另一个目的是提供由此富血小板血浆制备成为冻干粉的方法。

[0013] 为此，本发明第一方面提供了一种从血液中提取富血小板血浆并制备其冻干粉的方法，其包括以下步骤：

[0014] (a)使采集的全血置于含有抗凝剂的容器中，使血液和抗凝剂充分混匀；

[0015] (b)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，使血液基本上分成三层；

[0016] (c)将最上层和大部分的中间层抽出并转移到新的离心管中，混合均匀，进行第二次离心；

[0017] (d)弃掉离心管上层的血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，即得富血小板血浆(Platelet Rich Plasma，PRP)；

[0018] (e)向该富血小板血浆中添加冻干赋形剂，冷冻干燥，即得。

[0019] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(a)中所述全血是新鲜的全血。

[0020] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(a)中所述全血是受试个体例如患者或者健康志愿者的全血。由此，本发明获得的富血小板血浆可以方便地重新用于该患者以治疗相关疾病，或者用于该健康志愿者的相关需求。

[0021] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(a)中抗凝剂选自乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)及其盐(例如乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸钙钠)、枸橼酸钠、枸橼酸葡萄糖溶液、或其组合。乙二胺四乙酸或其盐的典型用量是每0.5～1.5mg用于1ml血液抗凝，例如每0.75～1.25mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管内壁，亦可以是配制成适宜浓度的溶液(例如浓度为1～2％)涂在抗凝管内壁待干燥后使用。枸橼酸钠的典型用量是每3～5mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管内壁，亦可以是配制成适宜浓度的溶液(例如浓度为3～5％)涂在抗凝管内壁待干燥后使用。本领域常用的枸橼酸葡萄糖溶液的一个典型配方包含：枸橼酸
0.48g、枸橼酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml，每1ml血液抗凝通常使用该枸橼酸葡萄糖溶液0.15～0.2ml。

[0022] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(a)中所述容器可以是离心管或是采血袋等。如果是离心管并且该离心管容量适合直接离心，则所述步骤(b)中不需要另置于离心管中，而可以直接进行离心。

[0023] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(a)中还包括在使血液和抗凝剂混均后取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中血液中血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。

[0024] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(b)中经第一次离心后是达到使血液基本上分成三层的程度。在一个实施方案中，其中最上层是含血小板的血浆层，中间一层是血块黄层(Buffy Coat层，其中含有血小板和白细胞)，最底层的是红细胞层。

[0025] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(b)中离心的转速为2000rpm～3000rpm，例如2200rpm～2800rpm，例如2300rpm～2500rpm，例如约2400rpm。

[0026] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(b)中离心的时间为1-10min，例如2-8min，例如3-5min，例如约4min。

[0027] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(b)中离心的转速为2300rpm～2500rpm，时间为3-5min。

[0028] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(b)中离心的转速为2400rpm，时间为4min。

[0029] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(c)中，所述大部分的中间层是指尽量将中间层全部吸出但避免抽取红细胞。

[0030] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(c)中离心的转速为1000rpm～2000rpm，例如1200rpm～1800rpm，例如1400rpm～1600rpm，例如约1500rpm。

[0031] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(c)中离心的时间为10-30min，例如15-25min，例如18-22min，例如约20min。

[0032] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(c)中离心的转速为1400rpm～1600rpm，时间为18-22min。

[0033] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(c)中离心的转速为1500rpm，时间为20min。

[0034] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(c)中所得上层和大部分中间层经混匀后，其中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的1-5倍，例如1.5～4倍，例如2～3倍。

[0035] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(c)中所得上层和大部分中间层经混匀后，其中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的2.5-3.5倍，例如2.6～3.1倍。

[0036] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(c)中还包括在使抽取的最上层和中间层混合均匀后，取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中的血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。

[0037] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(d)中，所述弃掉离心管上层的血浆是指弃掉离心管上层至少2/4的血浆。在一个实施方案中，在步骤(d)中，所述弃掉离心管上层的血浆是指弃掉离心管上层至少3/4的血浆。在此应当说明，上层血浆中仅含有低浓度的血小板。

[0038] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(d)中，弃掉离心管上层的血浆后，可以利用下部剩下的(约2/4，或者更优选的约1/4)血浆重新使沉淀下来的血小板悬浮，由此可以获取本发明所述富血小板血浆(PRP)。

[0039] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(d)所得富血小板血浆(PRP)中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的5-10倍，例如6～8倍，例如6～7倍，例如6.1～6.8倍。

[0040] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(d)所得富血小板血浆(PRP)中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的8-10倍，例如8.8～9.2倍。

[0041] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(d)中还包括在获得富血小板血浆(PRP)后，取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中的血小板的数量。

[0042] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中在所述抗凝剂中还补充添加了氯化镁和酒石酸钾钠两种试剂，以其用于每1ml血液抗凝计两种试剂用量分别是50μg和100μg。

[0043] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述两种试剂是在配制抗凝剂时添加到抗凝剂溶液中的。

[0044] 本发明由此获得的富血小板血浆(PRP)具有浓度高的特点，并且血小板回收率高。

[0045] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，步骤(d)所得富血小板血浆中包含1～3×109/ml浓度的血小板；例如其中包含1.5～2.5×109/ml浓度的血小板。

[0046] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述冻干赋形剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇、麦芽糖、右旋糖苷及其组合。在一个实施方案中，所述冻干赋形剂是以水溶液的形式与所述富血小板血浆混合的。在一个实施方案中，所述冻干赋形剂是以水溶液的形式与所述富血小板血浆混合的，在混合液中冻干赋形剂的浓度为0.5～2.5％，例如0.5～1.5％。

[0047] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(e)中，使所述富血小板血浆与冻干赋形剂水溶液以1:0.5～2.5的体积比(例如1:0.5～1.5的体积比，例如1:0.6～1.2的体积比)混合均匀，再进行冷冻干燥。

[0048] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述冻干赋形剂是海藻糖或麦芽糖。

[0049] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述冻干赋形剂是海藻糖或麦芽糖，并且随该冻干赋形剂还一起添加了乙酸钠。在一个实施方案中，所述乙酸钠在富血小板血浆与冻干赋形剂的混合液中的浓度为0.01～0.05％，例如0.01～0.02％。已经出人意料地发现，在使用上述特定赋形剂并且同时使用乙酸钠时，本发明所得冻干粉中的相关活性细胞因子呈现显著更高的稳定性。

[0050] 进一步的，本发明第二方面提供了一种包含富血小板血浆的冻干粉，其中包括富血小板血浆、冻干赋形剂。

[0051] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中所述冻干赋形剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇、麦芽糖、右旋糖苷及其组合。在一个实施方案中，所述冻干赋形剂是以水溶液的形式与所述富血小板血浆混合的。在一个实施方案中，所述冻干赋形剂是以水溶液的形式与所述富血小板血浆混合的，在混合液中冻干赋形剂的浓度为0.5～2.5％，例如0.5～1.5％。

[0052] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(e)中，使所述富血小板血浆与冻干赋形剂水溶液以1:0.5～2.5的体积比(例如1:0.5～1.5的体积比，例如1:0.6～1.2的体积比)混合均匀，再进行冷冻干燥。

[0053] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中所述冻干赋形剂是海藻糖或麦芽糖。

[0054] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中所述冻干赋形剂是海藻糖或麦芽糖，并且随该冻干赋形剂还一起添加了乙酸钠。在一个实施方案中，所述乙酸钠在富血小板血浆与冻干赋形剂的混合液中的浓度为0.01～0.05％，例如0.01～0.02％。

[0055] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其基本上是由本发明第一方面任一实施方案所述的方法制得的。

[0056] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其是通过包括以下步骤的方法制备得到的：

[0057] (a)使采集的全血置于含有抗凝剂的容器中，使血液和抗凝剂充分混匀；

[0058] (b)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，使血液基本上分成三层；

[0059] (c)将最上层和大部分的中间层抽出并转移到新的离心管中，混合均匀，进行第二次离心；

[0060] (d)弃掉离心管上层的血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，即得富血小板血浆(Platelet Rich Plasma，PRP)；

[0061] (e)向该富血小板血浆中添加冻干赋形剂，冷冻干燥，即得。

[0062] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(a)中所述全血是新鲜的全血。

[0063] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(a)中所述全血是受试个体例如患者或者健康志愿者的全血。由此，本发明获得的富血小板血浆可以方便地重新用于该患者以治疗相关疾病，或者用于该健康志愿者的相关需求。

[0064] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(a)中抗凝剂选自乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)及其盐(例如乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸钙钠)、枸橼酸钠、枸橼酸葡萄糖溶液、或其组合。乙二胺四乙酸或其盐的典型用量是每0.5～1.5mg用于1ml血液抗凝，例如每0.75～1.25mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管内壁，亦可以是配制成适宜浓度的溶液(例如浓度为1～2％)涂在抗凝管内壁待干燥后使用。枸橼酸钠的典型用量是每3～5mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管内壁，亦可以是配制成适宜浓度的溶液(例如浓度为3～5％)涂在抗凝管内壁待干燥后使用。本领域常用的枸橼酸葡萄糖溶液的一个典型配方包含：枸橼酸0.48g、枸橼酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml，每1ml血液抗凝通常使用该枸橼酸葡萄糖溶液0.15～0.2ml。

[0065] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(a)中所述容器可以是离心管或是采血袋等。如果是离心管并且该离心管容量适合直接离心，则所述步骤(b)中不需要另置于离心管中，而可以直接进行离心。

[0066] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(a)中还包括在使血液和抗凝剂混均后取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中血液中血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。

[0067] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(b)中经第一次离心后是达到使血液基本上分成三层的程度。在一个实施方案中，其中最上层是含血小板的血浆层，中间一层是血块黄层(Buffy Coat层，其中含有血小板和白细胞)，最底层的是红细胞层。

[0068] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(b)中离心的转速为2000rpm～3000rpm，例如2200rpm～2800rpm，例如2300rpm～2500rpm，例如约2400rpm。

[0069] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(b)中离心的时间为1-10min，例如2-8min，例如3-5min，例如约4min。

[0070] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(b)中离心的转速为2300rpm～2500rpm，时间为3-5min。

[0071] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(b)中离心的转速为2400rpm，时间为4min。

[0072] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(c)中，所述大部分的中间层是指尽量将中间层全部吸出但避免抽取红细胞。

[0073] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(c)中离心的转速为1000rpm～2000rpm，例如1200rpm～1800rpm，例如1400rpm～1600rpm，例如约1500rpm。

[0074] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(c)中离心的时间为10-30min，例如15-25min，例如18-22min，例如约20min。

[0075] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(c)中离心的转速为1400rpm～1600rpm，时间为18-22min。

[0076] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(c)中离心的转速为1500rpm，时间为20min。

[0077] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(c)中所得上层和大部分中间层经混匀后，其中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的1-5倍，例如1.5～4倍，例如2～3倍。

[0078] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(c)中所得上层和大部分中间层经混匀后，其中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的2.5-3.5倍，例如2.6～3.1倍。

[0079] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(c)中还包括在使抽取的最上层和中间层混合均匀后，取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中的血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。

[0080] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(d)中，所述弃掉离心管上层的血浆是指弃掉离心管上层至少2/4的血浆。在一个实施方案中，在步骤(d)中，所述弃掉离心管上层的血浆是指弃掉离心管上层至少3/4的血浆。在此应当说明，上层血浆中仅含有低浓度的血小板。

[0081] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(d)中，弃掉离心管上层的血浆后，可以利用下部剩下的(约2/4，或者更优选的约1/4)血浆重新使沉淀下来的血小板悬浮，由此可以获取本发明所述富血小板血浆(PRP)。

[0082] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(d)所得富血小板血浆(PRP)中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的5-10倍，例如6～8倍，例如6～7倍，例如6.1～6.8倍。

[0083] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(d)所得富血小板血浆(PRP)中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的8-10倍，例如8.8～9.2倍。

[0084] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(d)中还包括在获得富血小板血浆(PRP)后，取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中的血小板的数量。

[0085] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中在所述抗凝剂中还补充添加了氯化镁和酒石酸钾钠两种试剂，以其用于每1ml血液抗凝计两种试剂用量分别是50μg和100μg。

[0086] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中所述两种试剂是在配制抗凝剂时添加到抗凝剂溶液中的。

[0087] 根据本发明第二方面任一实施方案的冻干粉，其中步骤(d)所得富血小板血浆中包含1～3×109/ml浓度的血小板；例如其中包含1.5～2.5×109/ml浓度的血小板。

[0088] 众所周知的，富血小板血浆PRP可以用于制备健康产品。例如，所述的健康产品应用于骨科、口腔科、颌面外科、运动医学以及美容医学。

[0089] 因此，本发明第三方面提供了富血小板血浆PRP在制备健康产品中的用途。例如，所述的健康产品应用于骨科、口腔科、颌面外科、运动医学以及美容医学。

[0090] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中所述健康产品是冻干粉。

[0091] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中所述冻干粉基本上是由本发明第一方面任一实施方案所述的方法制得的。

[0092] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中所述冻干粉是通过包括以下步骤的方法制备得到的：

[0093] (a)使采集的全血置于含有抗凝剂的容器中，使血液和抗凝剂充分混匀；

[0094] (b)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，使血液基本上分成三层；

[0095] (c)将最上层和大部分的中间层抽出并转移到新的离心管中，混合均匀，进行第二次离心；

[0096] (d)弃掉离心管上层的血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，即得富血小板血浆(Platelet Rich Plasma，PRP)；

[0097] (e)向该富血小板血浆中添加冻干赋形剂，冷冻干燥，即得。

[0098] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(a)中所述全血是新鲜的全血。

[0099] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(a)中所述全血是受试个体例如患者或者健康志愿者的全血。由此，本发明获得的富血小板血浆可以方便地重新用于该患者以治疗相关疾病，或者用于该健康志愿者的相关需求。

[0100] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(a)中抗凝剂选自乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)及其盐(例如乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸钙钠)、枸橼酸钠、枸橼酸葡萄糖溶液、或其组合。乙二胺四乙酸或其盐的典型用量是每0.5～1.5mg用于1ml血液抗凝，例如每0.75～1.25mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管内壁，亦可以是配制成适宜浓度的溶液(例如浓度为1～2％)涂在抗凝管内壁待干燥后使用。枸橼酸钠的典型用量是每3～5mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管内壁，亦可以是配制成适宜浓度的溶液(例如浓度为3～5％)涂在抗凝管内壁待干燥后使用。本领域常用的枸橼酸葡萄糖溶液的一个典型配方包含：枸橼酸
0.48g、枸橼酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml，每1ml血液抗凝通常使用该枸橼酸葡萄糖溶液0.15～0.2ml。

[0101] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(a)中所述容器可以是离心管或是采血袋等。如果是离心管并且该离心管容量适合直接离心，则所述步骤(b)中不需要另置于离心管中，而可以直接进行离心。

[0102] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(a)中还包括在使血液和抗凝剂混均后取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中血液中血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。

[0103] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(b)中经第一次离心后是达到使血液基本上分成三层的程度。在一个实施方案中，其中最上层是含血小板的血浆层，中间一层是血块黄层(Buffy Coat层，其中含有血小板和白细胞)，最底层的是红细胞层。

[0104] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(b)中离心的转速为2000rpm～3000rpm，例如2200rpm～2800rpm，例如2300rpm～2500rpm，例如约2400rpm。

[0105] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(b)中离心的时间为1-10min，例如2-8min，例如3-5min，例如约4min。

[0106] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(b)中离心的转速为2300rpm～2500rpm，时间为3-5min。

[0107] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(b)中离心的转速为2400rpm，时间为4min。

[0108] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(c)中，所述大部分的中间层是指尽量将中间层全部吸出但避免抽取红细胞。

[0109] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(c)中离心的转速为1000rpm～2000rpm，例如1200rpm～1800rpm，例如1400rpm～1600rpm，例如约1500rpm。

[0110] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(c)中离心的时间为10-30min，例如15-25min，例如18-22min，例如约20min。

[0111] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(c)中离心的转速为1400rpm～1600rpm，时间为18-22min。

[0112] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(c)中离心的转速为1500rpm，时间为20min。

[0113] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(c)中所得上层和大部分中间层经混匀后，其中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的1-5倍，例如1.5～4倍，例如2～3倍。

[0114] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(c)中所得上层和大部分中间层经混匀后，其中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的2.5-3.5倍，例如2.6～3.1倍。

[0115] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(c)中还包括在使抽取的最上层和中间层混合均匀后，取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中的血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。

[0116] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(d)中，所述弃掉离心管上层的血浆是指弃掉离心管上层至少2/4的血浆。在一个实施方案中，在步骤(d)中，所述弃掉离心管上层的血浆是指弃掉离心管上层至少3/4的血浆。在此应当说明，上层血浆中仅含有低浓度的血小板。

[0117] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(d)中，弃掉离心管上层的血浆后，可以利用下部剩下的(约2/4，或者更优选的约1/4)血浆重新使沉淀下来的血小板悬浮，由此可以获取本发明所述富血小板血浆(PRP)。

[0118] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(d)所得富血小板血浆(PRP)中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的5-10倍，例如6～8倍，例如6～7倍，例如6.1～6.8倍。

[0119] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(d)所得富血小板血浆(PRP)中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的8-10倍，例如8.8～9.2倍。

[0120] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(d)中还包括在获得富血小板血浆(PRP)后，取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中的血小板的数量。

[0121] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中在所述抗凝剂中还补充添加了氯化镁和酒石酸钾钠两种试剂，以其用于每1ml血液抗凝计两种试剂用量分别是50μg和100μg。

[0122] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中所述两种试剂是在配制抗凝剂时添加到抗凝剂溶液中的。

[0123] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(d)所得富血小板血浆中包含1～3×109/ml浓度的血小板；例如其中包含1.5～2.5×109/ml浓度的血小板。

[0124] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中所述冻干赋形剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇、麦芽糖、右旋糖苷及其组合。在一个实施方案中，所述冻干赋形剂是以水溶液的形式与所述富血小板血浆混合的。在一个实施方案中，所述冻干赋形剂是以水溶液的形式与所述富血小板血浆混合的，在混合液中冻干赋形剂的浓度为0.5～2.5％，例如0.5～1.5％。

[0125] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(e)中，使所述富血小板血浆与冻干赋形剂水溶液以1:0.5～2.5的体积比(例如1:0.5～1.5的体积比，例如1:0.6～1.2的体积比)混合均匀，再进行冷冻干燥。

[0126] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中所述冻干赋形剂是海藻糖或麦芽糖。

[0127] 根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中所述冻干赋形剂是海藻糖或麦芽糖，并且随该冻干赋形剂还一起添加了乙酸钠。在一个实施方案中，所述乙酸钠在富血小板血浆与冻干赋形剂的混合液中的浓度为0.01～0.05％，例如0.01～0.02％。

[0128] 本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

[0129] 本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

[0130] 在本发明一个实施方案中，所述的全血是人的全血。

[0131] 本发明制备得到的冻干粉，其一种示例性的使用方法是：冻干粉可避光存放于4度至25度环境，未开封的冻干粉可保存6个月；每瓶冻干粉可以配备一支4ml的溶媒(超纯水或透明质酸溶液)，在使用时可以用配备的吸头将溶媒滴至冻干粉瓶，充分溶解后即可涂抹至脸部皮肤；冻干粉用溶媒溶解后可以在4度冰箱内保存，可以在7天内使用完毕。

[0132] 在本发明中，提供了一种采用特定处置条件进行血小板富集的方法。然而本领域技术人员理解，使用本发明的处置条件，其中所用的器具是可以作适当变动的，例如其中的离心装置。例如可以使用王悦等(CN 102078644A，中国专利申请号201110053979.5，发明名称：一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法)中所用的由注射器、静脉输液器连接管、静脉留置针塑料卡片和静脉输液器针头组成的装置，该文献所记载的装置可以用于本发明方法，并使本发明方法在保持操作过程的洁净度中是有益的。

[0133] 出人意料地发现，本发明在研究梯度离心法进行血小板的浓缩和分离的过程中，获得了一种操作过程简单、收率高、富集的血浆中血小板浓度高的方法。还出人意料地发现，使用特定的赋形剂并配合特定的试剂制备得到的冻干粉具有出人意料的稳定性。

具体实施方式

[0134] 通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。

[0135] 下文具体实例中，当提及时使用的抗凝剂，乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾是配制成浓度为1～2％的溶液涂在抗凝管内壁待干燥后使用，每0.8mg用于1ml血液抗凝；枸橼酸钠是配制成浓度为4％的溶液涂在抗凝管内壁待干燥后使用，每4mg用于1ml血液抗凝；枸橼酸葡萄糖溶液的配方包含：枸橼酸0.48g、枸橼酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml，每1ml血液抗凝通常使用该枸橼酸葡萄糖溶液0.18ml。

[0136] 以下实施例1～5和实施例11～15使用的赋形剂溶液中，包括赋形剂海藻糖和乙酸钠，二者浓度分别为2％和0.03％；其在与富血小板血浆以体积比1：1混合后，所得混合液中赋形剂浓度为1％、乙酸钠浓度为0.015％；分别测定这10种冻干粉中的三种细胞因子(即FGF(成纤维细胞生长因子)、TGF-β1(转化生长因子-β1)、PDGF(血小板衍生生长因子))的量(pg/瓶，作为0月量)，再分别测定这些冻干粉在25℃室温处放置3个月后上述三种细胞因子的量(pg/瓶，作为3月量)，对于每一批冻干粉，计算其中某细胞因子3月时的量相当于其0月时的量的百分数，该百分数称为某细胞因子残余百分数。结果显示实施例1～5和实施例11～15所得10个冻干粉样品，FGF残余百分数在96.3～99.6％范围内，TGF-β1残余百分数在97.5～99.2％范围内，PDGF残余百分数在96.8～99.4％范围内，显示这些冻干粉中的特征细胞因子具有优异的稳定性。参照实施例1～5和实施例11～15的补充试验中，但是在步骤(10)将步骤(8)所得富血小板血浆与赋形剂溶液改为以体积比1：0.5或者1：1.5的比例混合，制得的冻干粉，同样进行上述3个月的试验，发现三种细胞因子的残余百分数均大于
96％。参照实施例1～5和实施例11～15的补充试验中，但是采用的赋形剂改为麦芽糖时，制得的冻干粉，同样进行上述3个月的试验，发现三种细胞因子的残余百分数均大于96％。参照实施例1～5和实施例11～15的补充试验中，但是采用的赋形剂改为甘露醇、蔗糖、乳糖、山梨醇、或右旋糖苷时，制得的冻干粉，同样进行上述3个月的试验，发现三种细胞因子的残余百分数均在64～81％范围内。参照实施例1～5和实施例11～15的补充试验中，但是在赋形剂溶液中不添加乙酸钠时，制得的冻干粉，同样进行上述3个月的试验，发现三种细胞因子的残余百分数均在67～79％范围内。参照实施例1～5和实施例11～15的补充试验中，但是在赋形剂溶液中不添加赋形剂而只是用乙酸钠溶液稀释富血小板血浆时，制得的冻干粉，同样进行上述3个月的试验，发现三种细胞因子的残余百分数均在54～73％范围内。

[0137] 本发明的各实施例中，在进行冷冻干燥时，是照如下工艺进行处理的：

[0138] (1)将由富血小板血浆和赋形剂溶液配制成的混合液分瓶分装到冻干瓶中，每瓶8
中包含的血小板数量为5×10 个，将加入混合液的冻干瓶盖上冻干用的胶塞，胶塞不能完全闭合，需露出透气孔才能放在冻干搁板上，关紧冻干箱门，检查真空旋钮指在close，压盖旋钮指在raise，真空泵油的液位处于一半以上，冻干程序设置正常，真空泵值设置正常，然后按run开启程序；

[0139] (2)冻干过程分为两步，第一步为冷冻干燥，第二步为解析干燥，具体程序设置为：

[0140] (a)预冷冻：3.5h(冻干机程序里有预冷冻温度，无需自己设定，预冷冻无需开启真空泵)——>冷冻干燥a：-40度2h，(真空泵会在程序下自动开启，真空度值为0.014mbar)——>冷冻干燥b：-22度12h(主要的干燥步骤)——>0度2h(作为冷冻干燥到解析干燥的过渡)；

[0141] (b)解析干燥：35度解析2-5h(2h的解析干燥就已经足够，时间超出对于冻干结果并无影响)；解析干燥完成之后按下stop关闭程序，旋转压盖旋钮至lower，对冻干瓶进行压盖；压盖完成后，旋转真空旋钮至open，直至箱门可以打开；取出冻干瓶；按下deforst按钮，进行加热除霜，待deforst程序自动结束，指示灯熄灭后，取出冷阱下的积水盘，洗净擦干，放入冻干箱；关闭冻干机；给每瓶冻干粉扎铝盖，放入包装盒。

[0142] 实施例1：提取富血小板血浆(PRP)并制备其冻干粉

[0143] (1)把受试者的全血采集到含有抗凝剂的容器里，容器是可进行离心的采血抗凝管。抗凝剂使用乙二胺四乙酸。

[0144] (2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。提取100微升以计算血小板数量。

[0145] (3)把血液分配到离心管(15毫升)。

[0146] (4)把离心管放进离心机，以转速2400rpm离心4分钟。

[0147] (5)离心后的血液应分为三层：最底层的是红细胞，最上层的是含血小板血浆，中间一层是BuffyCoat，含有血小板和白细胞。

[0148] (6)利用移液器把最上层的血浆和大部分的buffy coat抽出并转移到新的离心管中，尽量避免抽取红细胞。提取100微升以计算血小板数量。

[0149] (7)把含有血浆和buffy coat混合物的离心管放进离心机，以转速1500rpm离心20分钟。

[0150] (8)把3/4的低浓度血小板血浆(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血浆重悬沉淀下来的血小板，获得富血小板血浆(PRP)。

[0151] (9)抽取100微升PRP以进行血小板计数。

[0152] (10)将步骤(8)所得富血小板血浆与赋形剂溶液混合(体积比1：1)均匀，进行冷冻干燥。

[0153] 提取富血小板血浆操作中的试验数据计算：

[0154] (1)分离前全血中血小板浓度：250×106/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为2.5×109。

[0155] (2)第一次离心后血浆中血小板浓度：570×106/ml(浓缩2.28倍)，血浆体积为9
4ml。总血小板数量为2.26×10。回收率为90.4％。

[0156] (3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1680×106/ml(浓缩6.72倍，此倍数是指，所得富血小板血浆中的血小板浓度是分离前全血中血小板浓度的倍数，其在本发明中可称为最终富集倍数)，血浆体积为1.2ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为2.016×9
10 。最终回收率为80.6％(此最终回收率是指，所得富血小板血浆中的血小板数量是分离前全血中血小板数量的百分数)。

[0157] 实施例2：提取富血小板血浆(PRP)并制备其冻干粉

[0158] (1)把受试者的全血采集到含有抗凝剂的容器里，容器是可进行离心的采血抗凝管。抗凝剂使用乙二胺四乙酸二钠。

[0159] (2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。提取100微升以计算血小板数量。

[0160] (3)把血液分配到离心管(15毫升)。

[0161] (4)把离心管放进离心机，以转速2400rpm离心4分钟。

[0162] (5)离心后的血液应分为三层：最底层的是红细胞，最上层的是含血小板血浆，中间一层是BuffyCoat，含有血小板和白细胞。

[0163] (6)利用移液器把最上层的血浆和大部分的buffy coat抽出并转移到新的离心管中，尽量避免抽取红细胞。提取100微升以计算血小板数量。

[0164] (7)把含有血浆和buffy coat混合物的离心管放进离心机，以转速1500rpm离心20分钟。

[0165] (8)把3/4的低浓度血小板血浆(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血浆重悬沉淀下来的血小板，获得富血小板血浆(PRP)。

[0166] (9)抽取100微升PRP以进行血小板计数。

[0167] (10)将步骤(8)所得富血小板血浆与赋形剂溶液混合(体积比1：1)均匀，进行冷冻干燥。

[0168] 提取富血小板血浆操作中的试验数据计算：

[0169] (1)分离前全血中血小板浓度：170×106/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为9
1.7×10。

[0170] (2)第一次离心后血浆中血小板浓度：448×106/ml(浓缩2.64倍)，血浆体积为3.4ml。总血小板数量为1.52×109。回收率为89.4％。

[0171] (3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1160×106/ml(浓缩6.82倍)，血浆体积为1.2ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为1.39×109。最终回收率为81.8％。

[0172] 实施例3：提取富血小板血浆(PRP)并制备其冻干粉

[0173] (1)把受试者的全血采集到含有抗凝剂的容器里，容器是可进行离心的采血抗凝管。抗凝剂使用枸橼酸葡萄糖溶液。

[0174] (2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。提取100微升以计算血小板数量。

[0175] (3)把血液分配到离心管(15毫升)。

[0176] (4)把离心管放进离心机，以转速2400rpm离心4分钟。

[0177] (5)离心后的血液应分为三层：最底层的是红细胞，最上层的是含血小板血浆，中间一层是BuffyCoat，含有血小板和白细胞。

[0178] (6)利用移液器把最上层的血浆和大部分的buffy coat抽出并转移到新的离心管中，尽量避免抽取红细胞。提取100微升以计算血小板数量。

[0179] (7)把含有血浆和buffy coat混合物的离心管放进离心机，以转速1500rpm离心20分钟。

[0180] (8)把3/4的低浓度血小板血浆(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血浆重悬沉淀下来的血小板，获得富血小板血浆(PRP)。

[0181] (9)抽取100微升PRP以进行血小板计数。

[0182] (10)将步骤(8)所得富血小板血浆与赋形剂溶液混合(体积比1∶1)均匀，进行冷冻干燥。

[0183] 提取富血小板血浆操作中的试验数据计算：

[0184] (1)分离前全血中血小板浓度：210×106/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为2.1×109。

[0185] (2)第一次离心后血浆中血小板浓度：540×106/ml(浓缩2.57倍)，血浆体积为3.5ml。总血小板数量为1.89×109。回收率为90％。

[0186] (3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1360×106/ml(浓缩6.48倍)，血浆体积为1.2ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为1.63×109。最终回收率为77.6％。

[0187] 实施例4：提取富血小板血浆(PRP)并制备其冻干粉

[0188] (1)把受试者的全血采集到含有抗凝剂的容器里，容器是可进行离心的采血抗凝管。抗凝剂使用枸橼酸钠。

[0189] (2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。提取100微升以计算血小板数量。

[0190] (3)把血液分配到离心管(15毫升)。

[0191] (4)把离心管放进离心机，以转速2300rpm离心5分钟。

[0192] (5)离心后的血液应分为三层：最底层的是红细胞，最上层的是含血小板血浆，中间一层是BuffyCoat，含有血小板和白细胞。

[0193] (6)利用移液器把最上层的血浆和大部分的buffy coat抽出并转移到新的离心管中，尽量避免抽取红细胞。提取100微升以计算血小板数量。

[0194] (7)把含有血浆和buffy coat混合物的离心管放进离心机，以转速1600rpm离心18分钟。

[0195] (8)把3/4的低浓度血小板血浆(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血浆重悬沉淀下来的血小板，获得富血小板血浆(PRP)。

[0196] (9)抽取100微升PRP以进行血小板计数。

[0197] (10)将步骤(8)所得富血小板血浆与赋形剂溶液混合(体积比1：1)均匀，进行冷冻干燥。

[0198] 提取富血小板血浆操作中的试验数据计算：

[0199] (1)分离前全血中血小板浓度：200×106/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为2×109。

[0200] (2)第一次离心后血浆中血小板浓度：510×106/ml(浓缩2.55倍)，血浆体积为3.5ml。总血小板数量为1.78×109。回收率为89.2％。

[0201] (3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1220×106/ml(浓缩6.1倍)，血浆体积为1.2ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为1.46×109。最终回收率为73.2％。

[0202] 实施例5：提取富血小板血浆(PRP)并制备其冻干粉

[0203] (1)把受试者的全血采集到含有抗凝剂的容器里，容器是可进行离心的采血抗凝管。抗凝剂使用乙二胺四乙酸二钾。

[0204] (2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。提取100微升以计算血小板数量。

[0205] (3)把血液分配到离心管(15毫升)。

[0206] (4)把离心管放进离心机，以转速2500rpm离心3分钟。

[0207] (5)离心后的血液应分为三层：最底层的是红细胞，最上层的是含血小板血浆，中间一层是BuffyCoat，含有血小板和白细胞。

[0208] (6)利用移液器把最上层的血浆和大部分的buffy coat抽出并转移到新的离心管中，尽量避免抽取红细胞。提取100微升以计算血小板数量。

[0209] (7)把含有血浆和buffy coat混合物的离心管放进离心机，以转速1400rpm离心20分钟。

[0210] (8)把3/4的低浓度血小板血浆(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血浆重悬沉淀下来的血小板，获得富血小板血浆(PRP)。

[0211] (9)抽取100微升PRP以进行血小板计数。

[0212] (10)将步骤(8)所得富血小板血浆与赋形剂溶液混合(体积比1：1)均匀，进行冷冻干燥。

[0213] 提取富血小板血浆操作中的试验数据计算：

[0214] (1)分离前全血中血小板浓度：270×106/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为2.7×109。

[0215] (2)第一次离心后血浆中血小板浓度：610×106/ml(浓缩2.26倍)，血浆体积为9
4ml。总血小板数量为2.44×10。回收率为90.4％。

[0216] (3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1830×106/ml(浓缩6.78倍)，血浆体积为1.2ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为2.2×109。最终回收率为81.3％。

[0217] 以上实施例1～5的结果显示，血小板的最终富集倍数为6.1～6.8范围内，血小板最终回收率在73～82％范围内。本发明在以下实施例11～15中，各实例中分别向其中的抗凝剂中补充添加了氯化镁和酒石酸钾钠两种试剂，各抗凝剂中添加两种试剂的量以其用于每1ml血液抗凝计分别是50μg和100μg，在配制抗凝剂时添加到抗凝剂溶液中。实施例11～15的结果显示，血小板的最终富集倍数在8.92～9.14范围内，血小板最终回收率在91.9～
93.6％范围内，两项重要的提取效果指标均明显地高于实施例1～5未加两种试剂时的结果。但是，在补充试验中发现，如果实施例11～15的抗凝剂中仅仅是补充添加氯化镁和酒石酸钾钠中的任一种试剂，则最终富集倍数均在5.8～6.7范围内，血小板最终回收率均在68～84％范围内，明显地低于补充添加两种试剂时的效果。另外，在参照实施例11～15的补充试验中，当乙二胺四乙酸或其盐的用量在每0.5～1.5mg范围内用于1ml血液抗凝、或者当枸橼酸钠的用量在每3～5mg范围内用于1ml血液抗凝、或者当每1ml血液抗凝使用枸橼酸葡萄糖溶液0.15～0.2ml范围内时，血小板的最终富集倍数均在8.9～9.2范围内，血小板最终回收率均在91～934％范围内。表明抗凝剂用量在这些范围时均是适用的。

[0218] 实施例11：提取富血小板血浆(PRP)并制备其冻干粉

[0219] (1)把受试者的全血采集到含有抗凝剂的容器里，容器是可进行离心的采血抗凝管。抗凝剂使用乙二胺四乙酸。

[0220] (2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。提取100微升以计算血小板数量。

[0221] (3)把血液分配到离心管(15毫升)。

[0222] (4)把离心管放进离心机，以转速2400rpm离心4分钟。

[0223] (5)离心后的血液应分为三层：最底层的是红细胞，最上层的是含血小板血浆，中间一层是BuffyCoat，含有血小板和白细胞。

[0224] (6)利用移液器把最上层的血浆和大部分的buffy coat抽出并转移到新的离心管中，尽量避免抽取红细胞。提取100微升以计算血小板数量。

[0225] (7)把含有血浆和buffy coat混合物的离心管放进离心机，以转速1500rpm离心20分钟。

[0226] (8)把3/4的低浓度血小板血浆(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血浆重悬沉淀下来的血小板，获得富血小板血浆(PRP)。

[0227] (9)抽取100微升PRP以进行血小板计数。

[0228] (10)将步骤(8)所得富血小板血浆与赋形剂溶液混合(体积比1：1)均匀，进行冷冻干燥。

[0229] 提取富血小板血浆操作中的试验数据计算：

[0230] (1)分离前全血中血小板浓度：250×106/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为2.5×109。

[0231] (2)第一次离心后血浆中血小板浓度：640×106/ml(浓缩2.56倍)，血浆体积为3.8ml。总血小板数量为2.43×109。回收率为97.3％。

[0232] (3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：2230×106/ml(浓缩8.92倍)，血浆体9
积为1.05ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为2.34×10。最终回收率为93.6％。

[0233] 实施例12：提取富血小板血浆(PRP)并制备其冻干粉

[0234] (1)把受试者的全血采集到含有抗凝剂的容器里，容器是可进行离心的采血抗凝管。抗凝剂使用乙二胺四乙酸二钠。

[0235] (2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。提取100微升以计算血小板数量。

[0236] (3)把血液分配到离心管(15毫升)。

[0237] (4)把离心管放进离心机，以转速2400rpm离心4分钟。

[0238] (5)离心后的血液应分为三层：最底层的是红细胞，最上层的是含血小板血浆，中间一层是BuffyCoat，含有血小板和白细胞。

[0239] (6)利用移液器把最上层的血浆和大部分的buffy coat抽出并转移到新的离心管中，尽量避免抽取红细胞。提取100微升以计算血小板数量。

[0240] (7)把含有血浆和buffy coat混合物的离心管放进离心机，以转速1500rpm离心20分钟。

[0241] (8)把3/4的低浓度血小板血浆(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血浆重悬沉淀下来的血小板，获得富血小板血浆(PRP)。

[0242] (9)抽取100微升PRP以进行血小板计数。

[0243] (10)将步骤(8)所得富血小板血浆与赋形剂溶液混合(体积比1∶1)均匀，进行冷冻干燥。

[0244] 提取富血小板血浆操作中的试验数据计算：

[0245] (1)分离前全血中血小板浓度：170×106/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为1.7×109。

[0246] (2)第一次离心后血浆中血小板浓度：515×106/ml(浓缩3.03倍)，血浆体积为9
3.2ml。总血小板数量为1.65×10。回收率为97.0％。

[0247] (3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1495×106/ml(浓缩8.79倍)，血浆体积为1.05ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为1.57×109。最终回收率为92.4％。

[0248] 实施例13：提取富血小板血浆(PRP)并制备其冻干粉

[0249] (1)把受试者的全血采集到含有抗凝剂的容器里，容器是可进行离心的采血抗凝管。抗凝剂使用枸橼酸葡萄糖溶液。

[0250] (2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。提取100微升以计算血小板数量。

[0251] (3)把血液分配到离心管(15毫升)。

[0252] (4)把离心管放进离心机，以转速2400rpm离心4分钟。

[0253] (5)离心后的血液应分为三层：最底层的是红细胞，最上层的是含血小板血浆，中间一层是BuffyCoat，含有血小板和白细胞。

[0254] (6)利用移液器把最上层的血浆和大部分的buffy coat抽出并转移到新的离心管中，尽量避免抽取红细胞。提取100微升以计算血小板数量。

[0255] (7)把含有血浆和buffy coat混合物的离心管放进离心机，以转速1500rpm离心20分钟。

[0256] (8)把3/4的低浓度血小板血浆(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血浆重悬沉淀下来的血小板，获得富血小板血浆(PRP)。

[0257] (9)抽取100微升PRP以进行血小板计数。

[0258] (10)将步骤(8)所得富血小板血浆与赋形剂溶液混合(体积比1：1)均匀，进行冷冻干燥。

[0259] 提取富血小板血浆操作中的试验数据计算：

[0260] (1)分离前全血中血小板浓度：210×106/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为2.1×109。

[0261] (2)第一次离心后血浆中血小板浓度：650×106/ml(浓缩3.1倍)，血浆体积为3.15ml。总血小板数量为2.05×109。回收率为97.5％。

[0262] (3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1920×106/ml(浓缩9.14倍)，血浆体积为1.02ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为1.96×109。最终回收率为93.3％。

[0263] 实施例14：提取富血小板血浆(PRP)并制备其冻干粉

[0264] (1)把受试者的全血采集到含有抗凝剂的容器里，容器是可进行离心的采血抗凝管。抗凝剂使用枸橼酸钠。

[0265] (2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。提取100微升以计算血小板数量。

[0266] (3)把血液分配到离心管(15毫升)。

[0267] (4)把离心管放进离心机，以转速2300rpm离心5分钟。

[0268] (5)离心后的血液应分为三层：最底层的是红细胞，最上层的是含血小板血浆，中间一层是BuffyCoat，含有血小板和白细胞。

[0269] (6)利用移液器把最上层的血浆和大部分的buffy coat抽出并转移到新的离心管中，尽量避免抽取红细胞。提取100微升以计算血小板数量。

[0270] (7)把含有血浆和buffy coat混合物的离心管放进离心机，以转速1600rpm离心18分钟。

[0271] (8)把3/4的低浓度血小板血浆(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血浆重悬沉淀下来的血小板，获得富血小板血浆(PRP)。

[0272] (9)抽取100微升PRP以进行血小板计数。

[0273] (10)将步骤(8)所得富血小板血浆与赋形剂溶液混合(体积比1：1)均匀，进行冷冻干燥。

[0274] 提取富血小板血浆操作中的试验数据计算：

[0275] (1)分离前全血中血小板浓度：200×106/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为2×109。

[0276] (2)第一次离心后血浆中血小板浓度：606×106/ml(浓缩3.03倍)，血浆体积为3.22ml。总血小板数量为1.95×109。回收率为97.6％。

[0277] (3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1778×106/ml(浓缩8.89倍)，血浆体积为1.04ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为1.85×109。最终回收率为92.5％。

[0278] 实施例15：提取富血小板血浆(PRP)并制备其冻干粉

[0279] (1)把受试者的全血采集到含有抗凝剂的容器里，容器是可进行离心的采血抗凝管。抗凝剂使用乙二胺四乙酸二钾。

[0280] (2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。提取100微升以计算血小板数量。

[0281] (3)把血液分配到离心管(15毫升)。

[0282] (4)把离心管放进离心机，以转速2500rpm离心3分钟。

[0283] (5)离心后的血液应分为三层：最底层的是红细胞，最上层的是含血小板血浆，中间一层是BuffyCoat，含有血小板和白细胞。

[0284] (6)利用移液器把最上层的血浆和大部分的buffy coat抽出并转移到新的离心管中，尽量避免抽取红细胞。提取100微升以计算血小板数量。

[0285] (7)把含有血浆和buffy coat混合物的离心管放进离心机，以转速1400rpm离心20分钟。

[0286] (8)把3/4的低浓度血小板血浆(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血浆重悬沉淀下来的血小板，获得富血小板血浆(PRP)。

[0287] (9)抽取100微升PRP以进行血小板计数。

[0288] (10)将步骤(8)所得富血小板血浆与赋形剂溶液混合(体积比1：1)均匀，进行冷冻干燥。

[0289] 提取富血小板血浆操作中的试验数据计算：

[0290] (1)分离前全血中血小板浓度：270×106/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为9
2.7×10。

[0291] (2)第一次离心后血浆中血小板浓度：796×106/ml(浓缩2.95倍)，血浆体积为3.3ml。总血小板数量为2.63×109。回收率为97.4％。

[0292] (3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：2435×106/ml(浓缩9.02倍)，血浆体积为1.02ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为2.48×109。最终回收率为91.9％。

[0293] 用本实施例15方法，针对三个客户(客户A、客户B、客户C)的血样制备所得富血小板血浆，测定其中三种细胞因子(即FGF(成纤维细胞生长因子)、TGF-β1(转化生长因子-β1)、PDGF(血小板衍生生长因子))的量(pg/ml)，结果见表1。

[0294] 表1：富血小板血浆中三种细胞因子的测定结果

[0295]

[0296] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。