生物基稳定的石墨烯衍生物及其制备方法与应用

摘要

本发明提供了一种生物基稳定的石墨烯衍生物，其制备方法为：将氧化石墨烯超声分散在水中，调节pH值至9～10，得到氧化石墨烯水分散液；将两性离子硅烷化试剂溶于水中，得到两性离子硅烷化试剂水溶液；将所述两性离子硅烷化试剂水溶液滴加至所述氧化石墨烯水分散液中，滴完后在25～80℃下搅拌反应3～24h，之后于截留分子量为8000～14000的透析袋中对去离子水透析6～12h，冷冻干燥，即得目标产物；本发明生物基稳定的石墨烯衍生物制备过程简单，安全性高，所得产品在去离子水以及血清溶液中稳定性较好，可作为药物载体应用于芳香族药物的负载，在生物医用领域具有较大的应用前景。

权利要求

1.一种生物基稳定的石墨烯衍生物，其特征在于，所述的生物基稳定的石墨烯衍生物按如下方法制备得到：将氧化石墨烯按料液质量比1：250～500超声分散在水中，调节pH值至9～10，得到氧化石墨烯水分散液；将两性离子硅烷化试剂按料液质量比1：10～30溶于水中，得到两性离子硅烷化试剂水溶液；将所述两性离子硅烷化试剂水溶液滴加至所述氧化石墨烯水分散液中，滴完后在25～80℃下搅拌反应3～24h，之后于截留分子量为8000～14000的透析袋中对去离子水透析6～12h，冷冻干燥，即得所述生物基稳定的石墨烯衍生物；

所述氧化石墨烯水分散液以氧化石墨烯的质量计与两性离子硅烷化试剂水溶液以两性离子硅烷化试剂的质量计之比为1：0.5～2.5；

所述的两性离子硅烷化试剂中，两性离子部分为羧酸甜菜碱或磺酸甜菜碱，硅烷化试剂部分为三甲氧基/乙氧基型硅烷化试剂、二甲氧基/乙氧基型硅烷化试剂或单甲氧基/乙氧基型硅烷化试剂。

2.如权利要求1所述的生物基稳定的石墨烯衍生物，其特征在于，所述的氧化石墨烯按如下方法制备得到：将纳米石墨粉与浓硫酸混合，搅拌6～12h后，冰水浴下加入KMnO4，先于0～20℃维持15～30min，再升温至35～45℃维持20～40min，接着升温至85～95℃维持85～95min，然后加入水A，继续升温至100～105℃维持20～30min，最后加入水B和30wt％H2O2溶液，离心，先用

5wt％盐酸溶液洗涤，再用去离子水洗涤至上清液为中性，冻干即可得到所述的氧化石墨烯；

所述的浓硫酸的体积用量以纳米石墨粉的质量计为20mL/g；

所述纳米石墨粉与KMnO4的物质的量之比为3.32：1；

所述的浓硫酸与水A、水B、30wt％H2O2溶液的体积比为10：23：70：5。

3.如权利要求1所述的生物基稳定的石墨烯衍生物，其特征在于，所述的两性离子硅烷化试剂为磺酸甜菜碱类三甲氧基型硅烷化试剂。

4.如权利要求3所述的生物基稳定的石墨烯衍生物，其特征在于，所述磺酸甜菜碱类三甲氧基型硅烷化试剂按如下方法制备得到：将1’3-丙磺酸内酯以料液质量比1：6～8溶于无水丙酮中，在冰水浴、N2保护条件下，滴加硅烷化试剂，滴完后搅拌反应6h，之后离心得到白色沉淀，用无水丙酮洗涤，真空干燥即可得到所述的磺酸甜菜碱类三甲氧基型硅烷化试剂；

所述的1’3-丙磺酸内酯与硅烷化试剂的物质的量之比为1：1；

所述的硅烷化试剂为N’N-二甲基-3-氨丙基-三甲氧基硅烷。

5.如权利要求1所述的生物基稳定的石墨烯衍生物作为药物载体在芳香族药物的负载中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：

将所述的生物基稳定的石墨烯衍生物分散在去离子水A中，加入芳香族药物并在室温下搅拌3～12h，之后于截留分子量为8000～14000的透析袋中对去离子水B透析6～12h，得到芳香族药物与生物基稳定的石墨烯衍生物的复合物分散液，即实现了芳香族药物的负载；

所述去离子水A的体积用量以所述生物基稳定的石墨烯衍生物的质量计为300～

700mL/g；

所述生物基稳定的石墨烯衍生物与所述芳香族药物的质量比为1：0.25～0.5。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的芳香族药物为阿霉素、盐酸阿霉素、喜树碱、表阿霉素、盐酸表阿霉素、吡柔比星、盐酸吡柔比星、伊达比星、盐酸伊达比星或叶酸。

说明书

生物基稳定的石墨烯衍生物及其制备方法与应用

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物基稳定的石墨烯衍生物及其制备方法与应用。(二)背景技术

[0002] 石墨烯是由碳原子紧密堆积成的单层二维的一种新型碳材料，由于石墨烯及其衍生物拥有纳米级尺寸、大片层结构和独特的π-π作用结构，因此可以作为芳香族药物的优良载体。然而由于石墨烯的亲水性不佳，进而促使氧化石墨烯在生物领域的应用得到广泛的发展。氧化石墨烯是最常用的一种石墨烯衍生物，其片层上引入了的羧基、羟基等含氧官能团，使其亲水性得到较大的改善。但是，氧化石墨烯负载药物后的亲水性却不尽人意，并且氧化石墨烯在生物体内不稳定，极易吸附蛋白而发生聚沉，然后被人体网状内皮系统识别而清除出体内，极大的限制了其在生物领域的应用。

[0003] 两性离子是一类同时带有阴、阳离子基团的化合物，具有极强的亲水性、优良的热和化学稳定性、优异的生物相容性以及良好的抗污染性能等特性。因为两性离子化合物会通过离子溶剂化作用结合水分子，在其表面形成一层牢固的水化层，其周围的水分子接近于自由状态，对于靠近表面的蛋白质产生强烈的排斥作用，从而阻断蛋白质的吸附；同时不与蛋白质发生相互作用，也不会改变蛋白质的结构。因此，我们设计将两性离子修饰至氧化石墨烯表面，使其具备抗蛋白吸附的性能，同时提高其载药后的亲水性。(三)发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种生物基稳定的石墨烯衍生物及其制备方法与应用。

[0005] 本发明利用氧化石墨烯上丰富的羟基与两性离子硅烷化试剂发生水解反应，从而得到生物基分散的氧化石墨烯，之后利用π-π共轭作用负载芳香族药物。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] 一种生物基稳定的石墨烯衍生物，按如下方法制备得到：

[0008] 将氧化石墨烯按料液质量比1：250～500超声分散(300KHz，30～45min)在水中，(用0.1～0.5M的NaOH溶液)调节pH值至9～10，得到氧化石墨烯水分散液；将两性离子硅烷化试剂按料液质量比1：10～30溶于水中，得到两性离子硅烷化试剂水溶液；将所述两性离子硅烷化试剂水溶液滴加至所述氧化石墨烯水分散液中，滴完后在25～80℃下搅拌反应3～24h，之后于截留分子量为8000～14000的透析袋中对去离子水透析6～12h，冷冻干燥，即得所述生物基稳定的石墨烯衍生物；

[0009] 所述氧化石墨烯水分散液以氧化石墨烯的质量计与两性离子硅烷化试剂水溶液以两性离子硅烷化试剂的质量计之比为1：0.5～2.5。

[0010] 本发明所述的氧化石墨烯可通过现有技术中已报道的改良的Hummers法制备得到(例如参见：Graphene-Based Anticancer Nanosystem and Its Biosafety Evaluation Using a Zebrafish Model.Biomacromolecules 2013,14,358-366)，具体步骤如下：

[0011] 将纳米石墨粉与浓硫酸混合，搅拌6～12h后，冰水浴下加入KMnO4，先于0～20℃维持15～30min，再升温至35～45℃维持20～40min，接着升温至85～95℃维持85～95min，然后加入水A，继续升温至100～105℃维持20～30min，最后加入水B和30wt％H2O2溶液，离心，先用5wt％盐酸溶液洗涤，再用去离子水洗涤至上清液为中性，冻干即可得到所述的氧化石墨烯；

[0012] 所述的浓硫酸的体积用量以纳米石墨粉的质量计为20mL/g；

[0013] 所述纳米石墨粉与KMnO4的物质的量之比为3.32：1；

[0014] 所述的浓硫酸与水A、水B、30wt％H2O2溶液的体积比为10：23：70：5；

[0015] 所述的水A、水B没有特殊的含义，均指通常意义上的水，标记为“A”、“B”只是用于区分不同操作步骤中用到的水。

[0016] 本发明所述的两性离子硅烷化试剂可按照现有文献中所公开的方法制备得到，例如参见：Estephan Z G,Jaber J A,Schlenoff J B.Zwitterion-stabilized silica nanoparticles:toward nonstick nano.Langmuir,2010,26(22):16884-9。所述的两性离子硅烷化试剂中，两性离子部分可以是羧酸甜菜碱或磺酸甜菜碱，硅烷化试剂部分可以是三甲氧基/乙氧基型硅烷化试剂、二甲氧基/乙氧基型硅烷化试剂或单甲氧基/乙氧基型硅烷化试剂。具体优选磺酸甜菜碱类三甲氧基型硅烷化试剂，其制备方法为：

[0017] 将1’3-丙磺酸内酯以料液质量比1：6～8溶于无水丙酮中，在冰水浴、N2保护条件下，滴加硅烷化试剂，滴完后搅拌反应6h，之后离心得到白色沉淀，用无水丙酮洗涤，真空干燥即可得到所述的磺酸甜菜碱类三甲氧基型硅烷化试剂；

[0018] 所述的1’3-丙磺酸内酯与硅烷化试剂的物质的量之比为1：1；

[0019] 所述的硅烷化试剂为N’N-二甲基-3-氨丙基-三甲氧基硅烷。

[0020] 本发明制备得到的生物基稳定的石墨烯衍生物在水以及血清溶液中分散性较好，并可稳定较长时间，可作为药物载体应用于芳香族药物的负载，所述应用的方法为：

[0021] 将本发明所述的生物基稳定的石墨烯衍生物分散在去离子水A中，加入芳香族药物并在室温(20～30℃)下搅拌3～12h，之后于截留分子量为8000～14000的透析袋中对去离子水B透析6～12h，得到芳香族药物与生物基稳定的石墨烯衍生物的复合物分散液(直接以液体形式保存)，即实现了通过π-π共轭作用进行芳香族药物的负载；

[0022] 所述去离子水A的体积用量以所述生物基稳定的石墨烯衍生物的质量计为300～700mL/g；

[0023] 所述生物基稳定的石墨烯衍生物与所述芳香族药物的质量比为1：0.25～0.5；

[0024] 所述的芳香族药物可以为阿霉素、盐酸阿霉素、喜树碱、表阿霉素、盐酸表阿霉素、吡柔比星、盐酸吡柔比星、伊达比星、盐酸伊达比星或叶酸等，优选盐酸阿霉素。

[0025] 所述的去离子水A、去离子水B没有特殊的含义，均指通常意义上的去离子水，标记为“A”、“B”只是用于区分不同操作步骤中用到的去离子水。

[0026] 本发明的有益效果在于：制备过程较为简单，几乎没有用到有机溶剂，安全性较高，并且制备得到的产品在去离子水以及血清溶液中稳定性较好，在生物医用领域具有较大的应用前景。(四)附图说明

[0027] 图1：实施例1制备的GO、SB-GO和DOX@SB-GO的傅里叶变换红外光谱图；

[0028] 图2：实施例1制备的(a)GO、(b)GO-SB、(c)DOX@SB-GO的水合粒径图以及GO-SB的透射电镜图；

[0029] 图3：实施例1制备的GO、SB-GO在37℃时水中的稳定性照片；

[0030] 图4：实施例1制备的DOX@GO、DOX@SB-GO在37℃时水中的稳定性照片；

[0031] 图5：实施例1制备的GO、SB-GO在37℃时10％FBS溶液中的稳定性照片；

[0032] 图6：实施例1制备的DOX@SB-GO在不同温度下的释药曲线；

[0033] 图7：不同浓度的SB-GO、DOX@SB-GO、Free DOX与HepG 2细胞共培养48h以后的细胞毒性；

[0034] 图8：实施例3制备的DOX@SB-GO复合物及单纯阿霉素的荧光谱图。(五)具体实施方式

[0035] 以下对本发明的实施方式给出详细介绍，但本发明的保护范围不限于此。

[0036] 实施例1

[0037] (1)制备磺酸甜菜碱类三甲氧基型硅烷化试剂(记作SBS)

[0038] 将1g(8.19mmol)1'3-丙磺酸内酯溶于10mL无水丙酮中，在冰水浴、N2保护条件下，缓慢滴加1.685g(8.13mmol)N’N-二甲基-3-氨丙基-三甲氧基硅烷，滴完后搅拌反应6h，离心得到白色沉淀，用无水丙酮洗涤数次，真空干燥过夜，即可得到所述的磺酸甜菜碱类三甲氧基型硅烷化试剂2.42g。

[0039] (2)制备氧化石墨烯(记作GO)

[0040] 将1g(0.083mol)纳米石墨粉与20mL浓硫酸混合，搅拌过夜，冰水浴下加入4g(0.025mol)KMnO4，先于10℃维持25min，再缓慢升温至40℃维持30min，接着缓慢升温至90℃维持90min，然后加入46mL水，继续升温至104℃维持25min，最后加入140mL水和10mL30％H2O2，离心，用5％盐酸洗涤多次，再用去离子水洗至上清液为中性，冻干即可得到氧化石墨烯0.76g。

[0041] (3)制备生物基稳定的石墨烯衍生物(记作SB-GO)

[0042] 称取100mg氧化石墨烯超声分散在30mL去离子水中，用0.2MNaOH溶液调节pH至9～10之间，得到氧化石墨烯水分散液。接着将步骤(1)制备的SBS 0.238g溶解在5mL去离子水中，并缓慢滴加到上述氧化石墨烯分散液中，滴完后于25℃下搅拌反应6h，得到的溶液产物放入截留分子量为8000～14000的透析袋中对去离子水透析一天，冷冻干燥，得到生物基稳定的石墨烯衍生物0.150g。

[0043] (4)生物基稳定的石墨烯衍生物(SB-GO)负载药物阿霉素盐酸盐(DOX)[0044] 称取100mg步骤(3)制备的SB-GO分散于30mL去离子水中，另外称取30mg阿霉素盐酸盐(DOX)溶于30mL去离子水中，并缓慢滴加到上述SB-GO分散液中，在室温条件下搅拌反应12h，得到的溶液产物放入截留分子量为8000～14000的透析袋中对去离子水透析一天，得到DOX@SB-GO复合物分散液。

[0045] 图1为制备的GO、SB-GO和DOX@SB-GO的傅里叶变换红外光谱图，与GO相比，SB-GO的-1特征IR谱峰中出现了1037cm (Si-O的伸缩振动峰)的吸收峰，这说明SB已经成功地修饰到了GO上面，而DOX@SB-GO的谱峰中1211cm-1和1281cm-1处出现的吸收峰则说明DOX已经成功地通过π-π共轭作用连接到GO上面。

[0046] 图2中a、b、c、d分别为GO、GO-SB、DOX@SB-GO的水合粒径图以及GO-SB的透射电镜图，由图中可知氧化石墨烯修饰上了两性离子之后，其水合粒径略有减小并且粒径分布稍稍变窄，另外，受到π-π共轭作用的影响，负载了DOX之后，复合物的粒径略有上升，并且，粒径分布也变得更宽。图2(d)显示，所制备得到的SB-GO厚度很薄，在TEM下几近透明。

[0047] 称取100mg GO分散于30mL去离子水中，另外称取30mg DOX溶于30mL去离子水中，并缓慢滴加到上述GO分散液中，在室温条件下搅拌反应12h，得到的溶液产物放入截留分子量为8000-14000的透析袋中对去离子水透析一天，得到DOX@GO复合物分散液。

[0048] 图3、4为GO、SB-GO、DOX@SB-GO以及DOX@GO在水中稳定性照片，可知，用两性离子硅烷化试剂改性后，负载了阿霉素之后的体系在水中稳定性明显提高。

[0049] 图5为GO、SB-GO在10％胎牛血清(FBS)溶液中的稳定性照片，可知，修饰了两性离子后一定程度上提升了GO在FBS溶液中的稳定性。

[0050] 图6为DOX@SB-GO在不同温度下的释药曲线图，证明了其在较高稳定下可以有效的释药。

[0051] 另外从图7可以得知，DOX@SB-GO对HepG2癌细胞具有明显的细胞毒性。

[0052] 实施例2

[0053] (1)制备磺酸甜菜碱类三甲氧基型硅烷化试剂(记作SBS)

[0054] 将1g(8.19mmol)1'3-丙磺酸内酯溶于10mL无水丙酮中，在冰水浴、N2保护条件下，缓慢滴加1.685g(8.13mmol)N’N-二甲基-3-氨丙基-三甲氧基硅烷，滴完后搅拌反应6h，离心得到白色沉淀，用无水丙酮洗涤数次，真空干燥过夜，即可得到所述的磺酸甜菜碱类三甲氧基型硅烷化试剂2.31g。

[0055] (2)制备氧化石墨烯(记作GO)

[0056] 将1g(0.083mol)纳米石墨粉与20mL浓硫酸混合，搅拌过夜，冰水浴下加入4g(0.025mol)KMnO4，先于10℃维持25min，再缓慢升温至40℃维持30min，接着缓慢升温至90℃维持90min，然后加入46mL水，继续升温至104℃维持25min，最后加入140mL水和10mL 30％H2O2，离心，用5％盐酸洗涤多次，再用去离子水洗至上清液为中性，冻干即可得到氧化石墨烯0.67g。

[0057] (3)制备生物基稳定的石墨烯衍生物(记作SB-GO)

[0058] 称取100mg氧化石墨烯超声分散在30mL去离子水中，用0.2MNaOH溶液调节pH至9～10之间，得到氧化石墨烯水分散液。接着将步骤(1)制备的SBS 0.198g溶解在5mL去离子水中，并缓慢滴加到上述氧化石墨烯分散液中，滴完后于80℃下搅拌反应6h，得到的溶液产物放入截留分子量为8000～14000的透析袋中对去离子水透析一天，冷冻干燥，得到生物基稳定的石墨烯衍生物0.136g。

[0059] (4)生物基稳定的石墨烯衍生物(SB-GO)负载药物阿霉素盐酸盐(DOX)[0060] 称取100mg步骤(3)制备的SB-GO分散于30mL去离子水中，另外称取30mg阿霉素盐酸盐(DOX)溶于30mL去离子水中，并缓慢滴加到上述SB-GO分散液中，在室温条件下搅拌反应12h，得到的溶液产物放入截留分子量为8000～14000的透析袋中对去离子水透析一天，得到DOX@SB-GO复合物分散液。

[0061] 实施例3

[0062] (1)制备磺酸甜菜碱类三甲氧基型硅烷化试剂(记作SBS)

[0063] 将1g(8.19mmol)1'3-丙磺酸内酯溶于10mL无水丙酮中，在冰水浴、N2保护条件下，缓慢滴加1.685g(8.13mmol)N’N-二甲基-3-氨丙基-三甲氧基硅烷，滴完后搅拌反应6h，离心得到白色沉淀，用无水丙酮洗涤数次，真空干燥过夜，即可得到所述的磺酸甜菜碱类三甲氧基型硅烷化试剂2.14g。

[0064] (2)制备氧化石墨烯(记作GO)

[0065] 将1g(0.083mol)纳米石墨粉与20mL浓硫酸混合，搅拌过夜，冰水浴下加入4g(0.025mol)KMnO4，先于10℃维持25min，再缓慢升温至40℃维持30min，接着缓慢升温至90℃维持90min，然后加入46mL水，继续升温至104℃维持25min，最后加入140mL水和10mL 30％H2O2，离心，用5％盐酸洗涤多次，再用去离子水洗至上清液为中性，冻干即可得到氧化石墨烯0.73g。

[0066] (3)制备生物基稳定的石墨烯衍生物(记作SB-GO)

[0067] 称取100mg氧化石墨烯超声分散在30mL去离子水中，用0.2MNaOH溶液调节pH至9～10之间，得到氧化石墨烯水分散液。接着将步骤(1)制备的SBS 0.2g溶解在5mL去离子水中，并缓慢滴加到上述氧化石墨烯分散液中，滴完后于25℃下搅拌反应12h，得到的溶液产物放入截留分子量为8000～14000的透析袋中对去离子水透析一天，冷冻干燥，得到生物基稳定的石墨烯衍生物0.146g。

[0068] (4)生物基稳定的石墨烯衍生物(SB-GO)负载药物阿霉素盐酸盐(DOX)[0069] 称取100mg步骤(3)制备的SB-GO分散于30mL去离子水中，另外称取30mg阿霉素盐酸盐(DOX)溶于30mL去离子水中，并缓慢滴加到上述SB-GO分散液中，在室温条件下搅拌反应12h，得到的溶液产物放入截留分子量为8000～14000的透析袋中对去离子水透析一天，得到DOX@SB-GO复合物分散液。

[0070] 图8为DOX@SB-GO复合物及单纯阿霉素的荧光谱图，相对于单纯的阿霉素，DOX@SB-GO复合物的荧光下降了约59.3％。说明SB-GO对DOX有一定的淬灭作用，具有作为荧光探针的潜在可能。