烟草GCN2启动子、其表达载体及其应用

摘要

本发明涉及一种烟草GCN2启动子，其核苷酸序列为：（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或（2）与（1）限定的核苷酸序列中至少具有90%同源性的核苷酸序列。本发明还涉及烟草GCN2启动子在启动目的基因表达中的应用，以及应用方法。本发明启动子可以驱动GUS基因的表达，可以作为烟草生物反应器外源基因所用的表达元件；该序列位于GCN2上游，能启动GCN2表达，同时在序列上存在多个植物激素及胁迫位点，通过激素或胁迫处理调控GCN2表达，控制蛋白合成。本发明有助于促进人们对烟草应答胁迫机理的研究，在农业和医学领域具有广阔的应用空间和市场前景。

权利要求

1.一种烟草GCN2启动子，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体具有权利要求1所述的烟草GCN2启动子序列。

3.权利要求1所述烟草GCN2启动子在启动目的基因表达中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述目的基因为GUS基因。

说明书

烟草GCN2启动子、其表达载体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种烟草GCN2启动子、其表达载体及其应用。

背景技术

[0002] 21世纪以来，农作物的生长发育面临着诸多问题。首先，由于化肥的过量使用及工业废水的乱排放导致耕作土壤的板结、盐碱化及重金属过量；其次，由于除草剂过量使用及生物入侵，作物也不得不面对新的超级杂草；最后，由于大气环境污染及温室气体的排放，近些年厄尔尼诺现象日趋频繁，局部地区的干旱及内涝现象越来越多。因此，如何使作物在如此新的复杂的生存环境下生长发育变成了近些年研究的热点。在这种背景下，除了常规技术手段外，更多的研究人员将目光聚焦于参与调节应答各种胁迫的基因上。而启动子作为基因表达的“开关”，是调节基因表达的重要组成部分，也受到越来越多科学家的关注。

[0003] GCN2 (general control non-derepressible 2)作为eIF2的激酶，通过磷酸化eIF2的α亚基，来应答各种生物和非生物胁迫。在动物中存在四种eIF2α 激酶（PKR、PERK、HRI和GCN2）来分别应答不同的胁迫。在植物中，GCN2是由单个基因编码的，并且是唯一的eIF2α激酶。另外，序列分析表明高等植物中只存在一个GCN2类似的eIF2α激酶(Zhang等，2003；Lageix等，2008；Zhang等，2008；Hey等，2010) 这表明植物与动物不同，植物中仅存在一种eIF2α激酶，它在植物的生长发育中起到重要作用。

[0004] 目前研究发现植物中的GCN2能被多种植物信号物质激活，如MMS(甲磺酸甲酯)、MeJA（甲基茉莉酸酯）、ACC(1-氨基环丙烷-1羧酸)或SA（水杨酸）等处理植物后，并且磷酸化真核翻译起始因子eIF2α(Lageix等，2008；Zhang等，2008)；并且很多植物激素在植物免疫反应中起着重要作用的信号分子，尤其是水杨酸（SA）更是被称之为植物抗病激素。此外，研究发现植物中GCN2介导的eIF2α磷酸化可以被UV辐射、冷胁迫、嘌呤缺乏和损伤等胁迫所激活(Lageix等，2008；Zhang等，2008)，这说明GCN2对植物激素响应与应答胁迫之间有着密切关系。

[0005] 启动子是提供RNA聚合酶识别和结合的一段DNA序列和相关的调控元件，通常位于基因的上游，驱动基因转录，是调控基因表达的手段。而烟草GCN2启动子，在其基因序列上不仅有TATA-box(Goldberg-Hogness框或Hogness框)和起始因子(initiator)等核心元件，还发现了MeJA、ERE等应答元件。由于烟草是重要的模式植物及经济作物， 因此，烟草GCN2启动子的分离和鉴定对于烟草应答各种逆境胁迫研究以及烟草作为生物反应器表达外源基因具有重要的意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种可以启动GCN2基因的表达，其序列中存在的植物激素等响应元件可以用来调控GCN2基因表达的烟草GCN2启动子。

[0007] 为达到以上目的，本发明通过以下技术方案实现：

[0008] 设计一种烟草GCN2启动子，其核苷酸序列为：

[0009] （1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

[0010] （2）与（1）限定的核苷酸序列中至少具有90%同源性的核苷酸序列。

[0011] 本发明的第二个目的是提供一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体的启动子是核苷酸序列为SEQ ID NO.1的启动子，可以是外源目的基因在烟草中表达。

[0012] 上述烟草GCN2启动子可在启动目的基因表达中的应用，所述目的基因优选为GUS 基因。

[0013] 上述烟草GCN2启动子启动GUS 基因表达的方法，包括以下步骤：

[0014] （1）将上述烟草GCN2启动子插入pCAMBIA-NPT-GUS载体的中并且替换该载体中已有的35S启动子，得到重组质粒；

[0015] （2）将所得重组质粒导入出发植物并进行培育，在所述出发植物中由所述GCN2启动子启动所述重组质粒中的GUS基因表达。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为烟草，更优选为烟草K326。

[0016] 本发明进一步提供了一种在植物中表达外源基因的方法，采用上述重组表达载体，将外源目的基因导入该载体，转化植物，获得的转化植物可以表达外源基因。

[0017] 本发明启动子可以驱动目的基因在植物中表达，能够作为生物反应器的技术支撑。此外，本发明提供的启动子序列上包含多个激素和胁迫响应位点，有助于促进人们对烟草应答胁迫机理的研究，本发明在农业和医学领域具有广阔的应用空间和市场前景。

[0018] 本发明具有以下积极有益的技术效果：

[0019] 1.本发明分离了烟草GCN2基因的上游启动子序列，提供的启动子序列可驱动GUS基因在烟草中表达，能作为植物遗传转化表达外源基因及烟草生物反应器所用的表达元件。

[0020] 2. 本发明所提供的序列包含乙烯(ERE)和茉莉酸甲酯(MeJA)等植物激素响应位点，同时该序列位于烟草GCN2的上游，在烟草中可以启动GCN2基因的表达，其序列中存在的植物激素等响应元件可以用来调控GCN2基因的表达，进而调控烟草的蛋白合成。

附图说明

[0021] 图1：本发明烟草GCN2启动子的PCR扩增电泳图。

[0022] 图2: 本发明的重组表达载体pCAMBIA-NPT-GCN2-Pro11:GUS转化农杆菌后质粒提取电泳图。

[0023] 图3：本发明的重组表达载体pCAMBIA-NPT- GCN2-Pro11:GUS转化农杆菌后质粒PCR电泳图。

[0024] 图4：本发明重组表达载体pCAMBIA-NPT-GCN2-Pro11:GUS侵染烟草K326遗传转化效果；其中左上为阴性对照，右上为阳性对照，左下为转GCN2启动子阳性分化苗，右下为烟草GCN2启动子阳性分化苗的生根图。

[0025] 图5：本发明烟草GCN2启动子转化烟草叶片的GUS染色效果。 其中左图阴性对照为未转基因的烟草K326染色图；中图阳性对照为含有35S启动子的pCAMBIA-NPT-GUS转基因烟草染色图；右图为pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Pro11:GUS转化烟草后染色图。

具体实施方式

[0026] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0027] 实施例1烟草GCN2启动子基因的分离，包括以下步骤：

[0028] （1）烟草基因组DNA的制备

[0029] 取种植于温室两个月的烟草，取其嫩叶，采用CTAB 法提取基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后于-20℃下进行保存。

[0030] （2） NtGCN2启动子的克隆和序列分析

[0031] 以烟草基因组DNA为模板，根据设计的如下引物进行PCR扩增。上游引物为GCN2-Pro11-F：CACACACCCCTATCCATCGC；

[0032] 下游引物为GCN2-Pro11-R：AAAAAATACACTGGAAGCTGGCC。PCR反应条件为：94℃预变性4 min，94℃变性4 min，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，共28个循环，4℃保存。

[0033] 将PCR产物连接到pCAMBIA-NPT-GUS载体，克隆并进行质粒PCR 检测（质粒命名为pCAMBIA-NPT-GCN2-Pro11:GUS），并测序获得长度为1184 bp的GCN2启动子，其序列为SEQ ID NO：1。然后使用PLACE软件（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）对启动子序列中的顺式作用元件进行预测分析，发现该启动子含有真核生物启动子的基本保守元件TATA-box 和CAAT-box，还含有损伤诱导、MeJA和ERE等植物激素响应元件。

[0034] 实施例2 植物表达载体的构建，包括以下步骤：

[0035] 将pCAMBIA-NPT-GUS载体用EcoRI/HindIII酶切后，回收大片段待用。

[0036] 将实施例1中的GCN2-Pro的PCR产物进行纯化和回收，将该目的片段连接至酶切后的pCAMBIA-NPT-GUS载体中。在10 μl体系中，把目的片段与载体片段用ClonExpressTMⅡ酶进行重组反应，采用PCR方法确定阳性重组子，见图1。从而使本发明的启动子与GUS基因融合，得到表达GUS基因的植物重组表达载体pCAMBIA-NPT- GCN2-Pro11:GUS。

[0037] 实施例3 烟草启动子活性的鉴定，包括以下步骤：

[0038] （1）农杆菌介导的植物转化

[0039] 通过热激转化法，将在实施例2中构建的表达GUS基因的植物重组表达载体pCAMBIA-NPT-GCN2-Pro11:GUS转化到农杆菌中EHA105中，提取质粒并进行PCR鉴定，见图3，确定质粒转入到了农杆菌中。

[0040] 取烟草种子，利用酒精和次氯酸钠消毒后播种到发苗培养基上，等苗子长到0.5 cm左右转到移苗培养基上。待叶片长至5-8片叶的时候，选取绿色叶片，进行上述的转入了pCAMBIA-NPT-GUS的农杆菌侵染，具体就是将28℃ 培养的农杆菌，OD600=0.8，加入20 mg/L 的AS（乙酰丁香酮），利用叶盘转化法转化烟草，并通过选择培养基进行筛选。

[0041] （2）转基因植株Gus 表达活性分析

[0042] GUS 缓冲液：由溶剂和溶质组成；溶剂为pH7.0、50 mmol/L 磷酸氢钠缓冲液；溶质及其浓度：10 mmol/L EDTA、0.1%(体积比)Triton X-100、2 mmol/L 铁氢化钾和2 mmol/L 亚铁氢化钾；4° C 下保存备用。GUS 染色液：用N，N- 二甲基甲酰胺溶解X-Gluc 粉剂，配成20mmol/L 的溶液，于-20° C 下保存备用。

[0043] 取转基因烟草T0代叶片进行GUS组织化学染色。待转基因烟草植株长至6片左右的叶片时，取一片叶进行GUS组织化学检测，见图4。

[0044] 图5结果表明，GUS活性强的显示出很深的蓝色，无蓝色表示GUS活性较低。其中阴性对照未染出颜色，阳性对照染出蓝色表明GUS染液能够正常染色，而右图染出蓝色表明烟草GCN2启动子能够驱动GUS基因表达，进而使其在GUS染液中呈现蓝色。