控制水稻雄性育性的蛋白及其编码基因和应用

摘要

本发明公布了一种控制水稻雄性育性的蛋白及其编码基因和应用。所述蛋白具有序列表中SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，其编码基因的基因组DNA序列和cDNA序列分别如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明通过定点突变和功能验证证明该基因具有控制水稻雄性育性的功能，在野生型水稻中突变该基因，可获得雄性不育水稻品系，在水稻育种中具有重要的应用价值。

权利要求

1.水稻OsMPL蛋白或其编码基因在控制水稻雄性育性中的应用，其特征在于，所述OsMPL蛋白的序列为序列表中的SEQ ID NO：3氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，水稻OsMPL蛋白的编码基因的序列是其基因组DNA序列或cDNA序列。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水稻OsMPL蛋白的编码基因的序列如序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，敲除或改变所述编码基因的核苷酸序列，使之不能表达所述OsMPL蛋白或表达水平降低，或者使表达的氨基酸序列发生缺失或变异，进而使得该氨基酸序列对应的多肽丧失活性，导致水稻雄性不育。

5.一种创制水稻雄性不育株系的方法，包括：敲除目的水稻的OsMPL基因，或使目的水稻的OsMPL基因突变导致表达的蛋白失活，或者抑制目的水稻中OsMPL基因的表达，得到水稻雄性不育株系；其中所述目的水稻为携带OsMPL基因的水稻，所述OsMPL基因编码序列表中的SEQ ID NO：3氨基酸序列所示的蛋白质。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述OsMPL基因的序列如序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9系统、TALEN系统、锌指酶系统、RNA干扰或人工小RNA技术实现OsMPL基因的敲除或突变。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将靶标OsMPL基因的CRISPR/Cas9载体导入植物细胞、组织或器官，使OsMPL基因发生突变，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到雄性不育的转基因株系。

9.一种水稻育种方法，以权利要求5创制的水稻雄性不育株系作为母本进行杂交育种。

说明书

控制水稻雄性育性的蛋白及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种控制水稻雄性育性的基因及该基因的用途。

背景技术

[0002] 水稻(Oryza sativa L.)是最重要的粮食作物之一。全世界一半左右的人口以水稻作为主食，尤其是人口总数超过世界总人口数60％的亚洲各国。提高水稻的产量是全世界水稻育种家的长期目标。

[0003] 目前水稻育种有两种主要途径。一种是通过杂交和回交等手段，选育高产稳产的常规稻品种。常规稻无需杂交制种，方便省力；一般地，常规稻的米质好于常见的杂交稻。但是常规稻自留种连年种植经常会产生品种混杂衰退，影响水稻产量。而杂交稻是另外一种水稻育种的成功方法。杂交水稻是指用两个遗传背景不同的水稻亲本，经过杂交得到的F1代的种子，将F1代种子直接提供给农民种植。F1代具有明显的杂种优势，田间种植后表现出高产、优质和多抗等优良性状。

[0004] 目前常用的杂交水稻系统有三系杂交稻和两系杂交稻两种。三系杂交稻包括不育系、保持系和恢复系三系。雄性不育系的雄性器官发育不正常，不能自交结实，雌性器官却发育正常能接受外来花粉而受精结实。雄性不育系接受恢复系的花粉授给后，结实正常，而且新产生的杂种一代育性恢复正常，能自交结实，并具有较强的优势。不育系自交不结实，需要通过保持系为其授粉结实，而后代仍保持雄性的不育特性。目前，三系杂交水稻种的不育系均为细胞质雄性不育系，其中野败型、红莲型和包台型是国际公认的3种细胞质雄性不育水稻主要类型。

[0005] 两系杂交水稻中，不育系通常为光温敏不育系。在某些光温等外界条件下，不育系的育性得到恢复，可以收获自交种子，用于下年的制种，因而不再需要额外的保持系。三系杂交稻的不育系一般选自细胞质雄性不育株系，而光温敏不育系一般为核基因控制育性。

[0006] 杂交水稻已经在生产广泛应用。经过多年的努力，科学们在水稻细胞质雄性不育的调控机制方面已经取得较多进展，同时也克隆了数十个调控雄性不育的核基因。已经鉴定出的调控水稻雄性不育的核基因主要作用于水稻雄蕊发育的中后期，影响了包括减数分裂的进程、绒毡层的发育和降解、花粉外壁的沉积、花粉囊的开裂和药室内的氧化还原状态等在内的多个过程。尽管已取得上述研究进展，但控制水稻育性的分子机理仍然不很清楚，尤其是调控水稻早期雄蕊发育的基因，更是鲜有报道。

[0007] 现有的研究证明，利用转基因技术结合新近开发的植物基因组编辑技术，将有助于揭示控制重要农业性状的基因功能，从而有助于更加快速地挖掘潜在的可能用于育种实践的基因，高效地培育出具有实际生产应用价值的优良水稻新品种。但现有的成果还极少能够直接投入到生产应用中，更多的参与调控水稻雄性不育的基因还有待发现。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种控制水稻雄性育性的蛋白及其编码基因，用于阐明水稻雄性不育的调控机制，为杂交水稻的培育提供潜在的育种资源。

[0009] 本发明通过遗传研究发现了一个调控水稻雄蕊早期发育的蛋白，当该编码基因敲除后，可使水稻的雄蕊发育异常，并且完全不能产生花粉，最终导致雄性不育。

[0010] 本发明所提供的控制水稻雄性育性的蛋白，命名为OsMPL，来源于水稻(Oryza sativa)品种日本晴，具有下述氨基酸序列之一：

[0011] 1)序列表中的SEQ ID NO：3；

[0012] 2)序列表中的SEQ ID NO：3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的具有同等功能的氨基酸序列。

[0013] 序列表中的SEQ ID NO：3由349个氨基酸残基组成。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加的方法均是本领域技术人员所熟知的，通常是利用基因工程的手段对其编码基因进行突变，然后再表达出相应的蛋白。通过在植物中表达所述蛋白，并测试这些植物的花药和花粉的发育情况，可以判断发生这些变化后的蛋白是否还具有控制水稻雄性育性的功能。

[0014] 本发明提供的控制水稻雄性育性的蛋白OsMPL的表达量和/或活性会影响花药和花粉的发育，从而可调控水稻的雄性育性。

[0015] 编码上述控制水稻育性蛋白的编码基因OsMPL可以是所述基因的cDNA序列，也可以是所述基因的基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQ ID NO：1所示的基因组DNA序列和SEQ ID NO：2所示的cDNA序列。

[0016] 敲除或改变所述编码基因的核苷酸序列，使之不能表达所述控制水稻育性的蛋白或降低表达水平，或者使表达的氨基酸序列发生缺失或变异，进而使得该氨基酸序列对应的多肽丧失活性，可导致花粉和花药发育异常。

[0017] 本发明所提供的控制水稻雄性育性的蛋白或其编码基因的用途，包括但不限于下述几个方面：

[0018] 1)控制水稻雄性器官的育性；

[0019] 2)作为水稻雄性育性的分子标记；

[0020] 3)创制水稻雄性不育株系；

[0021] 4)创造新的杂种优势利用途径，培育新品种。

[0022] 本发明创制水稻雄性不育株系的方法，包括：敲除目的水稻的OsMPL基因，或使目的水稻的该基因突变导致表达的蛋白失活，或者抑制目的水稻中OsMPL基因的表达，得到水稻雄性不育株系；其中所述目的水稻为携带OsMPL基因的水稻。

[0023] 采用常规的基因工程方法即可实现OsMPL基因的敲除或突变，以及抑制或降低的OsMPL基因的表达。可以通过任意已知的基因定点突变或干扰系统来实现，例如CRISPR/Cas9系统、TALEN系统、锌指酶系统、RNA干扰和人工小RNA技术(artificialmicroRNA)等技术手段。

[0024] 在本发明的一些实施例中，将靶标OsMPL基因的CRISPR/Cas9载体导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到雄性不育的转基因植物。

[0025] 能够在水稻基因组上对所述OsMPL基因进行定点突变的表达载体、表达盒、转基因细胞系及宿主菌也属于本发明的保护范围。

[0026] 本发明定点突变水稻基因OsMPL或其同源序列的元件可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官。用于构建所述植物表达载体的载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，还可为可在原核生物中复制的载体，如pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

[0027] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(潮霉素磷酸转移酶基因、羧苄青霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

[0028] 携带有突变本发明控制雄性育性的水稻基因OsMPL的植物表达载体可通过使用原2+
生质体-化学介导法(Ca 、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

[0029] 此外，通过突变本发明控制雄性育性的水稻基因OsMPL的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的突变植株。

[0030] 本发明获得的水稻雄性不育株系可以作为母本进行杂交育种。采用常规遗传手段将所述OsMPL基因转入该水稻雄性不育株系的细胞或组织中，再生，可以培育成恢复雄性育性的植株。

[0031] 本发明发现了水稻中调控其雄性育性的蛋白及其编码基因OsMPL，突变该基因获得雄性不育的表型。因此，本发明涉及的OsMPL基因在植物杂交育种中具有潜在的应用价值。

附图说明

[0032] 图1显示了实施例3中通过CRISPR/Cas9系统定点突变OsMPL基因的序列变化情况，与野生型相比，在两个目标位点的代表性的株系中，目标位点处均存在1个碱基的不同插入，造成翻译移码。

[0033] 图2显示了实施例3中野生型(左)和Osmpl-1功能缺失突变体(右)外观的表型，Osmpl-1表现为不能结种子，但其他器官与野生型对照比没有明显差异。比例尺＝10厘米。

[0034] 图3显示了实施例3中Osmpl-1和Osmpl-2功能缺失突变体的花药表型。其中，A为扫描电镜照片：左侧为野生型，中间为Osmpl-1突变体，右侧为Osmpl-2突变体；B为I2-KI染色后显微照片：左侧为野生型，中间为Osmpl-1突变体；右侧为Osmpl-2突变体。比例尺＝100微米。

具体实施方式

[0035] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell,David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

[0036] 实施例1、OsMPL基因的定点突变

[0037] (一)构建OsMPL定点突变的入门载体：

[0038] 根据序列特异性选择两对能够靶标OsMPL基因的特异性spacer序列，合成如下两对引物：

[0039] F1：5’-GGCAAGCAAGAGGGCGCCGCAGCG-3’(SEQ ID NO：4)；

[0040] R1：5’-AAACCGCTGCGGCGCCCTCTTGCT-3’(SEQ ID NO：5)；

[0041] F2：5’-GGCACGGCGTTGAGGTCGCGGAAC-3’(SEQ ID NO：6)；

[0042] R2：5’-AAACGTTCCGCGACCTCAACGCCG-3’(SEQ ID NO：7)。

[0043] 分别将两对引物退火后，连入经过BsaI酶切后的pOs-sgRNA质粒(Miao et al.,2013，Cell Research 23(10):1233-1236.)中。筛选spacer插入方向正确的载体(使用R1和M13R测序引物能够扩增出目标条带)并测序，测序正确的质粒命名为pOs-sgRNA-MPL-1和pOs-sgRNA-MPL-2用于构建OsMPL定点突变终载体。

[0044] (二)OsMPL定点突变终载体的构建：

[0045] 为了构建OsMPL定点突变终载体，首先将pOs-sgRNA-MPL-1和pOs-sgRNA-MPL-2载体与pH-Ubi-cas9-7载体(Miao et al.,2013，Cell Research 23(10):1233-1236.)进行LR反应(Invitrogen公司)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行PCR筛选阳性克隆，提取含有能够靶标OsMPL基因的元件的质粒，测序验证正确后用于水稻的愈伤转化。

[0046] 实施例2、定点突变OsMPL基因的转基因水稻的获得：

[0047] (一)水稻愈伤诱导：

[0048] 选取饱满的日本晴水稻种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀的点入在带有2毫克/升2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的灭菌MS固体培养基，32℃持续光照5天诱导愈伤形成。

[0049] (二)农杆菌转化：

[0050] 将OsMPL定点突变终载体的质粒用电激法转化农杆菌EHA105感受态细胞，涂布带有50微克/升壮观霉素和50微克/升利福平的固体LB培养基，28℃黑暗培养2天后，用基因特异引物U1和C1筛选阳性克隆。得到的阳性克隆在含50微克/升壮观霉素和50微克/升利福平的液体培养基中28℃培养至OD600＝0.8，用于水稻转化。

[0051] U1：5’-GCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCG-3’(SEQ ID NO：8)；

[0052] C1：5’-AGTTGGGCGATCAGATTCTC-3’(SEQ ID NO：9)。

[0053] (三)水稻愈伤转化：

[0054] 选取生长状况良好的愈伤组织，在菌液中浸泡2分钟，之后在无菌滤纸上晾干，再将愈伤组织移至含有100微摩尔/升乙酰丁香酮的NB共培养培养基，25℃黑暗下共培养3天。

[0055] (四)筛选水稻愈伤：

[0056] 共培养3天后，用无菌水洗涤愈伤5次，再用200毫升的含有500毫克/升羧苄青霉素钠的无菌水洗一遍，小心倒去液体，用无菌镊子将愈伤组织夹取至无菌滤纸上，晾干后转移至NB筛选培养基上(含有2毫克/升的2,4-D、50毫克/升的潮霉素和400毫克/升的羧苄青霉素钠)，32℃持续光照2周。

[0057] (五)阳性愈伤的分化：

[0058] 选取生长良好呈嫩黄色的阳性愈伤组织，用无菌镊子移至NB预分化培养基(含有1毫克/升萘乙酸(NAA)、5毫克/升脱落酸(ABA)、2毫克/升激动素(kinetin)、25毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧苄青霉素钠)，32℃持续光照培养。2周后挑选生长旺盛的愈伤组织转入MS分化培养基(含有0.02毫克/升NAA、2毫克/升kinetin、50毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧苄青霉素钠)，32℃持续光照培养。待分化出来的幼苗长至2至5毫米，转入不含激素和抗生素的MS培养基培养2到3周，之后移入土中置于温室中生长(温度28-30℃，16小时光照/8小时黑暗)。

[0059] 实施例3、OsMPL功能缺失突变体的分子鉴定和表型鉴定

[0060] (一)转基因水稻中OsMPL基因的定点突变：

[0061] 剪取转基因水稻幼苗的叶片，用植物总DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取植物总DNA。根据OsMPL基因的基因座DNA序列设计基因特异性引物MPL-F和MPL-R进行PCR反应，扩增含有OsMPL目标突变位点的片段，并测序检查OsMPL基因的突变情况：

[0062] MPL-F：5'-GGAGACAGCCTCCCTTCGAGTACACTA-3'(SEQ ID NO：10)；

[0063] MPL-R：5'-GGCAGGAGGAGGAGGAAGAAGAAGA-3'(SEQ ID NO：11)。

[0064] 测序检测OsMPL基因的突变情况，发现在目标位点处检测到一个碱基的不同插入的两类该基因的突变体，分别命名为Osmpl-1和Osmpl-2，如图1所示。Osmpl-1和Osmpl-2除了不结种子，外观与野生型的水稻没有明显差异，如图2所示。

[0065] (二)OsMPL定点突变转基因水稻花药表型的观察：

[0066] 本研究采用扫描电镜观察花药外观，并拍照记录；用I2-KI染色观察花粉囊内部的划分情况；并对OsMPL功能缺失突变体授以野生型水稻的花粉，观察突变体子房是否发育正常。如图3所示，扫描电镜分析表明Osmpl-1和Osmpl-2功能缺失突变体花药外观都扭曲，与野生型的很不相同(见图3中A)。I2-KI染色后显微镜观察表明Osmpl-1和Osmpl-2功能缺失突变体花药的内部不含花粉粒，而野生型的花药中充满可被I2-KI染色的成熟花粉粒(见图3中B)。当授以野生型花粉时，Osmpl-1和Osmpl-2突变体都可以正常结实，说明OsMPL的功能缺失导致水稻雄性不育，而雌蕊发育正常，说明敲除OsMPL可导致水稻雄性不育。