一种高粘度微分子量葡聚糖的生产方法

摘要

本发明公开了一种高粘度微分子量葡聚糖的生产方法，该方法是利用假肠膜明串珠菌以葡二糖为底物，在碱性范围内发酵生产得到高粘度微分子量葡聚糖。所述假肠膜明串珠菌为假肠膜明串珠菌G123，保藏编号为CCTCC NO:M2014115。所述葡二糖为麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、曲二糖或龙胆二糖中的至少一种。所述碱性范围为pH7.0～8.0。所述高粘度微分子量葡聚糖的粘度不低于5800cP、分子量在1000～2500Da之间。本发明生产的微分子量葡聚糖粘度高，是一种优良的微生物代谢胶，具有广泛的应用前景，本发明方法反应条件温和、耗能少、得率高、适用于实现工业规模化生产。

权利要求

1.一种高粘度微分子量葡聚糖的生产方法，其特征在于，该方法是利用假肠膜明串珠菌以葡二糖为底物，在碱性范围内发酵生产得到高粘度微分子量葡聚糖；所述假肠膜明串珠菌为假肠膜明串珠菌G123，保藏编号为CCTCC NO: M2014115；所述葡二糖为麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、曲二糖或龙胆二糖中的至少一种；所述高粘度微分子量葡聚糖的粘度不低于

5800cP、分子量在1000～2500Da之间。

2.根据权利要求1所述的高粘度微分子量葡聚糖的生产方法，其特征在于，所述碱性范围为pH7.0～8.0。

3.根据权利要求1所述的高粘度微分子量葡聚糖的生产方法，其特征在于，所述假肠膜明串珠菌通过种子培养步骤后接入发酵培养基中进行发酵培养，包括如下步骤：

1）一级种子培养：取甘油保存管中的假肠膜明串珠菌菌液接种于种子培养基中，30℃，

150rpm培养12～14h；

2）二级种子培养：以2%的接种量从一级种子液转接至种子培养基中，30℃，150rpm，培养10～12h；

3）发酵培养：将二级种子液以8%的接种量接种至发酵培养基中，调节初始pH7.5～8.0，以20%(wt)NaOH控制发酵过程中pH不低于7.0，发酵全程通空气，控制空气流量为0.5L/min，加入0.3%消泡剂，30℃，250～300 rpm，培养18～24h。

4.根据权利要求3所述的高粘度微分子量葡聚糖的生产方法，其特征在于，所述种子培养基为：蛋白胨5.0g/L、酵母粉5.0g/L、乙酸钠5.0g/L、吐温-80 1ml/L、C6H5O7(NH4)3 2.0g/L、K2HPO4.7H2O 2.0g/L、烟酸1.0g/L、MgSO4.7H2O 0.2g/L、MnSO4.H2O 0.05g/L、CaCl20.02g/L、FeCl2 0.01g/L、NaCl 0.01g/L、40g/L浓度葡二糖溶液单独灭菌补加。

5.根据权利要求3所述的高粘度微分子量葡聚糖的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基为：蛋白胨5.0g/L、酵母粉5.0g/L、乙酸钠5.0g/L、吐温-80 1ml/L、C6H5O7(NH4)3 2.0g/L、K2HPO4.7H2O 2.0g/L、烟酸1.0g/L、MgSO4.7H2O 0.2g/L、MnSO4.H2O 0.05g/L、Cacl20.02g/L、Fecl2 0.01g/L、NaCl 0.01g/L、Glu 0.35g/L、Val 0.115g/L、90～120g/L葡二糖溶液单独灭菌补加。

6.根据权利要求1所述的高粘度微分子量葡聚糖的生产方法，其特征在于，所述葡二糖为麦芽糖或纤维二糖。

7.根据权利要求2所述的高粘度微分子量葡聚糖的生产方法，其特征在于，所述碱性范围为pH7.0～7.5。

说明书

一种高粘度微分子量葡聚糖的生产方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一株假肠膜明串珠菌产高粘度微分子量葡聚糖的生产方法。

背景技术

[0002] 微生物多糖主要是由细菌、真菌和蓝藻等产生，是一类对微生物有保护作用的生物高聚物，相比于植物多糖，具有更多的生物活性和生理功能。更重要的是，这些微生物多糖无法通过化学合成来仿制。

[0003] 葡聚糖（glucan）是由明串珠菌合成的微生物同型胞外多糖，属于右旋吡喃葡萄糖聚合体，其相邻葡萄糖残基的碳1、2、3、4、6的半缩醛氧之间以葡糖苷键连接构成骨架，其主链主要是由α-1,6-键连接组成（占总化学键的50%～97%，在α-D-葡聚糖糖苷键中，也有α-1,2、α-1,3、α-1,4连接的支链，目前国外已利用Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F以蔗糖为底物进行工业化生产。

[0004] 根据葡聚糖相对分子量大小分布的不同，一般将葡聚糖分为以下几种类型：

[0005] （1）分子量为90KDa以上的，划分为高分子量葡聚糖；（2）分子量为50～90KDa的，划分为中分子量葡聚糖；（3）分子量为25～50KDa的，划分为低分子量葡聚糖；（4）分子量为10～25KDa的，划分为小分子量葡聚糖，；（5）分子量在10KDa以下的，划分为微分子量葡聚糖。各种不同分子量的葡聚糖可广泛应用于食品、医药、制药、化妆品和化工等领域，具有极大的商业价值。在食品领域，葡聚糖在奶制品的生产中可用作稳定剂、增稠剂和赋形剂来赋予其产品的某些特性;在医药领域，葡聚糖具有很好的改善血液粘度和其微循环的功效，随着它分子量的减小，其改善微循环的效果也越好，微分子量的右旋糖酐在该方面的应用前景巨大;在化妆品行业，葡聚糖及其衍生物常用作保湿剂和增稠剂，能使头发和皮肤表面形成一层护水性薄膜。

[0006] 与此同时，作为一类具有安全、优良理化特性的微生物代谢胶，葡聚糖可作为乳化剂、悬浮剂、凝胶剂、成膜剂、润滑剂等广泛应用于食品、石油、化工、制药等领域中，和普通不具备高粘度的葡聚糖相比，高粘度的葡聚糖因其优良的成胶性能在生物合成胶的应用方面更具优势，目前开发并投入规模生产的具有商品价值的生物胶还有黄原胶、结冷胶、凝胶多糖、普鲁兰等。所以葡聚糖是一类应用广泛，具有很大商业价值的微生物多糖。

[0007] 目前，葡聚糖的制备方法主要有发酵法和酶法，而酶法生产葡聚糖在工业上实现大规模应用还有很多的困难，需要进一步研究，工业上生产葡聚糖的方法主要是微生物发酵法，但发酵法直接得到的葡聚糖分子量普遍太大，需要提纯后进一步在酶或者酸的条件下降解成较小分子量的葡聚糖，最后用乙醇进行分级提取特定分子量的产品，在以上过程中，将会损失一部分很小分子量的葡聚糖，因此实际生产过程中的葡聚糖产率只有蔗糖质量的20%～30%。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种高粘度微分子量葡聚糖的生产方法，该方法是利用一株假肠膜明串珠菌发酵，通过发酵条件的控制，直接发酵得到微分子量葡聚糖，得到的微分子量葡聚糖具有分子量小但粘度高的特性，是一种性能优良的微生物代谢胶。

[0009] 为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

[0010] 本发明利用假肠膜明串珠菌G123，保藏编号为CCTCC NO: M2014115以麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、曲二糖、龙胆二糖等葡二糖为底物，将发酵pH调控在7.0～7.5的微碱性范围内，可生产得到高粘度微分子量的葡聚糖，所得高粘度微分子量葡聚糖的粘度不低于5800cP，分子量在1000～2500Da之间。优选地，微分子量葡聚糖的粘度不低于6200cP，进一步优选地，微分子量葡聚糖的粘度不低于6600cP。

[0011] 所述假肠膜明串珠菌通过种子培养步骤后接入发酵培养基中进行发酵培养，包括如下步骤：

[0012] 1）一级种子培养：取甘油保存管中的假肠膜明串珠菌菌液接种于种子培养基中，30℃，150rpm培养12～14h；

[0013] 2）二级种子培养：以2%的接种量从一级种子液转接至种子培养基中，30℃，150rpm，培养10～12h；

[0014] 3）发酵培养：将二级种子液以8%的接种量接种至发酵培养基中，调节初始pH7.5～8.0，以20%(wt)NaOH控制发酵过程中pH不低于7.0，发酵全程通空气，控制空气流量为0.5L/min，加入0.3%消泡剂，30℃，250～300 rpm，培养18～24h。

[0015] 所述种子培养基为：蛋白胨5.0g/L、酵母粉5.0g/L、乙酸钠5.0g/L、吐温-80 1ml/L、C6H5O7(NH4)3 2.0g/L、K2HPO4.7H2O 2.0g/L、烟酸1.0g/L、MgSO4.7H2O 0.2g/L、MnSO4.H2O 0.05g/L、CaCl20.02g/L、FeCl2 0.01g/L、NaCl 0.01g/L、40g/L浓度葡二糖溶液单独灭菌补加。

[0016] 所述发酵培养基为：蛋白胨5.0g/L、酵母粉5.0g/L、乙酸钠5.0g/L、吐温-80 1ml/L、C6H5O7(NH4)3 2.0g/L、K2HPO4.7H2O 2.0g/L、烟酸1.0g/L、MgSO4.7H2O 0.2g/L、MnSO4.H2O 0.05g/L、Cacl20.02g/L、Fecl2 0.01g/L、NaCl 0.01g/L、Glu 0.35g/L、Val 0.115g/L、90～
120g/L葡二糖溶液单独灭菌补加。

[0017] 所述葡二糖为麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、曲二糖或龙胆二糖等中的至少一种，以麦芽糖和纤维二糖为底物产生的葡聚糖溶液粘度比以海藻糖、曲二糖、龙胆二糖为底物的粘度高，以麦芽糖为底物时，葡聚糖溶液粘度达6950cP，以纤维二糖为底物时，葡聚糖溶液粘度达6695 cP，以海藻糖、曲二糖、龙胆二糖为底物时，葡聚糖溶液粘度均在5800～6200 cP范围内，为生产得到高粘度葡聚糖，较佳的底物选择为麦芽糖或纤维二糖。

[0018] 所述发酵时控制碱性范围为pH7.0～8.0，优选控制在7.0 7.5，假肠膜明串珠菌~G123以麦芽糖或纤维二糖为底物在pH7.0～7.5的微碱性环境中产生1000～2500Da微分子量葡聚糖，在pH6.5～7.0的环境中产生10000～12000Da小分子量葡聚糖，在pH7.5～8.0的环境中也产生微分子量葡聚糖，但菌种在此范围中对底物利用率较低，优选的pH范围为7.0～7.5，根据发酵液粘度控制转速为250rpm，发酵催化时长为18h。

[0019] 本发明发酵液中葡聚糖采用如下方法分离提取并测定粘度：

[0020] 取发酵液离心留上清，加入氯仿和正丁醇试剂，混合均匀后经剧烈震荡、离心去除可溶性蛋白，经抽滤提取出水层并向其中加入一定体积的冰乙醇离心得白色沉淀，将白色沉淀复溶于纯水中再加入一定体积的冰乙醇静置一定时间，离心后重复操作一次得到白色沉淀即为葡聚糖样品，在常温下加入与发酵液等体积的去离子水溶解葡聚糖样品得到葡聚糖溶液，溶液粘度测定采用SNB-1A型数显粘度计测定，选用29号转子，转速设定为10r/min。

[0021] 本发明发酵液中葡聚糖采用如下方法分离提取并测定分子量：

[0022] 取发酵液离心留上清，加入氯仿和正丁醇试剂，混合均匀后经剧烈震荡、离心去除可溶性蛋白，经抽滤提取出水层并向其中加入一定体积的冰乙醇，离心得白色沉淀，将白色沉淀复溶于纯水中再加入一定体积的冰乙醇静置一定时间，离心后重复操作一次得到的白色沉淀即为葡聚糖产品。采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪测定葡聚糖的分子量分布。其中：发酵液上清和氯仿及正丁醇的优选体积比为5：1，加入冰乙醇的优选体积为水层体积的2倍，待测样品和DMSO的优选质量体积比为1/15（g/ml）。

[0023] 进一步地，本发明的一个实施例中假肠膜明串珠菌G123以麦芽糖为底物，控制发酵pH在7.0～7.5的微碱性范围内，可获得粘度为6950cP、分子量为1000～2500Da的高粘度微分子量葡聚糖，且单批发酵得葡聚糖含量39.98g/L，生产强度达3.6345 g/L/h。

[0024] 有益效果：本发明所述生产的高粘度微分子量葡聚糖通过菌株发酵直接获得，不需要提纯后进一步在酶或者酸的条件下降解成小分子量的葡聚糖，在生产过程中底物利用率高，葡聚糖收率可达麦芽糖质量的35%左右，且该葡聚糖溶液粘度高，具备较高的成胶性能，若用作凝胶剂，该葡聚糖浓度在0.05%～0.3%就能形成胶体，节约了在食品中的添加量，是一种性能优良的微生物代谢胶，具有广泛的应用前景，本发明所述的方法简单快捷、反应条件温和、耗能少、得率高、适用于实现工业规模化生产，为高粘度微分子量葡聚糖的生产提供了借鉴与思路，且进一步促进了高粘度微分子量葡聚糖的应用研究与发展。

附图说明

[0025] 图1：假肠膜明串珠菌G123发酵结果，其中发酵条件为：以初始pH 7.5，发酵全程控制pH不低于7.0，初麦芽糖110g/L，30℃的3L发酵罐。

[0026] 图2：基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪测定葡聚糖分子量分布。

[0027] 图3：核磁共振检测葡聚糖糖苷键类型,a)核磁共振碳谱图；b)核磁共振氢谱图。

具体实施方式

[0028] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。

[0029] 本发明使用的假肠膜明串珠菌（Leuconostocpseudomesenteroides）菌株：由本实验室在中国专利局或国际专利组织承认的中国典型培养物保藏中心进行了专利程序保藏，该菌株的保藏编号为：CCTCC NO:M2014115。

[0030] 以下实施例中发酵液中葡聚糖采用如下方法提取并测定粘度：

[0031] 在发酵结束时，离心，取所得的发酵液离心上清，加入氯仿和正丁醇试剂，其中发酵液离心上清：氯仿：正丁醇=25:5:1，混合均匀后经剧烈震荡、离心去除可溶性蛋白，经抽滤提取出水层并向其中加入2倍体积的冰乙醇离心得白色沉淀，将白色沉淀复溶于纯水中再加入2倍体积的冰乙醇静置20～30min，控制加入冰乙醇终浓度为65%，离心后重复操作一次得到白色沉淀即为葡聚糖样品，在常温下加入与发酵液等体积的去离子水溶解葡聚糖样品得到葡聚糖溶液，溶液粘度测定采用SNB-1A型数显粘度计测定，选用29号转子，转速设定为10r/min。

[0032] 以下实施例中发酵液中葡聚糖采用如下方法分离提取并测定分子量：

[0033] 在发酵结束时，离心，取所得的发酵液离心上清，加入氯仿和正丁醇试剂，其中发酵液离心上清：氯仿：正丁醇=25:5:1，混合均匀后经剧烈震荡、离心去除可溶性蛋白，经抽滤提取出水层并向其中加入2倍体积的冰乙醇离心得白色沉淀，将白色沉淀复溶于纯水中再加入2倍体积的冰乙醇静置20～30min，控制加入冰乙醇终浓度为65%，离心后重复操作一次得到的白色沉淀即为葡聚糖产品。取少量的葡聚糖产品溶于DMSO有机试剂中作为待测样品，控制待测样品和DMSO的质量体积比为1/10～1/20（g/ml），将待测样品点在样品盘上，静置30min待样品风干后在样品表面覆盖一层DHB作为基质保护待测样品，用除湿机干燥样品后将样品盘放入基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪中，检测待测样品到达检测器的飞行时间而测定葡聚糖的分子量分布。

[0034] 实施例1

[0035] 假肠膜明串珠菌G123以麦芽糖为底物发酵产高粘度微分子量葡聚糖的方法，包括如下步骤：

[0036] （1）种子液培养：

[0037] 一级种子培养：取1mL甘油保存管中的假肠膜明串珠菌G123菌液接种于装液量为5mL的试管中，30℃，150rpm培养12～14h；

[0038] 二级种子培养：以2%（V/V）的接种量从一级种子液转接至装液量为100mL的500mL三角瓶中，30℃，150 rpm，培养10～12h；

[0039] （2）发酵罐培养：

[0040] 将（1）中的二级种子液以8%（V/V）的接种量接种至3L发酵罐中，装液量为2L，初始麦芽糖浓度为110g/L，调节初始pH7.5，以20%NaOH控制发酵过程中pH不低于7.0，发酵全程通空气，控制空气流量为0.5L/min，加入0.3%消泡剂，30℃，250～300 rpm，培养18～24h。在发酵初期每间隔30min取样一次并测定菌体OD值及发酵液pH，发酵5h以后，每间隔1h取样一次直至发酵结束。后期通过HPLC检测各时间段发酵液中的麦芽糖含量，通过恒重法检测各时间段发酵液中葡聚糖的含量。

[0041] 其中，所述的种子培养基的配方为：蛋白胨5.0g/L、酵母粉5.0g/L、乙酸钠5.0g/L、吐温-80 1ml/L、C6H5O7(NH4)3 2.0g/L、K2HPO4.7H2O 2.0g/L、烟酸1.0g/L、MgSO4.7H2O 0.2g/L、MnSO4.H2O 0.05g/L、Cacl20.02g/L、Fecl2 0.01g/L、Nacl 0.01g/L、40g/L浓度麦芽糖溶液单独灭菌补加；

[0042] 所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨5.0g/L、酵母粉5.0g/L、乙酸钠5.0g/L、吐温-80 1ml/L、C6H5O7(NH4)3 2.0g/L、K2HPO4.7H2O 2.0g/L、烟酸1.0g/L、MgSO4.7H2O 0.2g/L、MnSO4.H2O 0.05g/L、Cacl20.02g/L、Fecl2 0.01g/L、Nacl 0.01g/L、Glu 0.35g/L、Val 
0.115g/L、110g/L浓度麦芽糖溶液单独灭菌补加。

[0043] 在本实施例中，发酵5h时110g/L麦芽糖消耗完毕，11h葡聚糖浓度最高为39.98g/L，生产强度达3.6345 g/L/h。葡聚糖溶液粘度从4h开始迅速增加，到11h可达到最大粘度为6950cP，发酵结果如图1所示；通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪测定假肠膜明串珠菌G123发酵产葡聚糖分子量分布为1000～2500Da，结果如图2所示；通过核磁共振检测假肠膜明串珠菌G123发酵产葡聚糖构型表明该葡聚糖含有92%α21,6)键,5% α(1,3)及α3% α(1键，结果如图3所示。

[0044] 实施例2

[0045] 本实施例说明假肠膜明串珠菌G123利用不同底物发酵产葡聚糖的方法：

[0046] （1）种子液培养：

[0047] 一级种子培养：取1mL甘油保存管中的假肠膜明串珠菌G123菌液接种于装液量为5mL的试管中，30℃，150rpm培养12～14h；

[0048] 二级种子培养：以2%（V/V）的接种量从一级种子液转接至装液量为100mL的500mL三角瓶中，30℃，150 rpm，培养10～12h；

[0049] （2）发酵罐培养：

[0050] 将（1）中的二级种子液以8%（V/V）的接种量接种至3L发酵罐中，装液量为2L，初始底物浓度为120g/L，调节初始pH7.5，以20%NaOH控制发酵过程中pH不低于7.0，发酵全程通空气，控制空气流量为0.5L/min，加入0.3%消泡剂，30℃，250～300 rpm，培养18～24h。

[0051] 其中种子液培养基及发酵培养基中底物分别为40g/L麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、曲二糖、龙胆二糖，其他组分同实施例1中所述种子培养基和发酵培养基组分。

[0052] 本实施例中，假肠膜明串珠菌G123以麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、曲二糖、龙胆二糖等葡二糖为底物发酵均可产生微分子量葡聚糖，其中以麦芽糖和纤维二糖为底物产生的葡聚糖粘度比以海藻糖、曲二糖、龙胆二糖为底物的粘度高，以麦芽糖为底物时，葡聚糖粘度达6950cP，以纤维二糖为底物时，葡聚糖粘度达6695 cP，以海藻糖、曲二糖、龙胆二糖为底物时，葡聚糖粘度均在5800～6200 cP范围内，为生产得到高粘度葡聚糖，较佳的底物选择为麦芽糖或纤维二糖。

[0053] 实施例3 本实施例说明假肠膜明串珠菌G123在不同pH环境中发酵产葡聚糖的方法：

[0054] （1）种子液培养：

[0055] 一级种子培养：取1mL甘油保存管中的假肠膜明串珠菌G123菌液接种于装液量为5mL的试管中，30℃，150rpm培养12～14h；

[0056] 二级种子培养：以2%（V/V）的接种量从一级种子液转接至装液量为100mL的500mL三角瓶中，30℃，150 rpm，培养10～12h；

[0057] （2）发酵罐培养：

[0058] 将（1）中的二级种子液以8%（V/V）的接种量接种至3L发酵罐中，装液量为2L，初始麦芽糖溶液浓度为110g/L，①调节初始pH7.0，以20%NaOH控制发酵过程中pH不低于6.5；②调节初始pH7.5，以20%NaOH控制发酵过程中pH不低于7.0；③调节初始pH8.0，以20%NaOH控制发酵过程中pH不低于7.5，发酵全程通空气，控制空气流量为0.5L/min，加入0.3%消泡剂，30℃，250～300 rpm，培养18～24h。

[0059] 其中种子液培养基及发酵培养基同实施例1中所述种子培养基及发酵培养基组分。

[0060] 本实施例中，假肠膜明串珠菌G123以麦芽糖为底物在pH7.0～7.5的微碱性环境中产生1000～2500Da微分子量葡聚糖，在pH6.5～7.0的环境中产生10000～12000Da小分子量葡聚糖，在pH7.5～8.0的环境中也产生微分子量葡聚糖，但菌种在此范围中对底物利用率较低，优选的pH范围为7.0～7.5，在这种微碱性环境中菌种对底物的利用率最高，葡聚糖含量为39.98g/L，生产强度达3.6345 g/L/h。