DNA扩增产物快速检测方法

摘要

本发明公开了一种DNA扩增产物快速检测方法，通过在目的DNA上下游引物的5’端分别添加不同的Tag序列，并使用带有两个羟甲基的芳香族化合物对引物与Tag之间的区段进行修饰，使其PCR扩增产物带有末端单链标签Tag。分别设计与上下游引物Tag互补的序列，并将该互补序列分别结合到胶体金粒子上，制成标记胶体金溶液。将PCR扩增产物与标记胶体金溶液混合，通过肉眼便可判断检测结果，无需其他仪器设备，大大节约检测成本，且具有很高的检测灵敏度和广泛的通用性。

权利要求

1.一种用于非疾病诊断目的的DNA扩增产物快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计用于扩增目的DNA的上游引物F和下游引物R序列，并在上游引物F和下游引物R序列的5’端分别加上Tag1和Tag2序列，上游引物F序列和Tag1序列之间、下游引物R序列和Tag2序列之间分别用带有两个羟甲基的芳香族化合物隔开，得到F-Tag1和R-Tag2，两个羟甲基分别与相邻两个核苷酸的磷酸基形成磷酸二酯键；所述带有两个羟甲基的芳香族化合物为以下结构式化合物中的一种：；

（2）分别设计与Tag1和Tag2互补的序列C-Tag1和C-Tag2，并分别在C-Tag1和C-Tag2的

5’端用-SH修饰；将修饰过后的C-Tag1和C-Tag2分别通过金硫键结合到胶体金粒子上，得到AuNP DNA1和AuNP DNA2；将AuNP DNA1和AuNP DNA2按C-Tag1和C-Tag2摩尔比1:1混匀制备成红色透明的标记胶体金溶液，备用；

（3）以待检测DNA为模板、F-Tag1和R-Tag2为扩增引物，混合PCR反应体系置于PCR仪中进行反应，得到PCR产物；

（4）将PCR产物加入到标记胶体金溶液中混匀，肉眼观察进行检测及判断，标记胶体金溶液无变化则检测结果为阴性，标记胶体金溶液变浑浊则检测结果为阳性。

2.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的DNA扩增产物快速检测方法，其特征在于，步骤（2）中在-SH和C-Tag1之间、-SH和C-Tag2之间，添加10-12个胸腺嘧啶核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的用于非疾病诊断目的的DNA扩增产物快速检测方法，其特征在于，步骤（1）中上游引物和下游引物序列长度分别为18-25nt，Tag1和Tag2序列长度都为15-20nt。

4.根据权利要求1或2所述的用于非疾病诊断目的的DNA扩增产物快速检测方法，其特征在于，Tag1和Tag2序列为：Tag1：5’-CGTCTCTGTACGAGACT-3’

Tag2：5’-CCATGTCTAATGCTGAT-3’。

5.根据权利要求1或2所述的用于非疾病诊断目的的DNA扩增产物快速检测方法，其特征在于，步骤（2）中标记胶体金溶液中胶体金的浓度为0.001-0.01 wt%，以胶体金表面固定的寡核苷酸计浓度为1-100 nM。

6.根据权利要求1或2所述的用于非疾病诊断目的的DNA扩增产物快速检测方法，其特征在于，步骤（4）中加入的PCR产物的量与标记胶体金溶液的体积比为1:1-4。

7.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的DNA扩增产物快速检测方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述的引物和标记胶体金溶液；所述引物包括F-Tag1和R-Tag2，所述F-Tag1从5'-端开始依次含有Tag1序列、权利要求1所述的带有两个羟甲基的芳香族化合物和目的DNA上游引物序列，所述R-Tag2从5'-端开始依次含有Tag2序列、权利要求1所述的带有两个羟甲基的芳香族化合物和目的DNA下游引物序列；所述胶体金溶液主要由AuNP DNA1和AuNP DNA2按C-Tag1和C-Tag2摩尔比1:1混匀得到，所述AuNP DNA1由Tag1的互补序列C-Tag1与胶体金连接而成，所述AuNP DNA2由Tag2的互补序列C-Tag2与胶体金连接而成。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阳性对照溶液，所述阳性对照溶液为用F-Tag1和R-Tag2扩增目的DNA得到的阳性PCR产物。

说明书

DNA扩增产物快速检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于核酸检测领域，特别是一种快速检测DNA扩增产物的方法。

背景技术

[0002] DNA聚合酶链反应(PCR)是扩增DNA片段最常用的方法，每个扩增周期由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成，循环进行，目的DNA迅速扩增，1-2小时就能扩增几百万倍。PCR因其扩增特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等优点而被广泛应用于各种核酸检测中。常被用于核酸的基础研究，在医学上的应用也十分广泛，它也是目前核酸检测的金标准。PCR产物都是产生平末端双链产物，如今的检测方法一般包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，随后需要借助染色和紫外透射成像进行分析。这些分析操作步骤繁琐、耗时长，且依赖仪器及特殊训练的专业人员，不利于实时检测和偏远地区使用。

[0003] 另外还有通过核酸试纸条对PCR产物进行检测的方法，该技术一般都需要对PCR引物序列进行双修饰或者其他特殊的处理，常见的有以下两种：一、双修饰引物：常用于标记的小分子有Biotin，Digoxin，FITC，Cy3等，且为了在试纸条上进行夹心法检测都需要进行双修饰。这些小分子都是修饰在引物的末端，当引物与模板退火延伸时，小分子也标记在产物上，从而达到标记PCR产物的目的。在试纸条上固定有标记分子的抗体，利用抗原-抗体特异性结合的原理实现对PCR产物的快速检测。二、双修饰加高温变性处理：PCR扩增产物一般都是平末端双链，如果不在末端进行分子修饰的话，则没有突出的粘性末端用于杂交；高温变性可以将双链分离而得到单链，用于跟标记在纳米粒子表面的核酸互补配对而固定到纳米粒子表面。这样通过双重化学修饰再加上高温变性才能用试纸条进行夹心法检测，成本高且变温来产生单链，效率低，影响检测灵敏度。另外，上述方法均需利用试纸条，因此成本偏高。而且，制备试纸条需要特殊的载体材料、仪器和专门的干燥室，例如玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜以及划膜喷金仪，且制备过程比较繁琐。

发明内容

[0004] 针对以上DNA扩增产物检测方法繁琐复杂、成本高、灵敏度低的问题，本发明提出一种快速检测DNA扩增产物的方法，DNA扩增后得到的产物可直接用标记胶体金溶液进行检测，从而达到准确、快速、灵敏、低成本、操作简易的检测需求。

[0005] 一种DNA扩增产物快速检测方法，包括以下步骤：

[0006] (1)设计用于扩增目的DNA的上游引物F和下游引物R序列，并在上游引物F和下游引物R序列的5’端分别加上Tag1和Tag2序列，上游引物F序列和Tag1序列之间、下游引物R序列和Tag2序列之间分别用带有两个羟甲基的芳香族化合物隔开，得到F-Tag1和R-Tag2，两个羟甲基分别与相邻两个核苷酸的磷酸基形成磷酸二酯键；所述带有两个羟甲基的芳香族化合物为以下结构式化合物中的一种：

[0007]

[0008] (2)分别设计与Tag1和Tag2互补的序列C-Tag1和C-Tag2，并分别在C-Tag1和C-Tag2的5’端用巯基(-SH)修饰；将修饰过后的C-Tag1和C-Tag2分别通过金硫键(Au-S)结合到胶体金粒子上，得到AuNP DNA1和AuNP DNA2；将AuNP DNA1和AuNP DNA2按C-Tag1和C-Tag2摩尔比1:1混匀制备成红色透明的标记胶体金溶液，备用；

[0009] (3)以待检测DNA为模板、F-Tag1和R-Tag2为扩增引物，混合PCR反应体系置于PCR仪中进行反应，得到PCR产物；

[0010] (4)将PCR产物加入到标记胶体金溶液中混匀，肉眼观察进行检测及判断，标记胶体金溶液无变化则检测结果为阴性，标记胶体金溶液变浑浊则检测结果为阳性。

[0011] 进一步地，步骤(1)中上游引物和下游引物序列长度分别为18-25nt，Tag1和Tag2序列长度都为15-20nt。所述上游引物和下游引物根据引物设计规则随机进行设计即可，也可根据具体实验需要对引物的长度、GC含量等进行限定，也可根据实际需要在引物上添加接头或进行修饰。本发明选择引物长度18-25nt更利于PCR反应的正常进行。Tag1和Tag2序列可进行随机设计，长度选择15-20nt既可满足碱基互补检测的要求，也可有效控制成本。另外，Tag1和Tag2序列可以通用。

[0012] 进一步地，Tag1和Tag2序列为：

[0013] Tag1：5’-CGTCTCTGTACGAGACT-3’

[0014] Tag2：5’-CCATGTCTAATGCTGAT-3’，

[0015] 上述Tag1和Tag2序列已证实可以在各种PCR产物检测中通用。

[0016] 进一步地，步骤(2)中在-SH和C-Tag1之间、-SH和C-Tag2之间，添加10-12个核苷酸T(胸腺嘧啶核苷酸)，这样可以增加胶体金与C-Tag之间的空间，利于Tag与其互补序列C-Tag的结合，使C-Tag1和C-Tag2更容易标记于胶体金上。

[0017] 进一步地，步骤(2)中胶体金粒子的制备方法为：将0.01wt％的氯金酸与1wt％的柠檬酸三钠混匀制成，氯金酸与柠檬酸三钠的体积比为0.5-4:100。胶体金粒子的直径大小会随着氯金酸与柠檬酸三钠体积比的不同而有所变化，常规的1.5mL/100mL可制备出的胶体金的粒径在40nm左右，随着还原剂柠檬酸三钠溶液体积的增加，制备的胶体金粒径会越来越小，在本发明中胶体金粒子大小直径范围在5nm到100nm之间。

[0018] 进一步地，步骤(2)中标记胶体金溶液中纳米金的浓度为0.001-0.01wt％，以纳米金表面固定的寡核苷酸计浓度为1-100nM。

[0019] 进一步地，步骤(4)中加入的PCR产物的量与标记胶体金溶液的体积比为1:1-4。

[0020] 本发明的另外一个目的是提供一种快速检测DNA扩增产物的试剂盒，包括引物和标记胶体金溶液；所述引物包括F-Tag1和R-Tag2，F-Tag1从5'-端开始依次含有Tag1序列、带有两个羟甲基的芳香族化合物和目的DNA上游引物序列，R-Tag2从5'-端开始依次含有Tag2序列、带有两个羟甲基的芳香族化合物和目的DNA下游引物序列；所述胶体金溶液主要由AuNP DNA1和AuNP DNA2按C-Tag1和C-Tag2摩尔比1:1混匀得到，AuNP DNA1由Tag1的互补序列C-Tag1与胶体金连接而成，AuNP DNA2由Tag2的互补序列C-Tag2与胶体金连接而成。

[0021] 进一步地，上述试剂盒中还含有阳性对照溶液，所述阳性对照溶液为用F-Tag1和R-Tag2扩增目的DNA得到的阳性PCR产物。该阳性对照溶液用于验证试剂盒中的标记胶体金溶液是否有效可用。

[0022] 本发明的原理如下：

[0023] 在序列设计时，上下游引物的5’端分别带有不同的Tag1和Tag2标签序列，且两段序列中间用带有两个羟甲基的芳香族化合物进行修饰(该化合物通过两个羟甲基与磷酸骨架相结合，完成对核酸序列的修饰)。PCR反应时，由于修饰化合物会在空间上对核酸碱基的配对有很强的阻隔作用，DNA聚合酶的延伸就会在此修饰位置停止，因此PCR产物的两个5’末端就会分别带上Tag1和Tag2标签。由于胶体金溶液在单链核酸标记时能稳定保持分散状态，呈透明红色；当PCR产物与标记胶体金溶液混合后，产物两端的Tag序列分别与不同胶体金上的标记核酸互补杂交配对，从而将多个胶体金桥联成网状结构而产生絮凝沉淀，通过明显的絮凝现象(变浑浊)，肉眼即可判断检测结果，从而完成对扩增产物的快速检测。

[0024] 本发明具有以下有益效果：

[0025] (1)本发明通过在引物的5’添加标签序列，并在引物和标签序列之间进行修饰，PCR反应时阻碍DNA聚合酶的延伸，使得到的PCR产物带有单链末端，该PCR产物可直接加入到标记胶体金序列中，通过观察混合物状态的变化判断PCR产物的有无，具有足够高的检测灵敏度，方便、快捷，几秒钟便可通过肉眼观察得知结果，对技术的专业性要求低，不需专业设备，有效节省了检测成本。

[0026] (2)经过合理序列设计，Tag标签序列可以通用，只需要改变引物序列，就可以对不同目的DNA进行检测，具有良好的通用性。

附图说明

[0027] 图1为带有两个羟甲基的芳香族化合物的化学结构式；

[0028] 图2为带有两个羟甲基的芳香族化合物对核酸分子的修饰机理；

[0029] 图3为被修饰的上下游引物的结构简图；

[0030] 图4为图1A化合物的合成过程示意图；

[0031] 图5为图1B化合物的合成过程示意图；

[0032] 图6为标记胶体金制备简图；

[0033] 图7为本发明的流程示意图；

[0034] 图8为本发明实施例1的PCR产物检测结果图；

[0035] 图9为本发明实施例1的PCR产物电泳图；

[0036] 图10为本发明实施例2的PCR产物检测结果图；

[0037] 图11为本发明实施例2的PCR产物电泳图。

具体实施方式

[0038] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

[0039] 实施例1

[0040] 本实施例以结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的gyrB基因(GenBank登录号：JQ684012.1)为检测对象。

[0041] (1)设计gyrB基因的上下游引物gyr-F和gyr-R，目的产物长度为112bp。分别在gyr-F和gyr-R的5’加上Tag1和Tag2序列，并在gyr-F和Tag1之间、gyr-R和Tag2之间分别用图1A所示的带有两个羟甲基的芳香族化合物进行修饰，修饰机理如图2A所示，得到用于PCR扩增的引物序列gyr-F-Tag1和gyr-R-Tag2，如图3所示，序列信息如下所示，其中一个x即代表一个羟甲基的芳香族化合物分子。

[0042] 图1A所示的带有两个羟甲基的芳香族化合物的具体合成方法如图4所示：

[0043] a).化合物(1)氨基间苯二甲酸二甲酯(6.00g 28.68mmol)与NaNO2(3.96g 57.36mmol)溶于34.2mL水中，再加入7.8mL盐酸(浓度为2M)，在0℃下搅拌反应1h；再加入碘化钾溶液(9.54g溶于138mL水中)，在室温下搅拌反应1h，反应结束后，经过分离纯化后得到化合物(2)5-碘衍生物4.42g，产物得率为48％。

[0044] b).化合物(2)5-碘衍生物(2.76g 8.64mmol)与硼氢化锂(0.96g 44.10mmol)溶于48mL四氢呋喃中，在室温下搅拌反应24h，再于0℃下加入饱和NaHCO3溶液6mL，在室温下再搅拌反应1h，反应结束后，经过分离纯化后得到白色固体化合物(3)，其质量为1.74g，产物得率为76％。

[0045] c).取化合物(3)(1.62g 6.18mmol)、TBDMSCl(2.04g 13.62mmol)、咪唑(1.86g 27.18mmol)混合于24mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，在室温下搅拌反应2h，再加入6mL乙醇，混合搅拌10分钟，反应结束后，经过分离纯化得到化合物(4)，其质量为3.0g，产物得率为
97％。

[0046] d).取化合物(4)(2.80g 5.64mmol)溶于28mL乙醚中，再缓慢加入丁基锂溶液(1.6M溶于己烷)，在-78℃下搅拌反应1h，再往混合溶液中缓慢加入硼酸三甲酯(2.48mL 22.2mmol)，再缓慢加热至室温，并保温搅拌反应12h，反应结束后，经过分离纯化得到白色固体化合物(5)，其质量为1.38g，产物得率为60％。

[0047] e).取化合物(5)(1.00g 2.44mmol)溶于24mL的THF/H2O(体积比5:1)中，将化合物(6)1’-碘代萘(0.62g 2.44mmol)与PdCl2(dppf)·CH2Cl2(0.122g 0.149mmol)溶于12mL的THF/H2O(体积比5:1)中，将上述两种溶液混合，并加入3.66mL NaOH溶液(2M)，在65℃下搅拌反应24h，反应结束后，经过分离纯化得到化合物(7)。

[0048] f).将化合物(7)溶于7.3mL四氢呋喃(THF)中，再滴加入7.3mL的四丁基氟化氨溶液(1.0M溶于THF)中，在室温下搅拌反应1h，反应结束后，经过分离纯化得到联芳化合物(8)，其质量为0.55g，产物得率为84％。

[0049] g).将联芳化合物化合物(8)(0.55g 2.05mmol)与DMTrCl(0.91g 2.68mmol)溶于10mL的吡啶中，在室温下搅拌反应4h，反应结束后，经过分离纯化得到联芳化合物(9)，其质量为0.43g，产物得率为37％。

[0050] h).将化合物(9)(0.43g 0.76mmol)、2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(0.48mL 2.75mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.35mL 1.57mmol)溶于7mL四氢呋喃(THF)中，在室温下搅拌反应1h，反应结束后，将混合物经过分离纯化得到化合物(10)，其质量为0.51g，产物得率为88％。

[0051] 经过纯化得到的化合物(10)用乙腈溶解，按照常规方法通过DNA合成仪添加到引物上，生成修饰引物。

[0052] (2)分别设计与Tag1和Tag2互补的序列C-Tag1和C-Tag2，并分别在C-Tag1和C-Tag2的5’端加10个胸腺嘧啶核苷酸(T)，然后用巯基(-SH)修饰5’端。将修饰过后的C-Tag1和C-Tag2分别通过金硫键(Au-S)结合到胶体金粒子上，其过程如图6所示，一个胶体金上一般能结合多条核酸序列，得到AuNP DNA1和AuNP DNA2。将AuNP DNA1和AuNP DNA2按C-Tag1和C-Tag2摩尔比1:1混匀制备成红色透明的标记胶体金溶液，使纳米金表面固定的寡核苷酸的浓度为10nM，备用。

[0053] 其中胶体金粒子的制备方法为：将0.01wt％的氯金酸与1wt％的柠檬酸三钠混匀制成，氯金酸与柠檬酸三钠的体积比为1:100。

[0054] gyr-F：5’-GCTGCGTCTATCACCATTCTC-3’ 21nt

[0055] gyr-R：5’-CGACCACCTCCCAAATGAGA-3’ 20nt

[0056] Tag1：5’-CGTCTCTGTACGAGACT-3’ 17nt

[0057] Tag2：5’-CCATGTCTAATGCTGAT-3’ 17nt

[0058] gyr-F-Tag1：5’-CGTCTCTGTACGAGACTxGCTGCGTCTATCACCATTCTC-3’ 38nt[0059] gyr-R-Tag2：5’-CCATGTCTAATGCTGATxCGACCACCTCCCAAATGAGA-3’ 37nt[0060] gyrB基因扩增片段：5’-GCTGCGTCTATCACCATTCTCGAAGGGCTGGAGGCCGTCCGCAAACGTCCCGGCATGTACATTGGCTCGACCGGTGAGCGCGGTTTACACCATCTCATTTGGGAGGTGGTCG-3’112nt[0061] C-Tag1：5’-SH-TTTTTTTTTTAGTCTCGTACAGAGACG-3’ 27nt

[0062] C-Tag2：5’-SH-TTTTTTTTTTATCAGCATTAGACATGG-3’ 27nt

[0063] AuNP DNA1：Au-S-TTTTTTTTTTAGTCTCGTACAGAGACG-3’

[0064] AuNP DNA2：Au-S-TTTTTTTTTTATCAGCATTAGACATGG-3’

[0065] (3)以结核杆菌基因组DNA为模板，gyr-F-Tag1/gyr-R-Tag2为引物混合PCR反应体系，同时设置不加模板DNA的对照及采用未修饰引物的对照，如表1所示。混好的PCR反应体系置于PCR仪中进行反应，PCR循环反应参数：95℃预变性3min；95℃ 15s、58℃ 20s、72℃40s，40个循环扩增；72℃ 5min扩增，得到PCR产物。

[0066] 表1实施例1的PCR反应体系(20μL)：

[0067]  对照组A 对照组B 实验组C
基因组DNA   2μL 2μL
gyr-F/gyr-R   各0.5μL  
gyr-F-Tag1/gyr-R-Tag2 各0.5μL   各0.5μL
1×PCR buffer 2μL 2μL 2μL
DNA聚合酶 0.5μL 0.5μL 0.5μL
dNTPs 2μL 2μL 2μL
ddH2O 14.5μL 12.5μL 12.5μL
总体积 20μL 20μL 20μL

[0068] (4)将10μL PCR产物加入到20μL标记胶体金溶液中，震荡混匀，片刻后，肉眼观察即可判断结果。实验结果如图8所示，A管为空白对照扩增产物，B管为未修饰引物的扩增产物，C管为修饰引物的扩增产物，D管为核酸标记胶体金溶液，A+、B+、C+管分别对应三种扩增产物加到标记胶体金后的混合物。图中显示A+、B+管中的颜色及状态相比于D管没有发生变化，呈现红色且透明，C+管中的溶液状态发生了变化，产生了絮状沉淀，以上结果说明只有修饰引物的扩增产物能使标记胶体金发生絮凝沉淀，充分证明了该设计的合理性。

[0069] (5)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，染色并成像，如图9中显示，A组空白对照中无产物生成，而B、C两管中均有产物生成，且产物长度为112bp。将B、C组的PCR产物回收测序显示序列正确。

[0070] 实施例2

[0071] 本实施例以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的mutS基因(GenBank登录号：EU652256.1)为检测对象。

[0072] (1)设计mutS基因的上下游引物mutS-F和mutS-R，目的产物长度为200bp。分别在mutS-F和mutS-R的5’加上Tag1和Tag2序列，并在mutS-F和Tag1之间、mutS-R和Tag2之间分别用图1B所示的化合物进行修饰，修饰机理如图2B所示，得到用于PCR扩增的引物序列mutS-F-Tag1和mutS-R-Tag2，如图3所示，序列信息如下所示，其中一个x即代表一个羟甲基的芳香族化合物分子。

[0073] 图1B所示的带有两个羟甲基的芳香族化合物的具体合成方法如图4所示：

[0074] a).化合物(1)氨基间苯二甲酸二甲酯(6.00g 28.68mmol)与NaNO2(3.96g 57.36mmol)溶于34.2mL水中，再加入7.8mL盐酸(浓度为2M)，在0℃下搅拌反应1h；再加入碘化钾溶液(9.54g溶于138mL水中)，在室温下搅拌反应1h，反应结束后，经过分离纯化后得到化合物(2)5-碘衍生物4.42g，产物得率为48％。

[0075] b).化合物(2)5-碘衍生物(2.76g 8.64mmol)与硼氢化锂(0.96g 44.10mmol)溶于48mL四氢呋喃中，在室温下搅拌反应24h，再于0℃下加入饱和NaHCO3溶液6mL，在室温下再搅拌反应1h，反应结束后，经过分离纯化后得到白色固体化合物(3)，其质量为1.74g，产物得率为76％。

[0076] c).取化合物(3)(1.62g 6.18mmol)、TBDMSCl(2.04g 13.62mmol)、咪唑(1.86g 27.18mmol)混合于24mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，在室温下搅拌反应2h，再加入6mL乙醇，混合搅拌10分钟，反应结束后，经过分离纯化得到化合物(4)，其质量为3.0g，产物得率为
97％。

[0077] d).取化合物(4)(2.80g 5.64mmol)溶于28mL乙醚中，再缓慢加入丁基锂溶液(1.6M溶于己烷)，在-78℃下搅拌反应1h，再往混合溶液中缓慢加入硼酸三甲酯(2.48mL 22.2mmol)，再缓慢加热至室温，并保温搅拌反应12h，反应结束后，经过分离纯化得到白色固体化合物(5)，其质量为1.38g，产物得率为60％。

[0078] e).取化合物(5)(1.00g 2.44mmol)溶于24mL的THF/H2O(5:1)中，将化合物(11)1’-溴芘(0.69g 2.44mmol)与PdCl2(dppf)·CH2Cl2(0.13g 0.15mmol)溶于12mL的THF/H2O(5:1)中，将上述两种溶液混合，并加入3.66mL的NaOH溶液(2M)，在65℃下搅拌反应48h，反应结束后，经过分离纯化得到化合物(12)。

[0079] f).将化合物(12)溶于45mL THF/CH2Cl2(体积比1:1)中，再滴加入1.14mL的四丁基氟化氨(TBAF)溶液(1.0M溶于THF中)中，在室温下搅拌反应1h，反应结束后，将混合物经过分离纯化得到联芳化合物(13)，其质量为0.42g，产物得率为54％。

[0080] g).将联芳化合物(13)(0.41g 1.21mmol)与DMTrCl(0.46g 1.36mmol)溶于10mL的吡啶中，在室温下搅拌反应4h，反应结束后，经过分离纯化得到联芳化合物(14)，其质量为0.45g，产物得率为58％。

[0081] h).将化合物(14)(0.44g 0.687mmol)、2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(0.31mL1.38mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.57mL 3.24mmol)溶于4mL的四氢呋喃(THF)中，在室温下搅拌反应1h，反应结束后，经过分离纯化得到化合物(15)，其质量为0.54g，产物得率为93％。

[0082] 经过纯化得到的化合物(15)用乙腈溶解，按照常规方法通过DNA合成仪添加到引物上，生成修饰引物。

[0083] (2)分别设计与Tag1和Tag2互补的序列C-Tag1和C-Tag2，并分别在C-Tag1和C-Tag2的5’端加10个胸腺嘧啶核苷酸(T)，然后用巯基(-SH)修饰5’端。将修饰过后的C-Tag1和C-Tag2分别通过金硫键(Au-S)结合到胶体金粒子上，其过程如图6所示，一个胶体金上一般能结合多条核酸序列，得到AuNP DNA1和AuNP DNA2。将AuNP DNA1和AuNP DNA2按C-Tag1和C-Tag2摩尔比1:1混匀制备成红色透明的标记胶体金溶液，使纳米金表面固定的寡核苷酸的浓度为100nM，备用。

[0084] 其中胶体金粒子的制备方法为：将0.01wt％的氯金酸与1wt％的柠檬酸三钠混匀制成，氯金酸与柠檬酸三钠的体积比为4:100。

[0085] mutS-F：5’-TCCTGAGCTTAAAGAGCATGAAGACAA-3’ 27nt

[0086] mutS-R：5’-GGCGGCAATAATCCAATGAGTCTG-3’ 24nt

[0087] Tag1：5’-CGTCTCTGTACGAGACT-3’ 17nt

[0088] Tag2：5’-CCATGTCTAATGCTGAT-3’ 17nt

[0089] mutS-F-Tag1:5’-CGTCTCTGTACGAGACTxTCCTGAGCTTAAAGAGCATGAAGACAA-3’ 44nt[0090] mutS-R-Tag2:5’-CCATGTCTAATGCTGATxGGCGGCAATAATCCAATGAGTCTG-3’ 41nt[0091] mutS基因扩增片段：5’-TCCTGAGCTTAAAGAGCATGAAGACAAGGTGCTGAACTCAAAATCAAAAGCACTAGCATTAGAGAAAAAGCTGTGGGAAGAGCTGTTCGATCTGTTAATGCCTCATCTTGAGCAAATGCAAAACTTGGCTTCTGCCGTTTCTCAGATGGACGTGTTACAAAATCTCGCGGAACGCGCAGACTCATTGGATTATTGCCGCC-3’ 200nt

[0092] C-Tag1：5’-SH-TTTTTTTTTTAGTCTCGTACAGAGACG-3’ 27nt

[0093] C-Tag2：5’-SH-TTTTTTTTTTATCAGCATTAGACATGG-3’ 27nt

[0094] AuNP DNA1：Au-S-TTTTTTTTTTAGTCTCGTACAGAGACG-3’

[0095] AuNP DNA2：Au-S-TTTTTTTTTTATCAGCATTAGACATGG-3’

[0096] (3)以副溶血弧菌基因组DNA为模板，mutS-F-Tag1/mutS-R-Tag2为引物混合PCR反应体系，同时设置不加模板DNA的对照及采用未修饰引物的对照，如表2所示。混好的PCR反应体系置于PCR仪中进行反应，PCR循环反应参数：95℃预变性3min；95℃ 15s、58℃ 20s、72℃ 40s，40个循环扩增；72℃5min扩增，得到PCR产物。

[0097] 表2实施例2的PCR反应体系(20μL)：

[0098]  对照组A 对照组B 实验组C
基因组DNA   2μL 2μL
mutS-F/mutS-R   各0.5μL  
mutS-F-Tag1/mutS-R-Tag2 各0.5μL   各0.5μL
1×PCR buffer 2μL 2μL 2μL
DNA聚合酶 0.5μL 0.5μL 0.5μL
dNTPs 2μL 2μL 2μL
ddH2O 14.5μL 12.5μL 12.5μL
总体积 20μL 20μL 20μL

[0099] (4)将10μL PCR产物加入到10μL标记胶体金溶液中，震荡混匀，片刻后，肉眼观察即可判断结果。实验结果如图10所示，A管为空白对照扩增产物，B管为未修饰引物的扩增产物，C管为修饰引物的扩增产物，D管为核酸标记胶体金溶液，A+、B+、C+管分别对应三种扩增产物加到标记胶体金后的混合物。图中显示A+、B+管中的颜色及状态相比于D管没有发生变化，呈现红色且透明，C+管中的溶液状态发生了变化，产生了絮状沉淀，以上结果说明只有修饰引物的扩增产物能使标记胶体金发生絮凝沉淀，也充分证明了该设计的合理性。

[0100] (5)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，染色并成像，如图11中显示，A组空白对照中无产物生成，而B、C两管中均有产物生成，且产物长度为200bp。将B、C组的PCR产物回收测序显示序列正确。

[0101] 实验结果如附图8、10由于拍射角度及光线等原因，实施例中图片显示可能会有色差，但观察结果主要取决于管中液体是否澄清透明，因此总体不影响对检测结果的判断。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。