一种赤灵芝提取物对照品及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种赤灵芝提取物对照品及其制备方法和应用，该赤灵芝提取物对照品的制备方法包括对赤灵芝进行提取以获得赤灵芝提取物的步骤，还包括将不同的赤灵芝提取物相互勾兑以获得赤灵芝提取物对照品的步骤，所述赤灵芝提取物对照品中含有如下质量百分含量的各组分：灵芝酸A为0.3％‑0.5％，灵芝酸B为0.15％‑0.4％，灵芝酸C2为0.3％‑0.5％，灵芝酸G为0.25％‑0.5％。本发明提供的赤灵芝提取物对照品，可有效解决赤灵芝质量评价中对照品的成本高，且无法全面准确评价赤灵芝优劣的问题。

权利要求

1.一种赤灵芝提取物对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对用于制备赤灵芝提取物对照品的赤灵芝原料药材进行筛选的步骤：建立赤灵芝标准图谱，将待选灵芝药材进行液相色谱分析并将所获得的图谱与所述赤灵芝标准图谱进行对照，筛选出相似度大于90％的药材，将所述相似度大于90％的药材进行菌种鉴定，筛选确认为赤灵芝的药材，并进一步筛选出灵芝酸A含量大于0.02％、灵芝酸B质量含量大于

0.01％、灵芝酸C2质量含量大于0.015％、灵芝酸G质量含量大于0.015％的药材；

（2）对赤灵芝进行提取以获得赤灵芝提取物的步骤：将赤灵芝粉碎，加入同一种溶剂提取两次，对提取液进行过滤，收集滤液；

（3）制备成赤灵芝提取物的步骤：对滤液进行减压浓缩、向浓缩物中加入辅料、继续减压浓缩至干；

将不同的赤灵芝提取物相互勾兑以获得赤灵芝提取物对照品的步骤：用于制备赤灵芝提取物对照品的赤灵芝原料药材为至少两种赤灵芝药材；将所优选的赤灵芝药材分别制备成赤灵芝提取物后进行混合；

（4）对赤灵芝提取物对照品中的灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G的含量进行标定的步骤：用液相色谱法标定赤灵芝提取物对照品中的灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G的含量；

所述赤灵芝提取物对照品需符合含有如下质量百分含量的各组分：灵芝酸A为0.3％-

0.5％，灵芝酸B为0.15％-0.4％，灵芝酸C2为0.3％-0.5％，灵芝酸G为0.25％-0.5％。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述赤灵芝提取物的制备优选的提取方法采用加热回流提取、超声提取、微波提取、渗漉提取或闪式提取。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述辅料为糊精、微粉硅胶、淀粉、羧甲基纤维素中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为甲醇、乙醇、或体积浓度

70％以上的甲醇水溶液、或体积浓度70％以上的乙醇水溶液中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述赤灵芝标准图谱按照如下步骤建立：将来自不同产地的灵芝药材进行薄层图谱鉴别，并与赤灵芝对照药材的薄层图谱进行对比，选出与赤灵芝对照药材的薄层图谱在相应位置上显相同颜色的荧光斑点的药材为优选药材；

将优选药材通过液相色谱分析获得指纹图谱，并将所得指纹图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行指纹图谱分析并生成赤灵芝标准图谱。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述液相色谱的色谱条件包括：色谱柱选择反相色谱柱，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为三氟乙酸、甲酸、乙酸、磷酸中的至少一种与甲醇、乙腈中的至少一种的混合溶液，流动相B为三氟乙酸、甲酸、乙酸、磷酸中的至少一种的水溶液。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述薄层图谱鉴别按照如下参数进行：薄层板为硅胶薄层板，展开剂为体积比12-17：12-17：0.5-15：0.1的甲苯、乙酸乙酯、甲醇、甲酸，显色剂为质量分数10％-50％的硫酸乙醇溶液。

8.一种赤灵芝提取物对照品，其特征在于，包括如下质量百分含量的各组分：灵芝酸A为0.3％-0.5％，灵芝酸B为0.15％-0.4％，灵芝酸C2为0.3％-0.5％，灵芝酸G为0.25％-

0.5％。和所述赤灵芝提取物对照品采用如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得。

9.权利要求8所述的赤灵芝提取物对照品在赤灵芝药材的质量评价及含有赤灵芝成分产品的质量评价方面的应用。

说明书

一种赤灵芝提取物对照品及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于灵芝质量控制技术领域，特别涉及一种赤灵芝对照品提取物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 灵芝在我国已有上千年的历史，早在《神农本草经》中就有记载，灵芝固本培元，久食不老，轻身延年。

[0003] 然而，灵芝作为一种真菌类药材，品种繁多，不同品种的灵芝化学成分差异巨大，即使同为赤灵芝，又分为很多亚种，灵芝的不同部位子实体与孢子粉成分也完全不同，菌丝体也与子实体在成分上有很大差异。中药的功效是建立在其所含有的化学物质的组成和含量稳定的基础上的，如果化学组成和含量差异很大，那么其功效必然会产生很大的不确定性。同时，以化学组成和含量差异巨大的灵芝药材为原料生产的灵芝产品也必然无法做到质量稳定可靠，疗效确切。因此，对灵芝药材和灵芝产品进行鉴别和质量评价非常重要。

[0004] 目前，灵芝药材的有效成分为灵芝三萜和多糖。目前检测灵芝三萜主要方法为紫外法，但该方法专属性差无法区分灵芝三萜与甾醇。本领域内有学者用液相色谱法，以灵芝中不同灵芝酸单体化合物对照品为参照，检测灵芝药材中灵芝三萜含量。这种方法的专属性强，但由于灵芝三萜对照品过于稀有昂贵，并且单一一种灵芝酸单体化合物的含量无法代表灵芝中全部灵芝酸的含量。因此该方法难于应用于生产和流通领域。

[0005] 开发一种可有效降低成本且有利于全面准确评价赤灵芝优劣的对照品非常有必要。

发明内容

[0006] 本发明为弥补现有技术中存在的缺陷，提供一种赤灵芝提取物对照品及赤灵芝提取物对照品的制备方法，可有效解决赤灵芝质量评价中对照品的成本高，且无法全面准确评价赤灵芝优劣的问题。

[0007] 本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：

[0008] 一种赤灵芝提取物对照品的制备方法，包括对赤灵芝进行提取以获得赤灵芝提取物的步骤，还包括将不同的赤灵芝提取物相互勾兑以获得赤灵芝提取物对照品的步骤，所述赤灵芝提取物对照品中含有如下质量百分含量的各组分：灵芝酸A为0.3％-0.5％，灵芝酸B为0.15％-0.4％，灵芝酸C2为0.3％-0.5％，灵芝酸G为0.25％-0.5％。

[0009] 优选的，用于制备赤灵芝提取物对照品的赤灵芝原料药材为至少两种赤灵芝药材。

[0010] 进一步的，还包括对赤灵芝提取物对照品中的灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G的含量进行标定的步骤。

[0011] 优选的，所述赤灵芝提取物的制备包括如下步骤：将赤灵芝粉碎，加入溶剂提取，对提取液进行过滤，收集滤液；优选的，所述提取采用加热回流提取、超声提取、微波提取、渗漉提取或闪式提取。

[0012] 优选的，还包括对滤液进行减压浓缩、向浓缩物中加入辅料、继续减压浓缩至干的步骤；优选的，所述辅料为糊精、微粉硅胶、淀粉、羧甲基纤维素中的至少一种；更优选的，所述辅料和所述浓缩物的质量比为0.5∶1～3∶1。

[0013] 优选的，所述溶剂为甲醇、乙醇、体积浓度为70％以上的甲醇水溶液、或体积浓度70％以上的乙醇水溶液中的至少一种。其中最优选为甲醇或体积浓度95％的乙醇水溶液。

[0014] 优选的，还包括对用于制备赤灵芝提取物对照品的赤灵芝原料药材进行筛选的步骤，所述筛选步骤包括如下步骤：

[0015] 建立赤灵芝标准图谱，将待选灵芝药材进行液相色谱分析并将所获得的图谱与所述赤灵芝标准图谱进行对照，筛选出相似度大于90％的药材；

[0016] 进一步优选的，将所述相似度大于90％的药材进行菌种鉴定，筛选确认为赤灵芝的药材；更进一步优选的，对筛选出的药材进行含量分析，筛选出灵芝酸A质量含量大于0.02％、灵芝酸B质量含量大于0.01％、灵芝酸C2质量含量大于0.015％、灵芝酸G质量含量大于0.015％的药材。

[0017] 作为一种具体实施方式，所述赤灵芝标准图谱按照如下步骤建立：

[0018] 将来自不同产地的灵芝药材进行薄层图谱鉴别，并与赤灵芝对照药材的薄层图谱进行对比，选出与赤灵芝对照药材的薄层图谱在相应位置上显相同颜色的荧光斑点的药材为优选药材；

[0019] 将优选药材通过液相色谱分析获得指纹图谱，并将所得指纹图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行指纹图谱分析并生成赤灵芝标准图谱。

[0020] 作为一种优选方案，所述液相色谱的色谱条件包括：色谱柱选择反相色谱柱，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为三氟乙酸、甲酸、乙酸、磷酸中的至少一种与甲醇、乙腈中的至少一种的混合溶液，流动相B为三氟乙酸、甲酸、乙酸、磷酸中的至少一种的水溶液；优选的，所述流动相A为0.05～0.15％(质量)三氟乙酸乙腈溶液，流动相B为0.05～0.15％(质量)三氟乙酸水溶液；进一步优选的，流动相的梯度洗脱程序为：A+B＝100％(体积)，在0-35min，流动相A维持在20-30％(体积)，流动相B维持在70-80％(体积)；在35-
90min，流动相A维持在60-70％(体积)，流动相B维持在30-40％(体积)；在90-120min，流动相A维持在100％(体积)，流动相B维持在0％(体积)。

[0021] 作为一种优选方案，所述薄层图谱鉴别按照如下参数进行：

[0022] 薄层板为硅胶薄层板，展开剂为体积比12～17∶12～17∶0.5～1.5∶0.1的甲苯、乙酸乙酯、甲醇、甲酸，显色剂为质量分数10％-50％硫酸乙醇溶液。

[0023] 本发明第二方面提供一种赤灵芝提取物对照品，包括如下质量百分含量的各组分：灵芝酸A为0.3％-0.5％，灵芝酸B为0.15％-0.4％，灵芝酸C2为0.3％-0.5％，灵芝酸G为0.25％-0.5％。；和/或，所述赤灵芝提取物对照品采用如上文所述的制备方法制得。

[0024] 上文所述的赤灵芝提取物对照品可应用于赤灵芝药材的质量评价及含有赤灵芝成分产品的质量评价方面的应用

[0025] 本发明提供的技术方案具有如下有益效果：

[0026] 本发明制备了一种赤灵芝提取物对照品作为赤灵芝质量评价的对照物。本发明提供的赤灵芝提取物对照品在以下方面具有显著优越性：

[0027] 1、与灵芝三萜化学对照品相比

[0028] 1)与使用单一化合物(或几种化合物的组合)为对照品比，使用本发明的赤灵芝提取物对照品来鉴别药材，可以在薄层色谱和液相色谱上呈现更加丰富的图谱信息，便于不同灵芝品种间的鉴别。

[0029] 2)现有的灵芝三萜化学对照品提取纯化工艺复杂，成本高昂，难于在生产实践中推广。而本发明的赤灵芝提取物对照品制备工艺简单，重复性好，能够满足定性、定量检测灵芝中灵芝酸的要求。

[0030] 3)使用该赤灵芝提取物对照品可以实现用一个赤灵芝提取物对照品同时对赤灵芝样本中的多个灵芝酸化合物含量进行标定。而使用灵芝三萜化学对照品则每次只能标定赤灵芝样本中的一个灵芝酸成分。因此，使用赤灵芝提取物对照品大大节省了检测的时间和成本。

[0031] 2、与对照药材相比：

[0032] 1)使用本发明的提取物对照品鉴别药材具有更好的稳定性和更强的通用性。对照药材会受到自然环境的影响产生较大的批次差异，而提取物对照品由于可以实现生产工艺的调控和原料的勾兑，并且经过进一步严格标定，可以更好的保证批次间的均一性。

[0033] 2)除此之外，提取物对照品在使用时不需要复杂前处理，溶解后可以直接使用。比对照药材使用简洁方便。

[0034] 3)对照药材只能用于赤灵芝药材或赤灵芝产品的定性鉴别，不能用于赤灵芝药材中灵芝三萜的定量测定。而赤灵芝提取物对照品既可以用于赤灵芝药材或赤灵芝产品的定性鉴别，也可以用于赤灵芝药材中灵芝三萜的定量测定。

[0035] 综上所述，赤灵芝提取物对照品可以同时实现灵芝对照药材和灵芝化学对照品的功能，并且可以实现一个赤灵芝提取物对照品对多种灵芝成分的同时标定，使用方便，成本低。是一种更加符合国际标准的对照品。

附图说明

[0036] 图1是样品1-样品18的薄层色谱图；

[0037] 图2是样品19-样品30的薄层色谱图；

[0038] 图3是样品31-样品39的薄层色谱图；

[0039] 图4是样品40-样品45的薄层色谱图；

[0040] 图5是样品46-样品50的薄层色谱图；

[0041] 图6是30-50号灵芝药材的液相色谱指纹图谱分析图；

[0042] 图7是赤灵芝标准图谱；

[0043] 图8是用赤灵芝提取物对照品薄层鉴别不同品种灵芝；

[0044] 图9是赤灵芝药材含量测定图。

具体实施方式

[0045] 本发明提供一种赤灵芝提取物对照品，该赤灵芝提取物对照品的制备主要包括如下步骤：对赤灵芝进行提取以获得赤灵芝提取物的步骤，将不同的赤灵芝提取物相互勾兑以获得赤灵芝提取物对照品的步骤，勾兑的目的之一是为了让赤灵芝提取物对照品达到如下质量标准，即，含有如下质量百分含量的各组分：灵芝酸A为0.3％-0.5％，灵芝酸B为0.15％-0.4％，灵芝酸C2为0.3％-0.5％，灵芝酸G为0.25％-0.5％。该质量标准是本申请发明人对不同产地多批次的赤灵芝药材进行质量研究后并结合提取工艺和检测方法，综合评价得出的结果。当赤灵芝提取物对照品符合该标准时，赤灵芝提取物对照品中的各项主要成分能够体现赤灵芝药材有效成分的特征，并且用于液相色谱及薄层色谱检验时，其各组份的分离度能够满足定性定量测定的要求。

[0046] 所述勾兑为将不同批次提取或两种以上赤灵芝药材的赤灵芝提取物进行勾兑。赤灵芝提取物可以是一种赤灵芝药材或两种以上赤灵芝药材提取所得；较为优选的方案是，采用两种以上赤灵芝药材来制备，从而可以使制得的提取对照品的条带更丰富，不同成分的含量也更加均匀，从而得到更为优质的提取物对照品。

[0047] 本发明提供一种赤灵芝提取物对照品，其制备还进一步包括对其中的灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G的含量进行标定的步骤。

[0048] 赤灵芝提取物的制备优选按照包括如下步骤的方法进行：将赤灵芝粉碎，加入溶剂提取，对提取液进行过滤，收集滤液。优选的，所述提取采用加热回流提取、超声提取、微波提取、渗漉提取或闪式提取，更为优选的，所述提取采用加热回流提取或超声提取。优选的，还包括对滤液进行减压浓缩的步骤；进一步优选的，还包括向浓缩物中加入辅料并继续减压浓缩至干的步骤。进一步优选的，辅料为糊精、微粉硅胶、淀粉、羧甲基纤维素中的至少一种，更为优选的，辅料采用微粉硅胶，由于微粉硅胶不溶于水和有机溶剂，不会对对照品用于后续检测带来干扰；优选的，辅料和浓缩物的质量比为0.5∶1～3∶1，具体添加量根据浓缩物的质量进行调整，使最终的提取物对照品的质量达到标准即可。提取所用的溶剂优选为甲醇、乙醇中的至少一种，溶剂的浓度范围优选为70～100％，较为优选85-95％，最优选为95％乙醇和纯甲醇。

[0049] 作为一种优选方案，对于用来制备赤灵芝提取物对照品的赤灵芝原料药材进行筛选，优选采用经过筛选的赤灵芝作为原料药材。

[0050] 经菌种鉴定为赤灵芝的药材均可用来制备赤灵芝提取物对照品；但，作为一种优选方案，对用来制备赤灵芝提取物对照品的赤灵芝药材优选采用包括如下步骤的方法来筛选：

[0051] 建立赤灵芝标准图谱，将待选赤灵芝药材进行液相色谱分析并将所获得的的图谱与所述赤灵芝标准图谱进行对照，筛选出相似度大于90％的药材。

[0052] 进一步的，筛选步骤还可以包括，对相似度大于90％的药材进行菌种鉴定，筛选出确定为赤灵芝的药材。更进一步的，优选对筛选所得的药材进行含量分析，筛选出灵芝酸A质量含量大于0.02％、灵芝酸B质量含量大于0.01％、灵芝酸C2质量含量大于0.015％、灵芝酸G质量含量大于0.015％的药材。该质量标准是本申请发明人对不同产地多批次的赤灵芝药材进行质量研究后，综合评价得出的结果。当赤灵芝药材符合该标准时，用该赤灵芝药材所制备的提取物对照品更易符合赤灵芝提取物对照品的质量标准。

[0053] 作为一种具体实施方式，对于上文中赤灵芝标准图谱的建立可以按照如下步骤进行：将所收集的来自不同产地的灵芝药材进行薄层图谱鉴别，并与赤灵芝对照药材的薄层图谱进行对比，选出与赤灵芝对照药材的薄层图谱在相应位置上显相同颜色的荧光斑点的药材为优选药材；将优选药材通过液相色谱分析获得指纹图谱，并将所得指纹图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)进行指纹图谱分析并生成赤灵芝标准图谱。为了使赤灵芝标准图谱具有代表性，用于生成赤灵芝标准图谱的赤灵芝药材样本应能代表市场上赤灵芝类产品的质量，在下文的具体实施例中，具体是从50个灵芝样本中选取了20例赤灵芝样本用于生成赤灵芝标准图谱，但不表示更多或更少的样本生成的标准图谱就不具有代表性。

[0054] 作为优选的，为了让灵芝酸A、B、C2、G都得到较好分离，进行液相色谱分析时所采用的色谱条件优选包括：

[0055] 色谱柱优选反相色谱柱，更优选为C18 ODS反相色谱柱。

[0056] 优选的，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为三氟乙酸、甲酸、乙酸、磷酸中的至少一种与甲醇、乙腈中的至少一种的混合溶液，流动相B为三氟乙酸、甲酸、乙酸、磷酸中的至少一种的水溶液；更优选的，所述流动相A为0.05～0.15％(质量)三氟乙酸乙腈溶液，流动相B为0.05～0.15％(质量)三氟乙酸水溶液；

[0057] 进一步优选的，流动相的梯度洗脱程序为：以下百分比均为体积百分比，A+B＝100％，在0-35min，流动相A维持在20-30％，流动相B维持在70-80％；在35-90min，流动相A维持在60-70％，流动相B维持在30-40％；在90-120min，流动相A维持在100％，流动相B维持在0％。

[0058] 进一步优选的，薄层图谱鉴别按照如下参数进行：薄层板采用硅胶薄层板，展开剂为体积比12～17∶12～17∶0.5～1.5∶0.1的甲苯、乙酸乙酯、甲醇、甲酸，显色剂为质量分数10％-50％硫酸乙醇溶液。采用优选的薄层图谱鉴别条件，相比于中国药典的薄层图谱鉴别方法，可以出现更多条带，可以明显看出不同灵芝间的区别，从而更好的鉴别灵芝药材。

[0059] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明：

[0060] 实施例1赤灵芝标准图谱的建立

[0061] 1.1、实验概述：

[0062] 对收集的50种来自不同产地的灵芝药材(分别编号为1-50号)进行薄层图谱鉴别，筛选出其薄层色谱与赤灵芝对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点的灵芝药材，共计20种。对该20种赤灵芝用液相色谱法进行指纹图谱分析，将所得图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)生成赤灵芝标准图谱(见图7)

[0063] 1.2、50种灵芝药材薄层色谱鉴别

[0064] 1.2.1、50种灵芝药材的样品制备

[0065] 称取2g灵芝药材，加入30ml甲醇超声(150w，44khz)30min，过滤，滤渣加入30ml甲醇超声30min，过滤，滤纸用少量甲醇潤洗，水浴蒸干滤液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。即得。

[0066] 赤灵芝对照药材购自中检所。

[0067] 1.2.2、薄层鉴别色谱条件：

[0068]

[0069] 1.2.3、实验结果：

[0070] 对50灵芝药材进行薄层色谱鉴别，薄层图谱见图1至图5。由薄层图谱可以得出1-30号样本的薄层图谱与赤灵芝对照药材薄层图谱不一致，31-50号样本的薄层图谱与赤灵芝对照药材薄层图谱一致。因此，选取31-50号样本作为生成赤灵芝标准图谱的样本。

[0071] 图1-图5中，标号所代表的样品分别为：1.河北黑芝、2.吉林紫芝1、3.吉林紫芝2、4.吉林紫芝3、5.大连灵芝1、6.大连灵芝2、7.南昆山黑芝1、8.南昆山黑芝2、9.南昆山黑芝
3、10.云南野生紫芝1、11.云南野生紫芝2、12.福建黑芝、13.四川黑芝、14.江西黑芝1、15.江西黑芝2、16.湖北野生紫芝、17.安徽野生紫芝、18.海南树舌灵芝、19.云南蜂窝灵芝20.云南血红栓菌芝、21.美国大片、22.云南黑芝1、23.西藏黑芝、24.湖北黑芝1、25.湖北黑芝
2、26.湖北黑芝3、27.云南黑芝2、28.云南野生黑芝1、29.云南野生黑芝2、30.山东川芝、31.吉林赤灵芝1、32.吉林赤灵芝2、33.浙江赤灵芝1、34.浙江赤灵芝2、35.山西赤灵芝1、36.山西赤灵芝2、37.福建赤灵芝、38.云南赤灵芝1、39.云南赤灵芝2、40.海南赤灵芝、41.吉林赤灵芝、42.山东赤灵芝、43.浙江丽水赤灵芝、44.安徽赤灵芝1、45.安徽赤灵芝2、46.吉林龙井赤灵芝1、47.吉林龙井赤灵芝2、48.山东赤灵芝1、49.山东赤灵芝2、50.山东赤灵芝3。

[0072] 1.3、生成赤灵芝标准图谱

[0073] 1.3.1、20种赤灵芝药材的样品制备

[0074] 称取2g赤灵芝药材，加入30ml甲醇超声(150w，44khz)30min，过滤，滤渣加入30ml甲醇超声30min，过滤，滤纸用少量甲醇潤洗，水浴蒸干滤液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。样品过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0075] 1.3.2、液相色谱条件

[0076] 色谱柱：TSK gel ODS-80Tm(5μm 150*4.6mm)

[0077] 流动相：按下表比例，梯度洗脱

[0078]步骤 时间(min) 0.1％三氟乙酸乙腈(％) 0.1％三氟乙酸水(％)
1 0 26 74
2 35 26 74
3 90 65 35
4 120 100 0

[0079] 流速：1.2mL/min；柱温：25℃；检测波长：256nm进样量：10μl

[0080] 1.3.3、实验结果：

[0081] 将30-50号赤灵芝样本的液相色谱指纹图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)，分析结果如图6所示，生成的赤灵芝标准图谱如图7所示。

[0082] 实施例2用于赤灵芝提取物对照品制备的赤灵芝原料的优选

[0083] 2.1、实验概述

[0084] 用于赤灵芝提取物对照品制备的赤灵芝原料需满足以下质量标准：

[0085] (1)药材用液相色谱法分析其图谱与赤灵芝标准图谱相对照，相似度应大于90％(使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.1版)

[0086] (2)灵芝酸A含量为大于0.02％，灵芝酸B含量为大于0.01％，灵芝酸C2含量为大于0.015％，灵芝酸G含量为大于0.015％。

[0087] 根据上述质量标准，从6种赤灵芝样本中优选原料药材，方法如下：

[0088] 2.2、原料药材液相图谱与赤灵芝标准图谱相似度比较

[0089] 2.2.1、6种赤灵芝样品的制备

[0090] 称取2g赤灵芝药材，加入30ml甲醇超声(150w，44khz)30min，过滤，滤渣加入30ml甲醇超声30min，过滤，滤纸用少量甲醇潤洗，水浴蒸干滤液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。样品过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0091] 2.2.2、液相色谱条件

[0092] 色谱柱：TSK gel ODS-80Tm(5μm 150*4.6mm)

[0093] 流动相：按下表比例，梯度洗脱

[0094]

[0095] 流速：1.2mL/min；柱温：25℃；检测波长：256nm进样量：10μl

[0096] 2.2.3、实验结果：

[0097] 6种赤灵芝药材的液相色谱图谱与赤灵芝标准图谱相对照，相似度结果如下表1所示。1-2号样本相似度小于90％，因此不能作为赤灵芝提取物对照品的原料。3-6号样本相似度大于90％，经送至中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定，均确定为赤灵芝。

[0098] 表1

[0099]样品 相似度
赤灵芝1 86.9％
赤灵芝2 88.5％
赤灵芝3 92.5％
赤灵芝4 95.2％
赤灵芝5 91.2％
赤灵芝6 94.3％

[0100] 2.3、原料药材灵芝三萜含量测定

[0101] 2.3.1、化学试剂：

[0102] 灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G均购自上海源叶生物技术有限公司[0103] 2.3.2、实验方法：

[0104] 4种赤灵芝样品的制备和液相色谱方法同上。

[0105] 灵芝酸对照品实验样品的制备如下：分别称取灵芝酸A、B、C2、G对照品5mg，用甲醇溶解定容至5ml容量瓶中。过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0106] 2.3.3、实验结果：

[0107] 3-6号样品的灵芝三萜含量测定结果如下表2所示，从表2中数据得出：3号样本灵芝酸B含量小于标准，4号样本灵芝酸C2含量小于标准。5-6号样本灵芝酸含量符合标准，因此，选取5号和6号样本作为制备赤灵芝提取物对照品的原料药材。

[0108] 表2

[0109]

[0110] 实施例3赤灵芝提取物对照品制备

[0111] 3.1、实验概述

[0112] 赤灵芝提取物制备所用溶剂为甲醇，提取方式为加热回流。

[0113] 3.2、实验方法

[0114] 将实施例2中优选出的2种赤灵芝药材分别制备成赤灵芝提取物，制备方法如下：称取赤灵芝药材2kg粉碎，加入8倍量的甲醇16L，加热回流提取两次，每次1小时(液体沸腾开始计时)，滤过，收集滤液，在65℃下减压浓缩至5L，各加入辅料微粉硅胶120g，继续浓缩至干，得到赤灵芝提取物各200g，分别编号为1号赤灵芝提取物、2号赤灵芝提取物。

[0115] 称取1号赤灵芝提取物200g，2号赤灵芝提取物200g，混合均匀，加入甲醇4L，搅拌使充分溶解混匀，浓缩至干，得到勾兑后赤灵芝提取物。

[0116] 实施例4.赤灵芝提取物对照品制备

[0117] 4.1实验概述

[0118] 赤灵芝提取物制备所用溶剂为甲醇，提取方式为超声提取

[0119] 4.2实验方法

[0120] 将实施例2中优选出的2种赤灵芝药材分别制备成赤灵芝提取物，制备方法如下：称取赤灵芝药材2kg粉碎，加入8倍量的甲醇16L，超声提取两次，每次1小时，滤过，收集滤液，在65℃下减压浓缩至5L，各加入辅料微粉硅胶120g，继续浓缩至干，得到赤灵芝提取物各200g，分别编号为1号赤灵芝提取物、2号赤灵芝提取物。

[0121] 称取1号赤灵芝提取物200g、2号赤灵芝提取物200g，混合均匀，加入甲醇4L，搅拌使充分溶解混匀，浓缩至干，得到勾兑后赤灵芝提取物。

[0122] 实施例5.赤灵芝提取物对照品制备

[0123] 5.1实验概述

[0124] 赤灵芝提取物制备所用溶剂为95％乙醇，提取方式为加热回流

[0125] 5.2实验方法

[0126] 将实施例2中优选出的2种赤灵芝药材分别制备成赤灵芝提取物，制备方法如下：称取赤灵芝药材2kg粉碎，加入8倍量的95％乙醇16L，加热回流提取两次，每次1小时(液体沸腾开始计时)，滤过，收集滤液，在65℃下减压浓缩至5L，各加入辅料微粉120g硅胶，继续浓缩至干，得到赤灵芝提取物各200g，分别编号为1号赤灵芝提取物、2号赤灵芝提取物。

[0127] 称取1号赤灵芝提取物200g、2号赤灵芝提取物200g，混合均匀，加入95％乙醇4L，搅拌使充分溶解混匀，浓缩至干，得到勾兑后赤灵芝提取物。

[0128] 实施例6.赤灵芝提取物对照品制备

[0129] 6.1实验概述

[0130] 赤灵芝提取物制备所用溶剂为95％乙醇，提取方式为超声提取

[0131] 6.2实验方法

[0132] 将实施例2中优选出的2种赤灵芝药材分别制备成赤灵芝提取物，制备方法如下：称取赤灵芝药材2kg粉碎，加入8倍量的95％乙醇16L，超声提取两次，每次1小时，滤过，收集滤液，在65℃下减压浓缩至5L，各加入辅料微粉120g硅胶，继续浓缩至干，得到赤灵芝提取物各200g，分别编号为1号赤灵芝提取物、2号赤灵芝提取物。

[0133] 称取1号赤灵芝提取物200g、2号赤灵芝提取物200g，混合均匀，加入95％乙醇4L，搅拌使充分溶解混匀，浓缩至干，得到勾兑后赤灵芝提取物。

[0134] 实施例7标定赤灵芝提取物对照品

[0135] 7.1.实验概述

[0136] 以灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G为对照品，用液相色谱法标定赤灵芝提取物对照品中灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G的含量。

[0137] 7.2.试剂

[0138] 灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G均购自上海源叶生物技术有限公司；

[0139] 实施例3制备的赤灵芝提取物对照品。

[0140] 7.2.1.赤灵芝提取物对照品及灵芝酸对照品的样品制备

[0141] 称取0.2g赤灵芝提取物对照品，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。样品过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0142] 分别称取灵芝酸A、B、C2、G对照品5mg，用甲醇溶解定容至5ml容量瓶中。过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0143] 7.2.2.液相色谱条件

[0144] 色谱柱：TSK gel ODS-80Tm(5μm 150*4.6mm)

[0145] 流动相：按下表比例，梯度洗脱

[0146]

[0147] 流速：1.2mL/min；柱温：25℃；检测波长：256nm进样量：10μl

[0148] 7.2.3.实验结果：

[0149] 用灵芝酸化学对照品标定赤灵芝提取物对照品中的灵芝酸含量，含量数据如下表3所示。该方法中灵芝酸A、B、C2、G的分离度均大于0.9，理论塔板数均大于6000，RSD均小于
1％，因此该方法可以用于标定赤灵芝提取物对照品。用灵芝酸化学对照品标定赤灵芝提取物对照品含量，赤灵芝提取物对照品的灵芝酸A、B、C2、G含量为：灵芝酸A：0.4108％，灵芝酸B：0.2286％，灵芝酸C2：0.3402％，灵芝酸G：0.3168％。该赤灵芝提取物对照品符合赤灵芝提取物对照品的质量标准(灵芝酸A为0.3％-0.5％，灵芝酸B为0.15％-0.4％，灵芝酸C2为
0.3％-0.5％，灵芝酸G为0.25％-0.5％)。

[0150] 表3

[0151]

[0152]

[0153] 实施例8赤灵芝提取物对照品稳定性

[0154] 8.1.实验概述

[0155] 用加速稳定性实验对赤灵芝提取物对照品进行加速稳定性考察。

[0156] 8.2.加速稳定性实验方法

[0157] 将制备好的赤灵芝提取物对照品置于：温度：40℃，湿度：90％±5％条件下，放置0、1、2、3、6个月，在0、1、2、3、6个月取出赤灵芝提取物对照品，用液相色谱法测定赤灵芝提取物对照品中灵芝酸含量。

[0158] 8.3.试剂

[0159] 灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G均购自上海源叶生物技术有限公司，加速稳定性实验0-6个月样品

[0160] 8.3.1.赤灵芝提取物对照品的样品制备

[0161] 称取0.2g赤灵芝提取物对照品，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。样品过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0162] 分别称取灵芝酸A、B、C2、G对照品5mg，用甲醇溶解定容至5ml容量瓶中。过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0163] 8.3.2.液相色谱条件

[0164] 色谱柱：TSK gel ODS-80Tm(5μm 150*4.6mm)

[0165] 流动相：按下表比例，梯度洗脱

[0166]步骤 时间(min) 0.1％三氟乙酸乙腈(％) 0.1％三氟乙酸水(％)
1 0 26 74
2 35 26 74
3 90 65 35
4 120 100 0

[0167] 流速：1.2mL/min；柱温：25℃；检测波长：256nm进样量：10μl

[0168] 8.3.3.实验结果

[0169] 加速稳定性实验数据如下表4，加速稳定性0-6个月赤灵芝提取物对照品中灵芝酸A、B、c2、G的RSD值小于1％，重复性好。因此该赤灵芝提取物对照品的保质期暂定24个月。表4具体为实施例3制得的对照品的稳定性数据，实施例4-6的实验结果与实施例3基本相似，不再赘述。

[0170] 表4：赤灵芝提取物对照品加速稳定性数据

[0171]

[0172] 实施例9赤灵芝提取物薄层鉴别不同品种灵芝

[0173] 9.1.实验概述

[0174] 用赤灵芝提取物对照品及薄层色谱方法鉴别灵芝品种，鉴别方法如下：

[0175] 9.2.实验样品的制备

[0176] 称取0.2g赤灵芝提取物对照品(实施例3产品)，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。样品过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0177] 称取2g赤灵芝药材及灵芝孢子粉，加入30ml甲醇超声(150w，44khz)30min，过滤，滤渣加入30ml甲醇超声30min，过滤，滤纸用少量甲醇潤洗，水浴蒸干滤液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。即得。

[0178] 9.2.1.薄层色谱条件：

[0179]

[0180] 9.2.2.实验结果

[0181] 薄层色谱检测的图谱见图8，从图中可以看出2号和3号样本其薄层色谱与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，图谱谱型一致，因此确认样本2号和3号是赤灵芝。从图中可以看出4号至7号样本其薄层色谱与对照药材色谱相应的位置上，没有显相同颜色的荧光斑点，图谱谱型不一致，因此确认样本4号至7号不是赤灵芝药材。因此，使用赤灵芝提取物对照品为对照物在薄层色谱检测上可以区分不同品种灵芝。

[0182] 图8中各标号分别表示：1.赤灵芝提取物对照品、2.赤灵芝1、3.赤灵芝2、4.扛四灵芝、5.树舌灵芝、6.紫芝、7.灵芝孢子粉。

[0183] 实施例10用赤灵芝提取物对照品和灵芝酸化学对照品标定同一赤灵芝药材灵芝酸含量

[0184] 10.1.实验概述

[0185] 用赤灵芝提取物对照品和灵芝酸化学对照品及用液相色谱方法标定同一种赤灵芝药材，其方法如下：

[0186] 10.2.试剂

[0187] 赤灵芝提取物对照品(实施例3产品)，赤灵芝药材，灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G均购自上海源叶生物技术有限公司

[0188] 10.2.1.样品制备

[0189] 称取2g赤灵芝药材，加入30ml甲醇超声(150w，44khz)30min，过滤，滤渣加入30ml甲醇超声30min，过滤，滤纸用少量甲醇潤洗，水浴蒸干滤液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。样品过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0190] 称取0.2g赤灵芝提取物对照品用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。样品过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0191] 分别称取灵芝酸A、B、C2、G对照品5mg，用甲醇溶解定容至5ml容量瓶中。过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0192] 10.2.2.液相色谱条件

[0193] 色谱柱：TSK gel ODS-80Tm(5μm 150*4.6mm)

[0194] 流动相：按下表比例，梯度洗脱

[0195]步骤 时间(min) 0.1％三氟乙酸乙腈(％) 0.1％三氟乙酸水(％)
1 0 26 74
2 35 26 74
3 90 65 35
4 120 100 0

[0196] 流速：1.2mL/min；柱温：25℃；检测波长：256nm进样量：10μl

[0197] 10.2.3.实验结果

[0198] 用赤灵芝提取物对照品标定赤灵芝药材中灵芝酸的含量与用灵芝酸化学对照品标定赤灵芝药材中灵芝酸的含量的数据见表5。从表5数据可以看出：用两种标定方法标定赤灵芝药材中的灵芝酸含量其含量相差均小于2％，RSD值均小于1％，分离度均大于0.9，理论塔板数均大于6000。因此可以用赤灵芝提取物对照品替代灵芝酸化学对照品作为对照物检测赤灵芝中的灵芝酸含量。

[0199] 表5：两种不同标定方式标定灵芝酸含量的数据

[0200]

[0201] 实施例11用赤灵芝提取物对照品测定赤灵芝药材灵芝酸含量

[0202] 11.1.实验概述

[0203] 用赤灵芝提取物对照品及液相色谱法测定赤灵芝药材中灵芝酸含量，方法如下：

[0204] 11.2.样品制备

[0205] 称取2g药材，加入30ml甲醇超声(150w，44khz)30min，过滤，滤渣加入30ml甲醇超声30min，过滤，滤纸用少量甲醇潤洗，水浴蒸干滤液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。样品过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0206] 称取0.2g赤灵芝提取物对照品(实施例3产品)，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。样品过0.22μm微孔滤膜，即得。

[0207] 11.2.1.液相色谱条件

[0208] 色谱柱：TSK gel ODS-80Tm(5μm 150*4.6mm)

[0209] 流动相：按下表比例，梯度洗脱

[0210]

[0211]

[0212] 流速：1.2mL/min；柱温：25℃；检测波长：256nm进样量：10μl

[0213] 11.2.2.实验结果

[0214] 用赤灵芝提取物对照品测定赤灵芝药材中灵芝酸含量的数据见表6及图9，图9中横坐标为药材编号，纵坐标为灵芝酸含量。从表6可以看出：测定的13个样本中赤灵芝药材中编号为3号和11号的样本灵芝酸含量远高于其他样本，含量超过4mg/g，编号为1、2、4、5-8号的样本灵芝酸含量相对较低，不超过1mg/g，其他样本的灵芝酸含量在1mg/g-3mg/g之间。因此可以明显看出：用赤灵芝提取物可以辨别出赤灵芝药材质量的好坏。

[0215] 表6：用赤灵芝提取物对照品测定赤灵芝药材中灵芝酸含量

[0216]

[0217]

[0218] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。