脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖载药纳米胶束及制备方法

摘要

本发明涉及一种脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖材料的合成及其载药纳米胶束的制备，属于生物材料与缓释技术领域。首先用高碘酸盐将魔芋葡甘聚糖（KGM）氧化开环得到二醛基魔芋葡甘聚糖（DAK），再与脂肪胺反应，得到两亲性的脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖（KGM‑g‑AH）。该接枝物可通过乙醇注入法自组装形成纳米胶束，该胶束具有pH敏感性，在正常组织和血液的中性环境中较稳定，而在肿瘤组织的弱酸性环境中，其分子上的亚胺键可逆断裂，并快速释放出所包载的药物，使其在肿瘤细胞富集，从而实现药物对肿瘤组织的定位释放。本发明制备的脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖载药纳米胶束结构稳定，合成简单，载药量高，生物相容性好，细胞毒性低，具有pH敏感性，在药物控释领域具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖载药纳米胶束的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

（1）二醛基魔芋葡甘聚糖的制备：称取魔芋葡甘聚糖分散于双蒸水中，在室温机械搅拌下、溶胀8-24 h，制得魔芋葡甘聚糖分散液；然后将高碘酸钠溶解于双蒸水中，并滴加到魔芋葡甘聚糖分散液中，室温避光搅拌反应12-48 h，40-60℃减压浓缩，过滤，最后转移到透析袋中透析除去盐类及小分子产物，冷冻干燥既得到白色的二醛基魔芋葡甘聚糖;所述的魔芋葡甘聚糖与高碘酸钠的质量比为1:0.4-1:1.5；

（2）脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖的合成：将步骤（1）中制备的二醛基魔芋葡甘聚糖溶解于水中；将脂肪胺溶解于乙醇或者环己烷中，并加到二醛基魔芋葡甘聚糖的水溶液中，在乙醇或环己烷的沸点处回流6-18 h，取下反应瓶，30-40℃减压除去乙醇或环己烷，用与水互不相溶的有机试剂洗三遍，取有机相减压浓缩，然后透析除去未反应的脂肪胺，冷冻干燥即得到脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖；

所述的二醛基魔芋葡甘聚糖与脂肪胺的投料比为：二醛基魔芋葡甘聚糖的醛基与脂肪胺的胺基的物质的量的比为1:1；

所述的脂肪胺为直链脂肪胺，进一步所述的直链脂肪胺为可溶解于乙醇或甲醇中的短链胺，或可溶解于环己烷中的长链胺，其中短链胺为辛胺、十二胺，长链胺为十八胺；

（3）脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖载药胶束的制备：疏水药物的乙醇溶液与脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖的乙醇或氯仿溶液混合均匀，疏水药物与脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖的质量比为

1:20～2:5，在磁力搅拌的条件下将上述混合液注入双蒸水中，室温搅拌30min，将其转入透析袋中透析除去乙醇和/或氯仿，取透析內液200-400 W超声3-10 min，过0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜即得到载药胶束溶液。

2.如权利要求1所述的一种脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖载药纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述的疏水药物为姜黄素。

说明书

脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖载药纳米胶束及制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种具有pH敏感性的脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖材料的合成及其载药纳米胶束的制备，属于生物材料与缓释技术领域。

背景技术

[0002] 随着经济的发展和生态环境的日益破坏，癌症的病发率也越来越高，威胁着人们的健康。化学治疗是目前最广泛使用的癌症的治疗方法，对于癌细胞的杀灭和抑制非常快速有效，并具有整体性、综合性治疗的优点，但是也存在着许多问题，如药物水溶性差，给药后在体内选择性差，具有多重耐药性，循环时间短，生物利用率低等（Expert opinion on drug delivery,2012,9:687-700）。为了解决这些问题，微米和纳米尺度的药物传递系统如囊泡，胶束和微胶囊等在近年来被广泛的研究并迅速发展，以提高药效并降低毒性。尤其是纳米级的胶束，具有着诸多优势而被广泛的关注，如可以直接注射而没有堵塞血管的风险和较低的血液清除率可延长药物循环的时间，增强渗透和保留作用（EPR）效应，使之在肿瘤组织滞留并富集，将药物尽量限制在肿瘤部位，提高了药物对肿瘤的杀伤力的同时降低了药物对正常组织的损害（Nanomedicine : nanotechnology, biology and medicine, 2010,6:714-729;European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics, 2007, 
65:259-269）。但是人们对于理想载体系统地期望远不会停留于此。

[0003] 环境响应型递药系统如pH，酶，温度等响应型的载体的研究为化学药物的给药开拓了新思路，可使整个载体系统在化疗的过程中成为了一个主动的参与者。肿瘤部位以无氧糖酵解提供能量，随着乳酸的逐渐增加，使肿瘤部位细胞外液pH至值在5-6之间，相比于正常的组织细胞外液（pH=7.4）偏酸性。因此，pH是常用的用来设计制备抗肿瘤的环境响应性载体的因子之一。

[0004] 天然多糖具有高度安全，无毒，生物可降解性和生物相容性好等特点，且来源广泛，加工成本低，是一类具有较好应用前景的药物载体材料。天然多糖的分子链上含有大量的活性基团，例如羟基，羰基，胺基等有利于其化学和生物修饰以赋予其两亲性和pH敏感性（Carbohydrte polymers, 2015, 123:53-66）。由于席夫碱含有的C=N双键在中性及碱性条件下稳定，而在酸性条件下选择性断裂，近年来被广泛的应用于pH敏感的药物载体中（Polymer chemistry, 2012, 3:3045-3055 ）。例如以C=N双键连接的半乳糖化的海藻酸钠-姜黄素pH敏感胶束（International journal of biological macromolecules,2016,86:1-9），氧化KGM与壳聚糖以C=N双键相连的凝胶载体（Reactive & functional polymers, 200666.10:1055-1061），氧化KGM与氨基水杨酸以己二肼为桥梁形成的C=N双键的pH敏感载体（Polymer bulletin, 2014, 15.6:183-193）等。

[0005] 魔芋葡甘聚糖（KGM）是一种从魔芋块茎中提取出来的一种亲水的天然可降解的中性多糖，具有无毒，生物可降解，生物相容性好等特点被广泛的应用于药物载体中（Carbohydrate polymers, 2005, 60:27-31）。例如，治疗慢性胃病的在胃部可以溶解的KGM胶囊（专利CN 1275619），结肠定位的药物载体（Polymer, 2005, 46.16:6274-6281），KGM-聚甲基丙烯酸凝胶载体（Carbohydrate polymers, 2013,97.2:565-70）等。然而KGM的强亲水性限制了其在药物载体中的应用，而疏水改性的KGM可显著提高其对亲脂性药物的包载能力，从而增加其应用范围。例如含胆固醇的羧甲基魔芋葡甘聚糖接枝物及其胶束的制备（专利CN 102399301），氧化KGM制备的光响应的微乳球载体（Biomacromoecules, 2014, 15.6:2166-71），羧甲基魔芋葡甘聚糖纳米载药微球的制备（专利CN 105055372A）。
改性KGM作为药物载体，可以控制药物释放，延长药物疗效，降低药物毒副作用，提高疏水药物对细胞膜的通透性和药物的稳定性及改变给药途径。目前，以KGM为基材制备的含有C=N双键的pH敏感胶束的报道较少。

发明内容

[0006] 本发明的目的提供了一种以二醛基魔芋葡甘聚糖（DAK）与脂肪胺反应得到的含有C=N双键的疏水接枝的魔芋葡甘聚糖（KGM-g-AH），进一步制成具有pH敏感性的载姜黄素纳米胶束的制备与检测方法。

[0007] 本发明通过两步合成，对亲水性的KGM进行疏水改性，使其具有两亲性，并能自组装形成以疏水脂肪链为核、亲水KGM为壳的纳米级胶束系统，可显著提高其对疏水性药物的包载与增溶能力。另外，该胶束系统在中性环境中稳定，而在弱酸性的肿瘤微环境中可选择性破裂，并快速释放出所包载的药物，使其在肿瘤细胞富集，从而实现药物的控制释放，并有效降低药物的毒副作用，提高药效。

[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现，一种脂肪胺接枝魔芋葡甘聚糖载药纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：

[0009] （1）二醛基魔芋葡甘聚糖（DAK）的制备：称取KGM分散于双蒸水中，在室温机械搅拌的条件下溶胀8-24 h，然后将高碘酸钠溶解于双蒸水中，并滴加到KGM分散液中，KGM与高碘酸钠的质量比为1:0.4-1:1.5（KGM与高碘酸钠的质量比为1:0.4时DAK的氧化度为25%，重均分子量为20000-400000 g/molKGM，KGM与高碘酸钠的质量比为1:0.8时DAK的氧化度为45%，重均分子量为8000-10000 g/mol），室温避光搅拌反应12-48 h，40-60 ℃减压浓缩，过滤，并转移到透析袋中透析除去盐类及小分子产物，冷冻干燥既得到白色的DAK。

[0010] （2）脂肪胺接枝的魔芋葡甘聚糖的制备（KGM-g-AH）：将步骤（1）中制备的DAK溶解于少量的水中，将脂肪胺（脂肪胺的链长越短，KGM-g-AH制备的胶束粒径越小，越稳定）溶解于乙醇或环己烷中，并加到DAK溶液中，在乙醇或环己烷的沸点处回流6-18 h，取下反应瓶，30-40 ℃减压除去乙醇或环己烷，用与水互不相溶的有机试剂（乙酸乙酯或氯仿）洗三遍，取有机相减压浓缩，然后透析除去未反应的胺，冷冻干燥既得到褐色的KGM-g-AH样品；

[0011] 所述的二醛基魔芋葡甘聚糖与脂肪胺的投料比为：二醛基魔芋葡甘聚糖的醛基与脂肪胺的胺基的物质的量的比为1:1；

[0012] 所述的脂肪胺为直链脂肪胺，进一步优选为可溶解于乙醇或甲醇中的短链胺、可溶解于环己烷中的长链胺；

[0013] 所述的短链胺优选为辛胺、十二胺，长链胺优选为十八胺。

[0014] （3）脂肪胺接枝的魔芋葡甘聚糖胶束/载药胶束的制备：

[0015] ①乙醇注入法：将KGM-g-AH溶解于乙醇中，在磁力搅拌的条件注入双蒸水中，室温搅拌一定时间，转入透析袋中在双蒸水中透析除去乙醇，每4 h换一次水，取透析內液200 -400 W超声3-10 min，过0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜即得到胶束溶液。

[0016] ②透析法：量取一定量的溶解于乙醇或氯仿的KGM-g-AH，转入一定截留分子量的透析袋中，室温透析两天，取透析内液200 -400 W超声3-10 min，过0.22 μm和0.45 μm微孔滤膜即得到胶束溶液。

[0017] ③载药胶束的制备：将姜黄素乙醇溶液与KGM-g-AH乙醇或氯仿溶液混合均匀，姜黄素与KGM-g-AH的质量比为1:20～2:5，在磁力搅拌的条件下注入10 mL的双蒸水中，室温搅拌30 min，转入透析袋中在双蒸水中透析2天，每4 h换一次水，取透析內液200 W超声3-10 min，过0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜即得到载药胶束。

[0018] （4）体外释药实验: 将载药胶束溶液转移至透析袋中，然后将其浸入含有0.5-2.0%（w/v）的吐温80 pH=5.0和pH=7.4的磷酸缓冲液中，并将其置于37 ℃条件下一段时间,在设定好的时间下取出一定体积的缓冲液在424 nm处测定其吸光值，同时补充相同体积相同温度的新鲜的缓冲液。

[0019] （5）细胞毒性实验:将冷冻干燥的KGM-g-AH8胶束与20 μL溶解在PBS缓冲液的MTT（5 μg/mL）和培养好的HepG2细胞培养4 h，KGM-g-AH8胶束的浓度为2-125 μg/mL，然后将细胞用200 μL的新鲜的细胞培养基冲洗干净，除去MTT，然后用200 μL DMSO溶解甲臜，在570 nm处测定其光密度。

[0020] （6）细胞吞噬实验: HepG2细胞分散在含有10%胎牛血清和1%抗生素的细胞培养液中，然后以1×105细胞/孔密度培养在6孔板中。然后在37℃，5% CO2的条件下培养24 h，然后将其培养介质冲洗干净，分别用含有10%胎牛血清、1%抗生素、FITC标记的KGM-g-AH8胶束1 mL细胞培养基和10%胎牛血清、1%抗生素、FITC标记的KGM-g-AH8载药胶束1 mL细胞培养基培养4 h，然后除去培养介质，然后用50 μL的Hoechst 33342染细胞核15 min，移走培养介质，用1 mL PBS缓冲溶液冲洗3次，然后将细胞放入激光共聚焦下观察。

[0021] 针对现有技术，本发明的有益效果如下：

[0022] 1、本发明以亲水的魔芋葡甘聚糖为基材料，对其进行疏水改性，使其具有两亲性，改性后的脂肪胺接枝的魔芋葡甘聚糖的制备（KGM-g-AH）能自组装形成以疏水脂肪链为核、亲水KGM为壳的纳米级胶束系统，可显著提高魔芋葡甘聚糖对疏水性药物的包载与增溶能力；另外，该胶束还含有C=N双键，可选择性在酸性环境中断裂，具有pH敏感性，当载药胶束到达癌变组织时，弱酸性的肿瘤环境使载体胶束外壳降解并快速清除，从而释放出所包载的药物，使之富集于肿瘤组织，实现被动靶向。

[0023] 2、纳米粒子的尺寸可以通过调节脂肪链的长度来调节，脂肪胺的链长越短，KGM-g-AH制备的胶束粒径越小，越稳定（图3）。

[0024] 3、本发明制备的纳米胶束粒子，可用于医药行业，具有较好的生物相容性和生物可降解性，为魔芋葡甘聚糖作为药物载体在医药行业的应用提供了新思路。

[0025] 4、本发明制备的表面糖类修饰的聚合物可自组装形成纳米级的球形胶束粒子，具有较好的分散性和稳定性。

附图说明

[0026] 图1 脂肪胺接枝KGM的红外光谱图。图中的a、b、c、d、e分别指KGM，DAK，辛胺接枝的KGM，十二胺接枝的KGM和十八胺接枝的KGM，R=-(CH2)nCH3。

[0027] 图2 脂肪胺接枝KGM的核磁图谱。图中的a、b、c、d分别指DAK，辛胺接枝的KGM，十二胺接枝的KGM和十八胺接枝的KGM。

[0028] 图3 脂肪胺接枝KGM的纳米胶束的透射电镜图。图中的a、b分别指乙醇注入法制备的辛胺接枝的KGM未包载姜黄素和包载姜黄素的胶束的形貌，c指透析法制备的辛胺接枝的KGM胶束的形貌，d、e分别指乙醇注入法制备的十二胺和十八胺接枝的KGM胶束的形貌。

[0029] 图4 脂肪胺接枝KGM的纳米胶束的控制释放图。图中的a、b分别指辛胺接枝KGM包载姜黄素后在pH=5.0 和pH=7.4的缓释曲线。

[0030] 图5 辛胺接枝KGM的纳米胶束的细胞毒性图。

[0031] 图6 辛胺接枝KGM的纳米胶束的细胞摄入图。

具体实施方式

[0032] 下面结合实施例及附图说明作出进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

[0033] 实施例1：二醛基魔芋葡甘聚糖（DAK）的制备

[0034] 称取3.00 g的KGM，在机械搅拌的条件下分散于500 mL双蒸水中，然后室温下溶胀12 h，制得KGM分散液；称取2.40 g高碘酸钠溶解于100 mL双蒸水中，滴加于KGM分散液中，避光室温条件下反应24 h，取下反应瓶，在55 ℃条件下减压浓缩至300 mL左右，将其转移至3500截留分子量的透析袋中，在双蒸中透析7天，将透析内液冷冻干燥既得白色的二醛基魔芋葡甘聚糖（DAK）。

[0035] 如图1的红外图谱b所示，在3429 cm-1处有一个-OH伸缩振动峰，在2938 cm-1处有一个C-H伸缩振动峰，在1733 cm-1处有一个羰基伸缩振动峰，说明KGM经高碘酸钠氧化之后产生了C=O。如图2的核磁图谱所示，从图2a中可以看出在9.20-9.28 ppm的峰为DAK上面的醛基的质子峰，3.81-4.97 ppm为糖环上的端基质子峰。

[0036] 实施例2：辛胺接枝KGM的制备（KGM-g-AH8）

[0037] 称取0.3 g的DAK于30 mL的双蒸水中，50 ℃条件下溶解10 min；量取辛胺0.19 mL溶解于100 mL乙醇中，将辛胺的乙醇溶液与DAK水溶液混合，在有乙醇的沸点处回流8 h，取下反应瓶，30 ℃减压除去乙醇，用乙酸乙酯或氯仿洗三次，取有机相，在30 ℃左右减压除去有机试剂，最后，用2 mL的乙醇溶解，转入透析袋中，在双蒸水中透析2天，每4 h换一次水，取出透析内液，冷冻干燥既得到褐色的接枝的魔芋葡甘聚糖KGM-g-AH8。

[0038] 如图1c的红外图谱所示，在3317 cm-1处有一个-OH伸缩振动峰，在2969 cm-1和2924 cm-1处有一个甲基和亚甲基的C-H伸缩振动峰，在1665cm-1处有一个尖锐的C=N峰，表明DAK的C=O和辛胺的胺基发生了反应生成了KGM-g-AH8。

[0039] 如图2b的核磁图谱所示，在0.87 ppm处有一个甲基的质子峰，在1.2-1.99 ppm之间有亚甲基的质子峰，3.28 ppm-3.90 ppm之间的峰为DAK糖环上的端基质子峰，表明辛胺的胺基与DAK的醛基发生了反应。

[0040] 实施例3：十二胺接枝KGM的制备（KGM-g-AH12）

[0041] KGM-g-AH12 的制备过程：称取0.3g的DAK于30 mL的双蒸水中，50 ℃条件下溶解10 min；称取0.22 g十二胺溶解于100 mL乙醇中，将十二胺的乙醇溶液与DAK水溶液混合，在有乙醇的沸点处回流10 h，取下反应瓶，30 ℃减压除去乙醇，用乙酸乙酯洗三次，取有机相，在30 ℃左右减压除去有机试剂，最后，用2 mL的乙醇溶解，转入透析袋中，在双蒸水中透析2天，每4 h换一次水，取出透析内液，冷冻干燥既得到褐色的接枝的魔芋葡甘聚糖KGM-g-A H12。

[0042] 如图1d的红外图谱所示，在3356 cm-1处有一个-OH伸缩振动峰，在2973 cm-1和2925 cm-1处有一个甲基和亚甲基的C-H伸缩振动峰，1656 cm-1处有一个尖锐的C=N峰，表明DAK的C=O和十二胺的胺基发生了反应生成了KGM-g-A H12。如图2c的核磁图谱所示，在1.2-
1.99 ppm之间有亚甲基的质子峰，而在0-0.9 ppm之间有甲基的质子峰，3.21 ppm-3.71 ppm之间的峰为DAK糖环上的端基质子峰，表明十二胺的胺基与DAK的醛基发生了反应。

[0043] 实施例4：十八胺接枝KGM的制备（KGM-g-AH18）

[0044] KGM-g-AH18 的制备过程： 称取0.3 g的DAK于30 mL的双蒸水中，50 ℃条件下溶解10 min；称取0.32 g十八胺溶解于100 mL环己烷中，将十八胺的环己烷溶液与DAK水溶液混合，在有环己烷的沸点处回流12 h，取下反应瓶，将反应液转入分液漏斗中静置30 min，取有机相，30 ℃减压除去环己烷，用氯仿洗三次，取有机相， 30 ℃减压除去有机试剂，最后，用2 mL的乙醇与乙醚（v/v=1:1）的混合溶剂溶解，转入透析袋中，在双蒸水中透析2天，每4 h换一次水，取出透析内液，冷冻干燥既得到褐色的接枝的魔芋葡甘聚糖KGM-g-A H18。

[0045] 如图1e的红外图谱所示，在在3412 cm-1处有一个-OH伸缩振动峰，在2920 cm-1和2852 cm-1处有一个甲基和亚甲基的C-H伸缩振动峰，1661 cm-1处有一个尖锐的C=N峰，表明DAK的C=O和十八胺的胺基发生了反应生成了KGM-g-A H18。如图2d的核磁图谱所示，在1.23-
1.69 ppm之间有亚甲基的质子峰，而在0.03-0.86 ppm之间有甲基的质子峰，3.2 ppm-4.28 ppm之间的峰为DAK糖环上的端基质子峰，表明十二胺的胺基与DAK的醛基发生了反应。

[0046] 实施例5：KGM-g-AH8胶束的制备

[0047] （1）乙醇注入法：量取0.5 mL 10mg/mL的KGM-g-AH8乙醇溶液，在磁力搅拌的条件注入10 mL的双蒸水中，室温搅拌30 min，转入透析袋中在双蒸水中透析2天，每4 h换一次水，取透析內液200 W超声5 min，过0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜即得到胶束溶液。

[0048] 图3a、b为KGM-g-AH8的乙醇注入法制备的纳米胶束的透射电镜图。从图中可以看出胶束均呈球形，而且均匀分散。

[0049] （2）透析法：量取10 mL 1mg/mL KGM-g-AH8的乙醇溶液于截留分子量为1000的透析袋中，室温透析2天，每4 h换一次水，取透析内液200 W超声5 min，过0.22 μm和0.45 μm微孔滤膜即得到胶束溶液。

[0050] （3）载姜黄素KGM-g-AH8胶束的制备：将1 mL 2 mg/mL的姜黄素乙醇溶液与0.5 mL 10 mg/mL的KGM-g-AH8乙醇溶液混合均匀，在磁力搅拌的条件下注入10 mL的双蒸水中，室温搅拌30 min，转入透析袋中在双蒸水中透析2天，每4 h换一次水，取透析內液200 W超声5 min，过0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜即得到载药胶束。

[0051] 实施例6：KGM-g-AH8载药胶束的控制释放实验

[0052] 将5 mL载药胶束转移至透析袋中，然后将其浸入25 mL的含有0.5% （w/v）的吐温80 pH=5.0和pH=7.4的磷酸缓冲液中，并将其置于37 ℃条件下48 h,在设定好的时间下取出3 mL缓冲液在424 nm处测定其吸光值，同时补充3 mL相同温度的新鲜的缓冲液。

[0053] 图4为KGM-g-AH8纳米胶束的控制释放图。图中的实线和虚线分别指辛胺接枝的KGM包载姜黄素后在pH=5.0和pH=7.4的缓释曲线。从图中可以看出，在pH=5.0的时候药物释放的要快，且在24 h之前释放的要快，在24 h之后趋于平缓，在48 h基本上释放完毕，说明KGM-g-AH胶束具有pH敏感性。

[0054] 实施例7：KGM-g-AH8胶束的细胞毒性实验

[0055] 将冷冻干燥的KGM-g-AH8胶束与20 μL溶解在PBS缓冲液的MTT（5μg/mL）和培养好的HepG2细胞培养4 h，KGM-g-AH8胶束的浓度为2-125 μg/mL，然后将细胞用200 μL的新鲜的细胞培养基冲洗干净，除去MTT，然后用200 μL DMSO溶解甲臜，在570 nm处测定其光密度。

[0056] 如图5所示可以看出KGM-g-AH8对细胞毒性较低，在125 μg的时候，细胞的存活率还有75%之多。

[0057] 实施例8：KGM-g-AH8载药胶束的细胞摄入实验

[0058] HepG2细胞分散在含有10%胎牛血清和1%抗生素的细胞培养液中，然后以1×105细胞/孔密度培养在6孔板中。然后在37℃，5% CO2的条件下培养24 h，然后将其培养介质冲洗干净，分别用含有10%胎牛血清、1%抗生素、FITC标记的KGM-g-AH8胶束1 mL细胞培养基和10%胎牛血清、1%抗生素、FITC标记的KGM-g-AH8载药胶束1 mL细胞培养基培养4 h，然后出去培养介质，然后用50 μL的Hoechst 33342染细胞核15 min，移走培养介质，用1 mL PBS缓冲溶液冲洗3次，然后将细胞放入激光共聚焦下观察。

[0059] 如图6 所示b、e为Hoechst 33342标记的蓝色的细胞核的图片， a、c中细胞核周围部分是用来标记KGM-g-AH8的FITC发出的绿色荧光，从图中可以看出在4 h的时候，细胞内有很强的荧光，说明载体进入了细胞，d、f中细胞核周围的部分是KGM-g-AH8载体包载的姜黄素发出的绿色荧光，从图中可以看出在4 h的时候，细胞内有很强的荧光，说明KGM-g-AH8载体将姜黄素成功的载进了细胞。

[0060] 实施例9：KGM-g-AH12胶束的制备

[0061] （1）乙醇注入法：量取0.5mL 10 mg/mL（浓度可配制的更高）的KGM-g-AH12乙醇溶液，在磁力搅拌的条件注入10 mL的双蒸水中，室温搅拌30 min，转入透析袋中在双蒸水中透析2天，每4 h换一次水，取透析內液400 W超声3 min，过0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜即得到胶束溶液。

[0062] （2）透析法：量取10 mL 1mg/mL KGM-g-AH12的乙醇溶液于截留分子量为3500的透析袋中，室温透析两天，每4 h换一次水，取透析内液200 W超声3 min，过0.22 μm和0.45 μm微孔滤膜即得到胶束溶液。

[0063] （3）载姜黄素KGM-g-AH12胶束的制备：将0.5 mL 2 mg/mL的姜黄素乙醇溶液与0.5 mL 10 mg/mL的KGM-g-AH12乙醇溶液混合均匀，在磁力搅拌的条件下注入10 mL的双蒸水中，室温搅拌30 min，转入透析袋中在双蒸水中透析2天，每4 h换一次水，取透析內液400 W超声3 min，过0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜即得到载药胶束。

[0064] 图1d为透析法制备的KGM-g-AH12胶束的透射电镜图，从图中可以看出，胶束呈圆形且分散均匀。

[0065] 实施例10：KGM-g-AH18胶束的制备

[0066] （1）乙醇注入法：量取0.5mL 10 mg/mL（浓度可配制的更高）的KGM-g-AH18乙醇乙醚溶液，在磁力搅拌的条件注入10 mL的双蒸水中，室温搅拌30 min，转入透析袋中在双蒸水中透析2天，每2 h换一次水，取透析內液200 W超声10 min，过0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜即得到胶束溶液。

[0067] （2）透析法：量取5 mL 2 mg/mL KGM-g-AH18的氯仿溶液于截留分子量为3500的透析袋中，室温透析两天，每2 h换一次水，取透析内液200 W超声10 min，过0.22 μm和0.45 μm微孔滤膜即得到胶束溶液。

[0068] （3）载姜黄素KGM-g-AH18胶束的制备：将0.5 mL 2 mg/mL的姜黄素乙醇溶液与1 mL 20 mg/mL的KGM-g-AH18氯仿溶液混合均匀，在磁力搅拌的条件下注入10 mL的双蒸水中，室温搅拌30 min，转入透析袋中在双蒸水中透析2天，每4 h换一次水，取透析內液200 W超声
10 min，过0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜即得到载药胶束。

[0069] 图1e为透析法制备的KGM-g-AH18胶束的透射电镜图，从图中可以看出，胶束呈圆形且分散均匀。